本方案采用荧光启动子报告系统、活细胞显微镜观察以及单个包涵体提取技术，通过定向正向遗传学方法，鉴定并分离沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）的发育突变株。
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本文内容
摘要
摘要
胞内细菌病原体Chlamydia trachomatis经历一个包含两种形态上 distinct 的发育形态的发育周期。无复制能力的原体（EB）启动对宿主的感染。一旦进入宿主细胞，EB即分化为网状体（RB）。随后，RB进行多轮复制，再重新分化为具有感染性的EB形态。该周期对衣原体的存活至关重要，因为若无法在细胞类型之间转换，将导致无法入侵宿主或无法复制。
由于Chlamydia为专性细胞内寄生，遗传学技术的应用受到限制，这阻碍了对细胞类型发育相关分子机制的鉴定。我们设计了一种新型的双启动子-报告基因质粒系统，结合活细胞显微镜技术，可实现对细胞类型转换过程的实时可视化。为了鉴定参与调控细胞类型发育的基因，我们利用该活细胞启动子-报告基因系统建立了一种正向遗传学方法：首先对双报告基因菌株进行化学诱变，随后对发育动力学发生改变的Chlamydia进行成像与追踪，最后分离突变体克隆。该正向遗传学工作流程是一种灵活的工具，可针对多种遗传通路进行定向研究。
引言
Chlamydia trachomatis（沙眼衣原体，Ctr）是一种专性胞内病原体，其生存与增殖依赖于一个双相发育周期1。该周期包含两种发育形态：原始小体（elementary body, EB）和网状体（reticulate body, RB）。EB不具备复制能力，但可通过效应分子诱导的内吞作用介导细胞侵入2。进入宿主细胞后，EB成熟转化为具有复制能力的RB。RB在重新转化为EB之前进行多轮复制，从而启动新一轮的感染。
有限的遗传学工具使得大多数衣原体研究局限于生化实验或依赖替代系统。因此，解析基因调控机制以及发育周期的控制过程一直较为困难3,4。衣原体研究领域中一个尤为重要的挑战，是实现对衣原体发育周期高时间分辨率的动态追踪，并鉴定参与其调控的相关蛋白。传统上，衣原体发育周期中的基因表达研究依赖于破坏性的“终点”方法，包括RNA测序（RNAseq）、定量PCR（qPCR）以及固定细胞显微镜观察5,6。尽管这些方法提供了宝贵的信息，但所采用的技术操作繁琐，且时间分辨率较低5,
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方案
本方案中使用的所有 Python 脚本均可在 Github 上获取：https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing
1. 对报告基因标记的Chlamydia进行诱变
注意：在无细胞培养基 CIP-1 中直接使用甲基磺酸乙酯（EMS）对 Ctr-L2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover 原体（EB）进行诱变，因为该培养基可支持原体的代谢并维持其感染性12。
- 将含有约 3 x 10⁶ 个衣原体的冻存菌种置于冰上解冻7 经 p2TK2 转化的 EBhctBprom-mKate2/euoprom-Clover 报告质粒并离心收集沉淀 >14,000 x g 4℃下孵育30分钟 ˚C.
注意： 沙眼衣原体 用于这些实验的生物体经30%泛影葡胺密度梯度纯化后于-80℃保存 °在1×蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐缓冲液（SPG）中，于C条件下 - 弃去上清液，将 EB 沉淀重悬于 100 µL 的 CIP-1 缓冲液中，于冰上以 10% 功率超声处理 10 秒。将 1....
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结果
直接对我们的启动子-报告基因衣原体菌株进行EMS诱变，导致其感染力下降约75%。利用所述的活细胞成像方案，在24小时期间内对约600个包涵体进行了成像和追踪。通过定制的Python笔记本脚本，可视化了每个包涵体中两个报告基因的荧光表达动力学。采用两种可视化方法以鉴定候选的诱变株 沙眼衣原体 用于分离。第一种方法（步骤 3.3.8）可视化半最大表达量所需时间 euo 和 hctB 来自单个沙眼衣原体分离株的启动子在交互式散点图中图2）。如果包涵体位于模拟处理组的散点云之外，则将其选为分离对象。候选克隆根据其在视觉上是否明显偏离对照组散点云进行挑选。随后对每个克隆进行验证。克隆A3-6-67和B3-8-58被选中用于分离，因其表现出更短的半最大表达时间 euo 启动子以及更长的时间 hctB (图2).
用于识别具有改变动力学特征包涵体的第二种可视化方法（步骤 3.3.9-10）.......
