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方法文章

研究鞭毛驱动的运动性 大肠杆菌 通过依次应用三种成熟技术

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DOI：

10.3791/61364

⸱

2020年5月10日

 , 
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin

本文内容

摘要

许多细菌利用鞭毛驱动的运动能力来在环境中移动，并单独或集体定植于有利的环境。本文展示了三种成熟方法的应用，这些方法利用运动性作为筛选工具，以鉴定参与游泳和群集运动的组分或通路。

摘要

运动性对许多细菌物种的生存和成功至关重要。目前已有多种方法可利用细菌运动性来研究信号通路、阐明鞭毛组分的功能与组装机制，以及观察和理解其运动模式。本文展示了其中三种方法的结合应用。软琼脂中的运动性检测是最经典的方法，能够有效筛选出在运动缺陷菌株中恢复运动能力的获得功能型抑制突变，即通过第二次突变恢复运动性。细胞锚定技术最初用于证明鞭毛马达的旋转特性，现可用于评估信号效应分子对马达转速及其切换旋转方向能力的影响。“边界穿越”实验则是较新的方法，可使游动细菌被诱导转变为群体性迁移的群集运动状态。这三种方法联合使用，构成了一套系统而强大的策略，可用于鉴定运动装置的组成成分，并表征它们在游泳和群集运动不同层面中的作用。这些方法也可轻松地推广应用于其他细菌物种的运动性研究。

引言

细菌利用多种附属结构在其生态位中进行运动和扩散1。其中，鞭毛驱动的运动速度最快，能够响应环境信号促进细菌向有利环境定植，并显著增强某些物种的致病能力2,3。具有鞭毛的细菌可在液体环境中独立游动，或在半固体表面以群体形式协同迁移4。细胞外的鞭毛通过嵌入膜内的旋转马达进行附着和驱动，该马达利用离子梯度产生的能量产生转矩，从而驱动鞭毛旋转1,2,4,5,6,7,8。在E. coli中，其马达以恒定转矩运行9，马达输出可通过旋转速度以及转子在逆时针（CCW）和顺时针（CW）方向之间的切换来表征。CCW旋转促进形成协调的鞭毛束，推动细胞向前运动（“run”），而短暂的方向切换（CW）则导致鞭毛束部分或完全解聚10，使细胞重新调整其游动方向（“tumble”）。E. coli通常向前游动约1秒，翻滚约0.1秒。转子的切换频率，即“翻滚偏向”（tumble bias），由趋化信号系统调控：跨膜化学感受器检测外部化学信号，并通过磷酸化级联反应将信号传递至鞭毛马达，从而在存在趋化物时延长游动时间，或在存在有毒化学物质时抑制游动11,12。游动能力通常在0.3%软琼脂中进行检测。

在群集运动过程中，细菌以密集的群体形式在半固体表面移动，成群的细菌持续进行旋转流动2,13,14,15。E. coli 的群集运动表现出改变的趋化生理特性（翻滚频率降低）、更高的运动速度，以及相较于在液体环境中游动的细胞更强的抗微生物能力16,17。群集细胞在促进运动的多种策略上存在差异，包括表面活性剂的产生、超量鞭毛以及细胞伸长2。群集行为在生态和临床环境中为细菌提供了竞争优势18,19,20。群集细菌可分为两类：温带群集菌仅能在含0.5–0.8%琼脂固化的培养基上群集，而强健群集菌则可在更高琼脂浓度下迁移21。

