本方案采用荧光启动子报告系统、活细胞显微镜观察以及单个包涵体提取技术，通过定向正向遗传学方法，鉴定并分离沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）的发育突变株。
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摘要
摘要
胞内细菌病原体Chlamydia trachomatis经历一个包含两种形态上 distinct 的发育形态的发育周期。无复制能力的原体（EB）启动对宿主的感染。一旦进入宿主细胞，EB即分化为网状体（RB）。随后，RB进行多轮复制，再重新分化为具有感染性的EB形态。该周期对衣原体的存活至关重要，因为若无法在细胞类型之间转换，将导致无法入侵宿主或无法复制。
由于Chlamydia为专性细胞内寄生，遗传学技术的应用受到限制，这阻碍了对细胞类型发育相关分子机制的鉴定。我们设计了一种新型的双启动子-报告基因质粒系统，结合活细胞显微镜技术，可实现对细胞类型转换过程的实时可视化。为了鉴定参与调控细胞类型发育的基因，我们利用该活细胞启动子-报告基因系统建立了一种正向遗传学方法：首先对双报告基因菌株进行化学诱变，随后对发育动力学发生改变的Chlamydia进行成像与追踪，最后分离突变体克隆。该正向遗传学工作流程是一种灵活的工具，可针对多种遗传通路进行定向研究。
引言
Chlamydia trachomatis（沙眼衣原体，Ctr）是一种专性胞内病原体，其生存与增殖依赖于一个双相发育周期1。该周期包含两种发育形态：原始小体（elementary body, EB）和网状体（reticulate body, RB）。EB不具备复制能力，但可通过效应分子诱导的内吞作用介导细胞侵入2。进入宿主细胞后，EB成熟转化为具有复制能力的RB。RB在重新转化为EB之前进行多轮复制，从而启动新一轮的感染。
有限的遗传学工具使得大多数衣原体研究局限于生化实验或依赖替代系统。因此，解析基因调控机制以及发育周期的控制过程一直较为困难3,4。衣原体研究领域中一个尤为重要的挑战，是实现对衣原体发育周期高时间分辨率的动态追踪，并鉴定参与其调控的相关蛋白。传统上，衣原体发育周期中的基因表达研究依赖于破坏性的“终点”方法，包括RNA测序（RNAseq）、定量PCR（qPCR）以及固定细胞显微镜观察5,6。尽管这些方法提供了宝贵的信息，但所采用的技术操作繁琐，且时间分辨率较低5,6。
在过去的十年中，随着质粒转化和突变技术的引入，对沙眼衣原体（Ctr）的遗传操作取得了进展7,8,9。在本研究中，开发了一种基于质粒的系统，用于在感染过程中实时监测单个包涵体内的衣原体发育情况。构建了一种表达网状小体（RB）和原体（EB）细胞类型特异性启动子-报告基因的衣原体转化株。RB特异性报告基因通过将早期RB基因euo的启动子与荧光蛋白Clover的上游融合而构建。EUO是一种转录调控因子，可抑制部分晚期EB相关基因的表达10。编码组蛋白样蛋白并参与EB核质浓缩的hctB基因的启动子被克隆至mKate2（RFP）的直接上游，以构建EB特异性报告基因11。hctBprom-mKate2/euoprom-Clover的载体骨架为p2TK2SW27。hctB和euo启动子从Ctr-L2基因组DNA中扩增获得。每个启动子序列包含目标衣原体基因预测转录起始位点上游约100个碱基对，以及相应开放阅读框（ORF）的前30个核苷酸（10个氨基酸）。荧光蛋白（FP）变体以商业化形式获得，为经过Ctr密码子优化的基因片段，并与各衣原体基因及其启动子的前30个核苷酸进行同框克隆。在mKate2的直接下游克隆了incD终止子。第二个启动子-报告基因被插入incD终止子的下游。将p2TK2SW2中的氨苄青霉素抗性基因（bla）替换为来自pBam4的aadA基因（壮观霉素抗性）。最终构建得到质粒p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover（图1A），并将其转化至Ctr-L2中7。该RB/EB报告菌株使得利用活细胞显微镜观察单个包涵体内发育周期成为可能（图1B,C）。
