方法文章

活细胞向前遗传方法，识别和分离衣 原体沙眼中的发育突变体

DOI：

10.3791/61365

⸱

2020年6月10日

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Idaho

本文内容

摘要

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该协议利用荧光启动子-记者，活细胞显微镜，和个人包含提取在定向前的基因方法，以识别和分离 衣原体沙眼的发育突变体。

摘要

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细胞内细菌病原体 沙眼衣原体 经历一个由两种形态离散发育形式的发育周期。非复制性基本体 （EB） 启动宿主的感染。一旦进入，EB分化成沉默体（RB）。然后，RB 经过多轮复制，然后区分为传染性 EB 形式。由于在细胞类型之间无法切换，无法防止宿主入侵或复制，因此此循环对衣原体生存至关重要。

由于衣原体细胞内性质的强制性 ，基因技术的限制 阻碍了细胞类型发育中分子机制的识别。我们设计了一种新型的双启动子-报告机质粒系统，结合活细胞显微镜，可实现细胞类型实时切换的可视化。为了识别参与细胞类型发育调节的基因，利用活细胞启动-报告器系统，将双报告机菌株的化学突变、 衣原体成像和跟踪与改变的发育动力学 相结合，然后对突变体进行克隆分离，以开发前瞻性遗传方法。这种前瞻性基因工作流程是一个灵活的工具，可以修改为定向审讯到广泛的遗传途径。

引言

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沙眼衣原体 （Ctr）是一种强制性的细胞内病原体，通过双相发育周期，这是其生存和增殖必不可少的1。这个周期包括两种发育形式，基本身体（EB）和沉默体（RB）。EB是复制无能，但通过效应诱导内分泌2调解细胞入侵。进入主机后，EB 将成熟到复制 RB。RB 在转换回 EB 之前执行多轮复制，以便启动后续的感染。

有限的基因工具将大部分衣原体研究限制在生化研究或使用代孕系统。因此，阐明基因调控与发育周期控制已困难,3、4。衣原体领域一个更重要的挑战是高分辨率时间跟踪衣原发育周期和确定其调控所涉及的蛋白质。在衣原体发育周期期间的基因表达传统上由破坏性的"终点"方法进行，包括RNAseq、qPCR和固定细胞显微镜5,5，6。虽然这些方法提供了宝贵的信息，但采用的技术是费力的，具有低时分辨率5,5，6。

在过去十年中，Ctr的基因操作随着质粒转化和诱变

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方案

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此协议中使用的所有 Python 脚本都可在 Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing

1. 穆塔吉尼泽记者衣原体

注:Ctr-L2-hctB舞会-mKate2/euoprom-Clover EB在轴介质CIP-1中使用乙基甲烷磺酸酯（EMS）直接突变，因为该介质支持EB代谢和维持EB感染性12。

  1. 在含有 +3 x 107 EB 的冰上解冻一个衣原体库存，用 p2TK2-hctB 舞会-mKate2/euo prom-Clover 记者质粒和颗粒在 >14，000 x g，在 4 °C 下 30 分钟。hctBeuo
    注: 用于这些实验的 衣原体生物在1x蔗糖磷酸盐-谷氨酸缓冲液（SPG）中纯化并冷冻在-80°C。
  2. 丢弃上流水，将 EB 颗粒重新在 100 μL 的 CIP-1 缓冲液中，在冰上以 10% 的功率进行声波处理，功率为 10 s。将 100 μL 的 EB 悬浮液分成两个 50 μL 等分，用于静音和模拟处理样品。
  3. 在单独的 1.5 mL 微离心管中准备 20 m....

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结果

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我们的启动子-记者衣原体菌株的直接EMS突变导致感染率降低75%。使用所述的活细胞成像协议，在 24 小时的时间内对 +600 个内含物进行成像和跟踪。使用自定义 Python 笔记本脚本可视化每个包含中两个记者的荧光表达式动力学。实施了两种可视化方法，以识别用于隔离的候选突变衣原体。第一种方法（步骤 3.3.8）在交互式散点图中从单个chlamydial 分离器中可视化 euo 和 hctB启动子的半最大值表达式（图 2）。 euo如果内含物落在模拟处理的散射云之外，它们被确定为隔离。候选克隆被挑选出视觉上不属于控制云的克隆。随后对每个克隆进行了验证。克隆A3-6-67和B3-8-58被选择进行隔离，因为它们产生从 euo 启动子到半最大值表达的时间更短，hctB的时间更长（图2）。

第二种用于识别具有改变动力学的内含物的可视化方法（步骤 3.3.9-10）基于两个启动子的.......