存在多种用于研究游动运动性及其调控机制的检测方法。当运动性因突变或环境条件受损时，其本身可作为强有力的筛选指标，用于鉴定获得功能的抑制性突变。这些抑制性突变可能是原始突变的真实回复突变体，也可能是假回复突变体，即通过第二个突变恢复功能。此类突变体可通过全基因组测序（WGS）进行鉴定。另一种替代非偏向性抑制子筛选的方法是采用有偏向的靶向诱变策略（例如PCR诱变）。这些方法通常有助于揭示运动装置的功能或环境调控机制。如果研究目标是分析马达功能，则在软琼脂中测得的野生型运动性的恢复并不一定意味着野生型马达输出功能的恢复。细胞拴系实验是一种评估马达行为的首选初步检测方法，该实验通过单根鞭毛将细胞固定在玻璃表面，随后监测细胞体的旋转情况。尽管目前已有更复杂的技术可用于监测马达特性，但其所需的高速摄像装置以及运动分析软件包的应用限制了这些方法的广泛使用22,23,24,25。细胞拴系实验仅需将鞭毛剪切，使短的鞭毛片段能够附着于载玻片表面，随后通过录像记录细胞体的旋转即可。尽管由于细胞体对鞭毛施加的负载较高，该实验中记录到的马达转速较低，但它仍为研究趋化反应提供了有价值的见解26,27,28,29，并且如后文所述，仍然是一个有效的研究工具。

群集运动能力对研究人员提出了不同的挑战。13 只有在能够大量产生表面活性剂并易于发生群集运动的菌株中，获得功能型抑制子的筛选方法才有效。像大肠杆菌（E. coli）这类不产生表面活性剂的菌株，则对琼脂种类、培养基成分以及环境湿度的要求极为严格2,13,14,21。一旦建立了群集条件，边界穿越实验17 就成为研究群集菌群适应新环境或恶劣条件能力的有效方法。尽管下文所述方案 针对的是 E. coli，但这些方法可轻松调整并应用于其他物种。

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方案

1. 运动缺陷型菌株中抑制突变体的分离

注意：将此方法作为广泛的“通用检测”手段，用于确定运动缺陷的一般性质。

  1. 软琼脂平板制备
    注意：软琼脂（也称为运动性琼脂或泳动琼脂）是一种低浓度琼脂（约0.2–0.35% w/v），长期以来用于趋化性检测31,32。
    1. 在2 L的圆底烧瓶中加入3 g细菌琼脂（0.3% w/v）和20 g LB培养基。向烧瓶中加入1 L去离子水（ddH2O），使用搅拌棒和磁力搅拌器均匀混合悬浮液。
    2. 在121 °C下高压灭菌20分钟。
    3. 用上述搅拌棒和磁力搅拌板轻轻搅动使其冷却。当温度降至约50 °C时，将25 mL液体倒入无菌培养皿（100 mm × 15 mm）中，盖上皿盖静置至少1小时，使琼脂凝固，制备好的平板应在16小时内使用。
  2. 菌种培养、接种及抑制突变体的分离
    注意：E. coli在以软琼脂固化的营养丰富培养基中心接种后，会在局部消耗营养物质，形成细菌可追随的营养梯度。随着细菌向外移动，会出现明确的“环状”区域（图1A），这些环与细菌响应的特定趋化物相关。趋化系统或鞭毛马达结构组分的缺陷均可能影响该实验中的运动表现。在筛选过程中，常会出现具有运动优势的突变体，这些突变体可从环边缘的一个或多个位点“喷射”状向外延伸（图1C）。可以观察到，泳动前沿的最外缘与未被菌落占据的原始软琼脂区域之间有明显对比。
    1. 将目标运动缺陷型菌株接种于5 mL Lennox肉汤（LB；含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和5 g/L NaCl，材料表）中，在30 °C下以水平摇床（220 r.p.m.）过夜培养。次日，取培养物以1:100比例转接至新鲜LB培养基中，在相同条件下培养至对数生长期（OD600为0.6）。
    2. 使用移液器吸取6 µL菌液，将无菌吸头插入软琼脂平板（1.1）中心，轻柔推出菌液完成接种。将平板转移至30 °C培养（图1B），直至观察到从接种点或运动环边缘明显向外延伸的“喷射”状菌群，通常需要24–36小时（图1C）。
      注意：在运动性检测中，应同时接种野生型菌株作为突变株的对照。野生型菌株将表现出典型的同心趋化环（图1A），并在8–10小时内填满整个平板。
    3. 用无菌接种环挑取“喷射”区域的菌体，在LB硬琼脂平板（LB按上述方法配制，添加15 g/L细菌琼脂固化）上划线以纯化单菌落。
    4. 用无菌接种环挑取划线平板上的单菌落，再次划线分离单菌落，以确保获得“纯”菌落的分离株。
  3. 抑制突变体的验证与表征
    1. 确认所分离的抑制突变体是否恢复了运动能力。制备软琼脂平板（1.1），并准备待测菌株的培养物（同1.2.1），包括野生型菌株和原始“运动缺陷型”菌株作为对照。
    2. 按步骤1.2.2接种平板，并在30 °C下培养8–10小时。
    3. 测量最外层环（圆形边缘）的直径，并进行比较，以确定哪些分离株显著恢复了运动能力。
      注意：建议在整个实验过程中定期拍摄平板照片。为获得最佳效果，可使用“光源桶”装置30，即将数码相机置于光源上方，以提供更佳照明，便于准确测量泳动菌落的直径，并将其与未被菌落占据的琼脂区域区分开。
    4. 根据需要对已验证的分离株进行全基因组测序（WGS），确保有足够的“测序覆盖深度”，以准确鉴定出恢复野生型功能的突变位点。