利用我们的启动子-报告基因构建体并结合化学诱变，设计了一种方案，用于追踪和分离在经诱变处理的沙眼衣原体血清型L2群体中表现出发育异常的单个克隆。该方案可实现对单个衣原体包涵体的直接监测，实时追踪基因表达谱的变化，识别具有异常发育基因表达模式的衣原体克隆，并从单个包涵体中进行Chlamydia克隆的分离。
尽管本实验方案是为鉴定参与衣原体发育的基因而专门设计的，但也可轻松加以改造，用于研究任意数量的衣原体遗传通路。
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方案
本方案中使用的所有 Python 脚本均可在 Github 上获取：https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing
1. 对报告基因标记的Chlamydia进行诱变
注意：在无细胞培养基 CIP-1 中直接使用甲基磺酸乙酯（EMS）对 Ctr-L2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover 原体（EB）进行诱变，因为该培养基可支持原体的代谢并维持其感染性12。
- 将含有约 3 x 10⁶ 个衣原体的冻存菌种置于冰上解冻7 经 p2TK2 转化的 EBhctBprom-mKate2/euoprom-Clover 报告质粒并离心收集沉淀 >14,000 x g 4℃下孵育30分钟 ˚C.
注意： 沙眼衣原体 用于这些实验的生物体经30%泛影葡胺密度梯度纯化后于-80℃保存 °在1×蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐缓冲液（SPG）中，于C条件下 - 弃去上清液，将 EB 沉淀重悬于 100 µL 的 CIP-1 缓冲液中，于冰上以 10% 功率超声处理 10 秒。将 100 µEB 悬液的 L 分成两份，每份 50 µ用于诱变处理和模拟处理样品的 L 等分试样。
- 在另一个1.5 mL微量离心管中配制20 mg/mL的EMS-CIP-1溶液。具体操作为加入6.8 µL of EMS in 375 µL 总体积
- 加入50 µ将 EMS-CIP-1 溶液 50 μL 加入一份衣原体分装样品中用于诱变 µ仅向另一份沙眼衣原体等分试样加入 CIP-1 的 L 型。
注意：EMS 的终浓度为 10 mg/mL。本方案中使用的沙眼衣原体滴度、EMS 浓度和处理时间可导致感染性子代减少约 60–80%。该程度的减少相当于每个沙眼衣原体基因组约产生 5–20 个 DNA 损伤位点。8. - 室温孵育 20 分钟。经诱变的 EB 将直接用于第 2 节中的单层细胞感染。
警告：EMS 是一种已知的致癌物。所有接触过 EMS 的设备和材料在丢弃前必须在 1 M NaOH 中浸泡 24 小时，实验过程中及清理 EMS 相关物品时应始终佩戴手套。
2. 突变株 Ctr 的成像
- 用于成像和突变化 Ctr 分离的宿主细胞培养
- 在6孔玻璃底培养板中，每孔接种6 × 105个Cos-7细胞（ATCC），加入2 mL完全培养基（RPMI-1640，添加10%胎牛血清和10 mg/mL庆大霉素）。该玻璃底培养板用于突变化 Ctr 的成像。
- 在24孔聚苯乙烯培养板中，每孔接种1 × 105个Cos-7细胞（ATCC），加入1 mL完全培养基。该聚苯乙烯培养板用于重新感染感兴趣的突变 Chlamydia。
- 将两块培养板在5% CO2、37 °C条件下孵育约18小时。当细胞达到汇合状态后，更换为添加1 µg/mL环己酰亚胺的完全培养基，并过夜孵育。
- 用突变化 Ctr 感染宿主细胞
- 用约6 × 105个突变化的EB，在1.5 mL/孔的冰上HBSS中感染玻璃底培养板的5个孔。由于诱变导致约70%的死亡率，此操作将获得约0.3的感染复数（MOI）。
- 用约2 × 105个未经诱变处理的EB，在1.5 mL/孔的冰上HBSS中感染剩余的一个孔。未经过诱变处理时，预期死亡率较低，因此使用三分之一的接种量即可达到约0.3的MOI。