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讨论
目前可用的遗传工具存在局限性，这阻碍了对控制衣原体发育周期机制的解析。通过将我们的启动子-报告基因系统应用于Chlamydia，并结合活细胞自动显微镜技术，构建了一套可在24小时时间内对单个包涵体内的细胞类型发育过程进行实时监测的系统。该系统结合化学诱变和包涵体直接分离技术，建立了一种能够快速、克隆性筛选出具有改变的发育特征的Chlamydia的方法（图5）。
当提供细胞内离子环境和能量来源时，衣原体的原体（EBs）在宿主外具有代谢活性5,12。本研究利用这种原体的无细胞代谢特性，在宿主细胞外对纯化的原体进行诱变。在本实验方案中，正在代谢的原体直接使用EMS进行诱变处理。结果发现，EMS处理显著降低了原体的活力，并如预期那样产生了发育动力学表现各异的突变原体。
据估计，所述的EMS诱变方案每EB可产生约5-20个DN.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢华盛顿州立大学的 Anders Omsland 博士提供 CIP-1 无菌培养基。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金 R01AI130072、R21AI135691 和 R21AI113617 的资助。此外，爱达荷大学以及通过 NIH 基金 P20GM104420 资助的“复杂相互作用建模中心”提供了启动资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔聚苯乙烯板 | Corning | 3524 | 用于分离株再感染的细胞培养生长 |
| 6孔玻璃底板 | Cellvis | P06-1.5H-N | 用于成像的细胞培养生长 |
| 96孔玻璃底板 | Nunc | 165305 | 用于成像的细胞培养生长 |
| Bold line CO2 控制单元 | OKO Labs | CO2 UNIT BL | 显微镜载物台培养箱的CO2控制 |
| Bold line T 控制单元 | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | 显微镜载物台培养箱的温度控制 |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | Sutter Instrument | B1005010 | 毛细管 |
| BrightLine 带通发射滤光片（514/30nm） | Semrock | FF01-514/30-25 | 荧光滤光立方体 |
| BrightLine 带通发射滤光片（641/75nm） | Semrock | FF02-641/75-25 | 荧光滤光立方体 |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | 显微注射仪 |
| Chlamydia trachmatis 血清型 L2 | ATCC | VR-577 | 沙眼衣原体 |
| CIP-1 培养基 | 自制 | NA | 无细胞培养基。IPB 添加 1% 胎牛血清、25 μM 氨基酸、0.5 mM G6P、1.0 mM ATP、0.5 mM DTT 以及 50 μM GTP、UTP 和 CTP。（Omsland, A. 2012）自制。 |
| Cos-7 细胞（ATCC） | ATCC | CRL-1651 | 非洲绿猴肾细胞（宿主细胞） |
| 放线菌酮 | MP Biomedicals | 194527 | 宿主细胞生长抑制剂 |
| 甲基磺酸乙酯，99% | Acros Organics | AC205260100 | 诱变剂 |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | 基础培养基补充剂 |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | 开源图像分析软件。https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 培养箱 | Eppendorf | CO1700100X | 细胞培养孵育 |
| gblocks（荧光蛋白变体：Clover 和 mKate2） | Integrated DNA Technologies | NA | 用于克隆至 p2TK2SW2 的 Ctr 优化荧光蛋白变体的 gblock ORF |
| 庆大霉素 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | 生长培养基用抗生素 |
| HBSS（Hank's 平衡盐溶液） | Corning | 21-020-CM | 宿主细胞清洗 |
| 肝素钠 | Amersham Life Science | 16920 | 抑制并逆转宿主细胞与EB之间的早期静电相互作用 |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | 生长培养基的pH缓冲液 |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | 显微操作器 |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | 包涵体轨迹可视化。https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | 滤光轮控制器 |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | 用于控制 Bold line T 和 CO2 单元的界面 |
| Prior XY 载物台 | Prior | H107 | 电动XY显微镜载物台 |
| PrismR 离心机 | Labnet | C2500-R | 温控微量离心机 |
| Problot 杂交炉 | Labnet | H1200A | 用于沙眼衣原体感染的摇动孵育器 |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ显微镜载物台控制器 |
| Purifier Class 2 生物安全柜 | Labconco | 362804 | 细胞培养操作 |
| RPMI-1640（无酚红） | Gibco | 11835-030 | 成像用基础生长培养基 |
| RPMI-1640（含酚红） | GE Life Sciences | SH30027.01 | 基础生长培养基 |
| scopeLED 激发光源 LED（470nm, 595nm） | scopeLED | F140 | 激发光源 |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | 超声破碎仪，用于重悬沙眼衣原体沉淀 |
| 显微镜载物台培养箱 | OKO Labs | H301-K-FRAME | 多孔板孵育室 |
| 蔗糖-磷酸盐-谷氨酸缓冲液 1X（SPG） | 自制 | NA | 沙眼衣原体储存缓冲液。（10 mM 磷酸钠 [8 mM K2HPO4, 2 mM KH2PO4]，220 mM 蔗糖，0.50 mM L-谷氨酸；pH 7.4） |
| T-75 培养瓶 | Thermo Scientific | 156499 | 细胞培养生长 |
| TE 300 倒置显微镜 | Nikon | 16724 | 显微镜 |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | 白光光源 |
| 胰蛋白酶 | Corning | 25-052-CI | 将宿主细胞从培养瓶中解离以接种至培养板 |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | 成像相机 |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | 开源自动化显微镜控制软件包 |
参考文献
- AbdelRahman, Y., Belland, R. The chlamydial developmental cycle. FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).
- Clifton, D., et al. A chlamydial type III translocated protein is tyros....
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