2. 通过细胞拴系定量分析鞭毛马达行为

注意：当正常的奔跑-翻滚行为（趋化性）似乎受损时，使用此方法。

  1. 培养物制备与鞭毛剪切
    1. 按照步骤 1.2.1 所述方法，制备目标菌株的对数生长期培养物。
    2. 取 10 mL 菌液，在 2,000 x g 条件下离心 3 分钟以收集菌体，随后用 10 mL 过滤除菌的运动缓冲液（MB；10 mM 磷酸钾缓冲液 [0.0935 M K2HPO4, 0.0065 M KH2PO4, pH 7.0]、0.1 mM EDTA [pH 7.0]、10 mM NaCl、75 mM KCl）重悬菌体。
      注：MB 可支持细菌 运动性，但不支持细菌生长
    3. 重复步骤 2.1.2 两次，最后将菌体沉淀重悬于 1 mL MB 中。
    4. 将菌悬液转移至 1 mL 注射器中，并在末端连接一根 23G 针头。准备另一套相同的注射器/针头装置，并用一段长 6 英寸、内径为 0.58 mm 的聚乙烯管紧密套接在两个针头尖端，将两套装置连接起来。
    5. 通过缓慢地将菌悬液在两个注射器之间来回推注 50 次，以剪切鞭毛（鞭毛脆弱，易断裂），每推注 10 次后暂停 1 分钟。
    6. 将剪切后的菌体在 2,000 x g 条件下离心 3 分钟，最后重悬于 500 µL MB 中。
  2. 载玻片制备与细胞固定
    1. 通过将一块 18 mm × 18 mm 的盖玻片叠放在一块 3 英寸 × 1 英寸 × 1 mm 的玻璃载玻片上，并用双面胶带隔开，构建一个细胞固定室（图 S1）。
    2. 将 0.01% (w/v) 多聚赖氨酸溶液加至固定室顶部，使溶液流入室内；将底部边缘（盖玻片与载玻片齐平的一侧）倾斜接触实验用纸巾（卫生纸），以毛细作用帮助溶液流经整个固定室（图 S1）。随后在室温下孵育 10 分钟。
    3. 使用步骤 2.2.2 所述方法，用 40 µL MB 洗涤固定室三次。
    4. 向固定室顶部加入 40 µL 上述制备的剪切后菌悬液，在室温下孵育 10 分钟，使细菌附着于盖玻片表面。
    5. 按照步骤 2.2.3 的方式，用 40 µL MB 轻柔冲洗固定室，以去除未附着的细菌。
  3. 细胞旋转记录与定量分析
    1. 将载有固定细菌的载玻片转移至显微镜载物台上。
    2. 使用相差显微镜和 100 倍物镜，扫描观察细菌群体，寻找位置固定且沿单一轴线旋转的细胞，即在固定点上平稳旋转、而非倾斜导致细胞在焦平面内外移动的个体（视频 1）。
    3. 使用商用显微镜及其配套相机，打开相应软件，确保目标细胞处于清晰对焦状态，点击 视频采集 按钮，以每秒 10 帧或更高的帧率记录一分钟的细胞旋转过程。
    4. 通过视频回放，定量统计每分钟完成的完整旋转圈数以及细胞改变旋转方向的次数（切换频率）。
      注：旋转速度和方向切换频率可能过快而难以肉眼判断，建议使用支持慢速或逐帧播放的视频分析软件，或采用自动化软件系统来量化旋转模式33。另一种替代方法是使用甲基纤维素（或类似试剂）提高 MB 的黏度，以减缓快速运动细菌的旋转速度，便于观察解析，或在使用低帧率相机时进行补偿。
    5. 对多个生物学重复样本重复步骤 2.3.2，以获得目标群体的代表性数据。