注：约0.3的MOI可确保每个宿主细胞仅被一个EB感染，并使感染细胞之间保持足够距离，便于克隆分离。 - 将培养板在37 ˚C条件下轻轻摇动孵育15分钟。
- 用预热（37 ˚C）的含1 mg/mL肝素的HBSS洗涤感染的宿主细胞，随后立即用HBSS冲洗一次。重复肝素洗涤，并立即用HBSS冲洗两次，以确保完全去除肝素。
注：肝素可抑制并逆转宿主细胞与EB之间早期的静电相互作用13。肝素洗涤可去除尚未进入宿主细胞的EB，从而实现感染同步化。洗涤时应轻柔操作，防止细胞从孔壁脱落。HBSS和肝素溶液中残留有EMS，废弃前应置于盛有1 M NaOH的烧杯中处理24小时。 - 将HBSS替换为每孔4 mL预热（37 ˚C）的成像培养基（完全培养基，含1 µg/mL环己酰亚胺、20 mM HEPES，不含酚红）。
- 在孔间区域加入预热（37 ˚C）的去离子H2O，以帮助维持温度并减少蒸发。将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育10小时。
- 显微镜设置与成像
注：采用多色多位置自动活细胞荧光成像技术采集延时图像，以鉴定在发育基因表达动力学方面存在差异的衣原体突变株。本方案使用开源的µManager软件包实现显微镜的自动化控制14。- 感染后10小时开始显微镜设置。将显微镜载物台培养箱设定为5% CO2、37 ˚C。将感染后的6孔玻璃底培养板放入载物台培养箱，并将样品热敏电阻插入孔间H2O中。
- 使用高通量筛选（HCS）插件校准XY载物台。在µManager显微镜控制软件中点击 插件 | 采集工具 | HCS位点生成器（JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2）。
- 选择6孔板模板，在HCS插件中生成每个孔包含12个视野（FOV）的成像位置列表（JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4）。打开载物台位置列表，使用载物台控制插件手动对焦并为每个FOV设置初始Z位置（JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6）。调整任何缺少细胞或单层不均匀的FOV的XY坐标。
注：由于每张图像采集所需时间较长，每30分钟最多可采集72个FOV。 - 使用20倍物镜进行成像。该放大倍数可在每个FOV中成像约8个包涵体，同时仍提供所需的分辨率。
- 保存位置列表，以便在数据分析后重新定位感兴趣的包涵体（JoVE61365_screenfile7）。
- 在成像软件中使用自动对焦选项，设置自动成像的对焦参数（JoVE61365_screenfile8）。
- 在µManager中使用基于图像的自动对焦功能时，采用以下选项和数值以获得最稳定的对焦效果。在自动对焦属性窗口中，从下拉菜单选择OughtaFocus，并使用以下设置：OughtaFocus-SearchRange_µm: 350，OughtaFocus-Tolerance_µm: 0.5，OughtaFocusCropFactor: 0.3，OughtaFocus-Exposure: 20，OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2.5，OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14，OughtaFocus-ShowImages: 是，OughtaFocus-Maximize: SharpEdges，OughtaFocus-Channel: DIC。
注：通过降低裁剪因子缩小自动对焦成像窗口，有助于实现更稳定的自动对焦。将OughtaFocus-ShowImages设为是，可使用户查看自动对焦图像。 - 通过每30分钟一次的时间间隔连续成像24小时，以捕捉发育周期的动力学过程（JoVE61365_screenfile9）。在感染后12至36小时（HPI）期间成像，可确保Chlamydia完成整个发育周期但尚未裂解宿主细胞。