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讨论

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由于现有遗传工具的局限性，对控制衣原体发育周期的分解机制进行了阻碍。将我们的启动者-记者衣原体与活细胞自动显微镜结合使用，建立了一个系统，可在24小时的时间内监测单个内含物中的细胞类型发展。该系统结合化学诱变和直接内含分离，建立了一种快速和克隆选择表达改变发育特征的衣原体的方法（图5）。

当提供细胞内离子条件和能量源5，12时，氯酰胺EBs在宿主外部代谢活跃。这种EB轴代谢被利用在宿主细胞之外进行纯化的EB的突变。在此协议中，代谢 EB 直接与 EMS 进行突变。据观察，EMS治疗有效地降低了EB的可行性，并产生了如预期的那样产生可变发育动力学的EB。

据估计，所述EMS突变协议产生+5-20 DNA变化/EB。所述的活细胞显微镜工作流程能够在 30 分钟间隔内成像每个视场 （FOV） 和 72 个 FOV + 8 .......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢华盛顿州立大学的安德斯·奥姆斯兰博士提供CIP-1斧头媒体。这项工作得到了NIH授权R01AI130072、R21AI135691和R21AI113617的支持。爱达荷大学和模拟复杂互动中心的启动资金通过NIH赠款P20GM104420提供了额外支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24 孔聚苯乙烯板康宁3524分离物再感染的细胞培养生长
6 孔玻璃底板CellvisP06-1.5H-N用于成像的细胞培养生长
96 孔玻璃底板Nunc165305用于成像的细胞培养生长
粗线 CO2 单元OKO LabsCO2 单元 BL载物台培养箱 CO2 对照
Bold line T 单元OKO LabsH301-T-UNIT-BL-PLUS载物台培养箱温度控制
硼硅酸盐玻璃毛细管萨特仪器B1005010毛细管
BrightLine 带通发射滤光片 （514/30nm）SemrockFF01-514/30-25荧光滤光片立方体
BrightLine 带通发射滤光片 （641/75nm）SemrockFF02-641/75-25荧光滤光立方体
CellTram VarioEppendorf5196000030显微注射器
气管衣原体血清型 L2ATCCVR-577沙眼衣原
CIP-1 培养基内部 NAAxenic 培养基。IPB 补充 1% FBS、25 μM 氨基酸、0.5
mM G6P、1.0 mM ATP、0.5 mM DTT 和 50 μM GTP、UTP 和
CTP。（Omsland， A. 2012） 内部制作。
Cos-7 细胞 （ATCC）ATCCCRL-1651非洲绿猴肾细胞（宿主细胞）
放线菌酮MP 生物医学 194527宿主细胞生长抑制剂
甲磺酸乙酯，99%Acros OrganicsAC205260100诱变剂
胎儿 PlexGemini Bio-Products100-602基础生长培养基补充剂
斐济/ImageJhttps://imagej.net/FijiNA开放式图像分析软件。https://imagej.net/Fiji
Galaxy 170 S CO2 培养箱EppendorfCO1700100X细胞培养培养模块
（荧光 FP 变体：Clover 和 mKate2）集成 DNA 技术NAgblock 用于克隆到 p2TK2SW2
庆大霉素 10mg/mlGibco 的 Ctr 优化 FP 变体的 ORF15710-064生长培养基抗生素
HBSS（Hank's 平衡盐溶液）康宁21-020-CM宿主细胞冲洗
肝素钠Amersham Life Science16920抑制和逆转宿主细胞与 EB 之间的早期静电相互作用
HEPES 1MGE 生命科学SH30237.01生长培养基 pH 缓冲液
InjectManEppendorf5179 000.018显微作器
Jupyter Notebookhttps://jupyter.org/NA包涵物痕迹的可视化。https://jupyter.org/
Lambda 10-3萨特仪器LB10-3滤光轮控制器
Oko TouchOKO LabsOko Touch界面，用于控制粗线 T 和 CO2 单元
Prior XY 载物台先前H107电动 XY 显微镜载物台
PrismR 离心机LabnetC2500-R温控微量离心机
Problot 杂交箱LabnetH1200A用于衣原体感染的摇摆箱
Proscan II先前H30V4XYZ 显微镜载物台控制器
净化器 2 级生物安全柜Labconco362804细胞培养工作
RPMI-1640（无酚红）Gibco11835-030用于成像的基础生长介质
RPMI-1640（酚红）GE 生命科学SH30027.01基础生长介质
范围 LED 激发 LED（470nm，595nm）范围 LEDF140激发光
声波传感器 型号 500Fisher Scientific15-338-550超声仪，重悬衣原体沉淀
载物台培养箱OKO LabsH301-K-FRAME簇孔板培养室
蔗糖-磷酸-谷氨酸缓冲液 1X （SPG）内部NA衣原体储存缓冲液。（10 mM 磷酸钠 [8 mM K 2HPO 4,2 mM KH 2PO 4]，220 mM 蔗糖，0.50 mM L-谷氨酸;pH 7.4）
T-75 培养瓶Thermo Scientific156499细胞培养生长
TE 300 倒置显微镜尼康16724显微镜
THOR LEDThor LabsLEDD1B白光
胰蛋白酶康宁25-052-CI将宿主细胞从培养瓶中移出，接种到培养板中
Zyla sCMOSAndorZYLA-5.5-USB3成像相机
&微;Manager 2.0gammahttps://github.com/micro-manager/micro-managerNA开放式自动显微镜控制软件包
用于体 的 的

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. AbdelRahman, Y., Belland, R. The chlamydial developmental cycle. FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).
  2. Clifton, D., et al. A chlamydial type III translocated protein is tyros....

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