3. 边界穿越实验中群体的制备

注意：使用此方法评估突变或条件对群体运动性的影响。Swarm-agar（群游琼脂）指琼脂浓度通常高于软琼脂的培养基。在软琼脂（0.3%）中，细胞在琼脂内部单独游动；而在群游琼脂（0.5%及以上）中，细胞在琼脂表面以群体形式移动。虽然群游平板必须按此处详述的方式使用，但游动平板保存期限较长，可使用数天。我们通常倾向于在1至2天内使用。

  1. 群集琼脂的制备
    1. 在2 L的圆底烧瓶中加入5 g Eiken琼脂（0.5% w/v）和20 g LB培养基。加入1 L去离子水（ddH2O），使用搅拌棒和磁力搅拌器将悬浮液充分混匀。
    2. 在121 °C条件下高压灭菌20分钟。
    3. 在轻微搅拌下冷却，避免产生气泡（方法同上）。当温度降至约50 °C时，加入滤膜除菌的葡萄糖，使其终浓度为0.5%。
    4. 将25 mL琼脂倒入无菌培养皿（100 mm × 15 mm）中，在室温下静置至少14小时，但不超过20小时。请勿储存以备后续使用。
  2. 群集平板的接种与培养
    1. 取6 µL处于对数中期的菌液（按步骤1.2制备），点样于琼脂表面进行接种。
    2. 打开皿盖静置5–10分钟，待接种物完全渗入琼脂表面后盖上皿盖。
    3. 在30 °C下培养8小时。避免频繁开盖观察群集进展，以免琼脂干燥，影响群集行为。
      注意：培养时间可能因菌株表型不同而有所变化。某些突变可能削弱群集能力，需降低琼脂浓度或延长培养时间。
  3. 跨边界迁移实验平板的制备
    注意：本实验使用一种改良的培养皿，其中塑料隔板（边界）将培养皿分为两个独立腔室（图2A）。两个腔室可分别制备，以设置不同的群集条件，随后通过“连接”实现迁移。根据实验设计，左侧腔室可使用游动琼脂（0.3% w/v）或群集琼脂（0.5% w/v），使细菌从该侧迁移至右侧含有群集琼脂（可添加或不添加特定补充物或刺激物，如抗生素）的腔室。通常通过测量从原始接种点出发的细菌定植区域的最大直径（边缘到边缘）来评估并比较在不同琼脂上的迁移能力。
    1. 如需使用，按步骤1.1所述制备游动琼脂。
    2. 按步骤3.1所述制备群集琼脂。
    3. 向双腔培养皿（100 mm × 15 mm）的右侧腔室中倒入约30 mL群集琼脂（如需可添加特定补充物），使液面与腔室间的塑料隔板齐平，但不溢入左侧腔室（图2B）。
    4. 待琼脂凝固后，向左侧腔室加入约30 mL游动琼脂或群集琼脂，同样加至与塑料隔板接触但不溢出（图2C）。在琼脂尚未凝固前，使用无菌移液器吸头轻轻将琼脂沿隔板拖拽，形成一个高度约1 mm、贯穿整个隔板长度的琼脂桥，以连接两侧（图2D）。
    5. 将平板在室温下晾干（3.1）。
      注意：另一种构建琼脂桥的方法是让左侧腔室的琼脂先干燥，然后缓慢沿塑料隔板加入约100 μL熔化的群集琼脂，以连接两个腔室（3.4）。随后按上述方法在左侧腔室接种（游动琼脂参照1.2.2，群集琼脂参照3.2），在30 °C培养12–16小时，或直至菌群在右侧腔室中迁移至足以比较目标菌株差异的程度。