- 对细胞单层进行成像时，GFP和RFP通道的曝光时间均为250 ms，激发强度分别为4%和18%（JoVE61365_screenfile10）。使用470 nm激发光和514/30 nm带通发射滤光片检测Clover（GFP）信号；使用595 nm激发光和641/75 nm带通发射滤光片检测mKate2（RFP）信号。
注：最小化激发强度对于减少荧光团的光漂白和对Chlamydia的光毒性至关重要。应在预实验中经验性确定在200–300 ms曝光条件下生成清晰图像所需的最低激发强度。 - 采集多个Z切片，聚焦范围应覆盖清晰焦点切片的上下两侧。在本实验中，使用20倍物镜时，通过4个切片、每步10 µm实现（JoVE61365_screenfile11）。
- 在采集窗口中选择相对Z以进行多切片成像。相对Z选项将以成像位置列表中保存的Z平面位置作为下一个时间点的起始位置。输入适用于荧光成像通道的适当Z偏移值（JoVE61365_screenfile12）。
注：基于图像的对焦系统并不完美，在24小时成像过程中会导致焦点漂移。研究发现，为每个时间点采集3–4个Z焦平面可维持清晰成像。需要Z偏移来校正荧光成像通道与DIC通道之间的焦平面差异。该Z偏移值需通过实验经验性确定。 - 选择根目录并命名实验以保存图像。使用µManager的图像堆栈文件选项将图像保存为tiff堆栈文件（JoVE61365_screenfile13）。
- 在多维采集窗口的采集备注框中记录实验细节（JoVE61365_screenfile13）。例如：A1孔：未处理对照；A2-3孔和B1-3孔：EMS突变株；成像时间：12–36 HPI。图像采集从12 HPI开始。
注：若使用µManager，请在实验结束后保持程序、实验设置和显微镜硬件持续运行。待突变群体分析完成后，将重新访问这些成像位点以进行包涵体分离。
3. 鉴定并分离具有改变的发育表型的诱变Chlamydia
- 创建聚焦清晰的图像堆栈
- 利用包含每个时间点4个Z层面的保存图像数据，从Z堆栈中提取最聚焦的图像。在ImageJ/FIJI中使用峰度测量选项（分析 | 测量）自动识别最清晰的Z层面（峰度得分最高），并仅使用这些聚焦清晰的图像创建新的图像堆栈。附带的Python脚本（Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py）可用于自动化此过程。
- 量化单个包涵体中的荧光表达
注意：为量化两个报告基因的表达动力学，使用开源图像分析软件ImageJ/FIJI及插件Trackmate15。Trackmate可识别“斑点”（在本例中对应包涵体），并在延时图像堆栈中追踪每个包涵体的X、Y位置及其随时间变化的信号强度（JoVE61365_screenfile14）。该信息将保存为CSV文件，并导入自定义Python笔记本进行分析。- 通过点击 插件 | Bio-Formats | Bio-formats 导入器，使用Bio-formats导入器在ImageJ/FIJI中打开聚焦清晰的Z层面缩减图像堆栈。选择 超堆栈 和 复合模式（JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16）。
- 点击 处理 | 减去背景，使用50.0像素的滚动球半径减去图像背景，并通过 处理 | 增强对比度 将图像对比度增强至0.3%饱和像素。将图像值乘以10.0（处理 | 数学 | 乘法）（JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22）。
- 在Trackmate（插件 | 追踪 | Trackmate）中，根据成像结束时包涵体大小经验确定，设定估计的斑点直径为48像素。通过设定 连接最大距离 和 间隙闭合最大距离 为8.0像素，以及 间隙闭合最大帧间隙 为1，生成非碎片化的包涵体轨迹（JoVE61365_screenfile23 - JoVE61365_screenfile25）。
注意：为提高Trackmate在整个周期内识别和追踪包涵体的能力，使用ImageJ/FIJI中的图像数学功能将 euoprom 和 hctBprom 通道相加，创建一个独立的图像通道。该通道由Trackmate用于识别并追踪随时间变化的包涵体。随后，euoprom 和 hctBprom 通道的荧光值分别记录在通道2和通道3中。 - 记录满足最小持续时间的轨迹：轨迹持续时间：20（JoVE61365_screenfile26）。分析轨迹并将 轨迹中的斑点统计 保存为CSV文件（JoVE61365_screenfile27）。
注意：此过程已通过补充数据中提供的自定义Python脚本（TrackMate_Zreduced_JOVE.py）实现自动化。
- 识别具有异常发育特征的包涵体轨迹
注意：为识别含有发育特征异常的 Chlamydia 的包涵体，使用Python笔记本对每条包涵体轨迹进行可视化。这些可视化结果可用于识别基因表达动力学与模拟处理群体不同的包涵体。用于识别发育编程异常包涵体的Python笔记本已提供于补充数据中（EMS_Screen-Markdown）。- 在EMS_Screen-Markdown Python笔记本中，使用 导入 单元格将来自 轨迹中的斑点统计 CSV文件的包涵体轨迹数据导入Pandas数据框。
- 使用 基线减法 单元格，从每条轨迹的其余数值中减去其最小值，以对每条轨迹进行基线校正。使用 保存为Pickle 单元格将结果值保存为pickle文件。这将永久保存基线校正后的通道值，以便后续调用。
注意：基线校正将每个包涵体的起始荧光强度设为零。 - 使用 边缘过滤 单元格排除视野（FOV）边缘附近的包涵体轨迹，因其荧光特征可能未被完整捕获；这些轨迹可能产生假阳性的发育特征。
- 使用 延时校准 单元格，将图像切片中的帧（totalFrames）值校准为时间（startTime, interval）值，结合实验起始时间和成像时间间隔。使用 轨迹持续时间过滤 单元格，排除未覆盖实验最后20小时（16–36 HPI）的轨迹，以剔除部分包涵体读数。
- 使用 分配处理 单元格按实验条件将轨迹分离为独立的数据框。使用 生长过滤 单元格筛选表现出足够生长的包涵体。在 生长过滤 单元格中，通过修改代码最后两行的数值，经验性设定 euoprom 通道的荧光强度阈值。这将过滤掉未生长的 Chlamydia。
注意：设置阈值过滤时需谨慎，若阈值过低，生成的散点图将噪声较大；若过滤过严，可能剔除重要突变体。 - 通过将每孔中经EMS诱变的轨迹数除以模拟处理的轨迹数，计算EMS引起的死亡率。将模拟处理的轨迹数乘以初始稀释倍数3，以计算每孔模拟处理的轨迹数。使用 计数包涵体轨迹 和 计算死亡率百分比 单元格执行此任务。
- 使用 计算 单元格，计算每条轨迹中早期和晚期报告基因达到半最大表达所需的时间。这些值将用于比较诱变群体与模拟处理群体，以识别发育突变体。
- 在 半最大值图 单元格中，使用bokeh绘图包可视化每个启动子达到半最大表达的时间，将 euoprom 达到半最大表达的时间与 hctBprom 的对应时间作图。使用bokeh交互式轨迹ID浏览器识别突变群体中位于模拟处理散点云之外的包涵体。记录目标包涵体的视野（FOV）和XY坐标（图2）。
注意：选择在视觉上明显偏离对照云的候选包涵体，后续将对每个克隆进行验证及统计评估。 - 在 动画图 单元格中，使用绘图工具Plotly16 动态可视化启动子表达动力学随时间的变化，将 euoprom 与 hctBprom 的表达强度作图。使用Plotly的散点函数对基因表达随时间变化进行动画呈现（视频1）。
- 在 包涵体定位器 单元格中，使用bokeh包可视化Plotly动画图的某一时间点快照，绘制特定时间点（例如28 HPI）的 euoprom 和 hctBprom 表达（图3）。按照步骤3.3.8所述方法识别突变群体中的包涵体。
注意：此分析需快速完成（<4小时），因为包涵体仍在扩张，感染约48小时后将开始裂解宿主细胞。
- 从目标包涵体中分离发育突变体