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结果

在假回复突变体的分离中 E. coli 在我们实验室近期的研究中，详细描述了一种由于信号分子 c-di-GMP 水平过高而导致运动能力受损的菌株34该菌株（JP1442）含有两个突变：ΔyhjH 和 ΔycgRYhjH 是降解 c-di-GMP 活性最强的磷酸二酯酶 E. coliYhjH缺失导致c-di-GMP水平升高并抑制运动性。YcgR是一种c-di-GMP效应蛋白。当与c-di-GMP结合时，YcgR可结合至鞭毛转子，首先诱导逆时针（CCW）电机旋转，随后降低电机转速。细胞拴系实验和微珠实验证实，在双突变体中电机行为恢复至正常水平，但在软琼脂中的运动性并未恢复。34因此，我们采用该方案的第1步，在双突变体中分离假回复子簇图1C）。通过全基因组测序（HiSeq 4000 平台，PE 2 x 150 配置）定位的大多数突变34) 到 rssB，...

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讨论

分离和鉴定抑制性突变已成功帮助识别趋化系统中的关键组分35,36,37，以及运动装置本身38,39,40。在使用方案1时，应包含多个独立的重复实验，以确保能够分离出大量可能补偿运动缺陷的突变。通过将菌液划线接种而非点种，增加细菌数量，可提高获得抑制性突变体的概率41。同一突变（通过DNA测序确定）被多次独立分离，可增强其真实性的可信度。全基因组测序（WGS）不可避免地会揭示基因组中存在其他突变，因此，通过转导（如可行）将鉴定出的突变回置到原始的运动缺陷型背景中以验证结果至关重要。抑制性突变体方法依赖于通过二次突变恢复功能，因此该方法的一个局限性在于：如果某个关键的结构基因被完全删除（即该基因是整个通路或结构的基础），则可...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院资助项目 GM118085 以及罗伯特·韦尔奇基金会（资助号 F-1811，授予 R.M.H.）的部分支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
Bacto 脱水琼脂Fisher ScientificDF0140-15-4
EDTA 二钠盐，二水合物Fisher Scientific02-002-786
Eiken 琼脂Eiken Chemical Co. JapanE-MJ00大肠杆菌群集运动所必需
葡萄糖 D (+)Fisher Scientific410955000
LB（Lennox）肉汤Fisher ScientificBP1427-500
聚-L-赖氨酸溶液（0.1%）Sigma-AldrichP8920
氯化钾（KCl）Fisher Scientific18-605-496
磷酸二氢钾（KH2PO4）Fisher ScientificBP362-500
磷酸氢二钾（K2HPO4）Fisher ScientificBP363-500
氯化钠（NaCl）Fisher ScientificS271-500
材料与设备
CellSense 显微镜成像软件（V. 1.6）Olympus或所用显微镜的等效软件
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 双面胶带Fisher50-285-28
磨砂载玻片（3×1×1 mm）Fisher12-550-343
Olympus BX53 显微镜OlympusBX53任何正置或倒置相差显微镜均可使用
培养皿（100 mm 直径）Fisher ScientificFB0875712用于软琼脂实验
聚乙烯雾化毛细管（0.58 mm × 99 mm，3.0 m）Perkin Elmer9908265
双区圆形培养皿VWR89200-944用于边界跨越实验
安全型皮下注射针头（23G）Fisher Scientific14-826A
无菌注射器 - 1 mLFisher scientific14-955-450
Task/Tissue 擦拭纸Fisher scientific06-666或等效的一次性擦拭纸
VWR 显微盖玻片（18×18 mm）VWR48366205
XM10 相机OlympusXM10或等效显微镜相机

参考文献

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