注意：为从显示异常基因调控的包涵体中分离 Chlamydia，使用配备毛细管针的显微操作仪。目标包涵体的孔位ID、视野（FOV）及X、Y坐标由第3.3节中的数据可视化确定。- 准备毛细管针：将毛细管中部置于火焰中加热，并向两端拉伸直至分离。通过在显微镜载玻片上折断拉制后的针尖，在毛细管针上制造开口。折断针时，将闭合端以一定角度置于载玻片磨砂区域并施加压力。
注意：毛细管规格为外径1.0 mm，内径0.5 mm。 - 在显微镜下（20倍物镜）检查针孔开口是否约为包涵体大小。
- 预先拉制约25–30根毛细管针，用于候选包涵体的分离（每个包涵体使用一根针）。
- 向显微注射器中填充矿物油，确保无气泡存在。
- 将玻璃毛细管针连接至显微注射器，将油推出至针尖，排出任何气泡。将毛细管针插入完全培养基中，吸入培养基至针管一半。用培养基填充毛细管针可防止井内油污染。
- 使用µManager中步骤2.3.5保存的位置列表，移动至Python可视化笔记本中识别的目标包涵体所在的孔和视野（FOV）。
- 使用显微操作仪的操纵杆，将毛细管针定位至目标包涵体的XY坐标。
- 使用595 nm激发通道可视化EB以便提取，使用相位/微分干涉差（DIC）白光通道可视化针头。将毛细管针移至包涵体处，破裂包涵体，然后使用显微注射器将EB吸入毛细管针中。
- 将EB从毛细管针中排出至步骤2.1.2中准备的24孔聚苯乙烯板的单个孔中。取出毛细管针，并为下一个包涵体提取更换新针。对所有候选包涵体重复第3.4节操作。
注意：为扩增并确保滴度足够高以进行重新成像，将突变体分离物在5% CO2、37 ˚C培养箱中孵育至大多数宿主细胞被感染（约1周）。应密切监测各孔，因不同分离物可能表现出不同的生长速率。
- 准备毛细管针：将毛细管中部置于火焰中加热，并向两端拉伸直至分离。通过在显微镜载玻片上折断拉制后的针尖，在毛细管针上制造开口。折断针时，将闭合端以一定角度置于载玻片磨砂区域并施加压力。
- 收获突变体分离物
- 在冰上，使用1 mL移液器吸头刮取感染的单层细胞以破坏细胞层。将培养基、细胞碎片和释放的 Chlamydia 转移至1.5 mL微量离心管中。
- 在4 ˚C条件下，以>14,000 x g 离心30分钟，沉淀 Chlamydia。弃去上清液，将沉淀重悬于75 µL冰上预冷的1x SPG中。分装至三个1.5 mL螺帽微量离心管中。储存于-80 ˚C。
4. 突变体分离株表型的验证
- 用于成像诱变分离株的宿主细胞培养
- 在96孔玻璃底板中接种1.6 × 10⁴个4 每孔100个Cos-7细胞（ATCC） µL 完全培养基中。在 5% CO₂ 条件下孵育2, 37 °C. 细胞应在约24小时内达到汇合状态。细胞汇合后，将培养基更换为添加了1的完全培养基 µg/mL 放线菌酮，孵育过夜。
- 用候选分离株感染细胞以进行表型验证
- 解冻突变克隆与野生型 沙眼衣原体 置于冰上。
- 在已准备好的96孔板中，对突变株分离物进行两倍系列稀释，每株使用一列（共11列）。起始稀释度为1:20，体积为100 µl HBSS
注意：梯度稀释 沙眼衣原体 用于确保以相同的感染复数（MOI）对突变体样本进行成像 < 1. - 用野生型感染剩余的（第12）列 沙眼衣原体 在 MOI ~0.5 条件下。
注意：野生型 沙眼衣原体 用作与经诱变分离株进行比较的对照。 - 37℃振荡孵育15分钟 °C.
- 用预热（37 °C）的 PBS 洗涤感染的宿主细胞 °C) 含1 mg/mL肝素的HBSS及2.2节所述的HBSS
- 替换为 200 µ每孔加入预热（37 ℃）的 L °C）成像培养基。
- 用预热（37 ℃）的 PBS 填充孔间区域 °C) 去离子水 H2O.
- 在5% CO₂条件下孵育2, 37 °C孵育10小时。
- 显微镜设置
注意：显微镜设置请参见第2.3节，本节仅包含必要的设置调整。- 选择 96孔板模板 从 高内涵筛选 插件
- 通过实验确定对应于 MOI 的孔 < 每个突变体分离株1个。在控制下的Clover表达 euo 启动子在约10小时HPI时即可观察到，使得包涵体的早期可视化成为可能（图1B).
- 为每个突变体分离株选择三个与MOI相对应的孔 < 1 并生成包含每个孔两个视野的成像位置列表。
注意：由于硬件限制，每个时间间隔最多只能采集72张图像，若对12个样本进行成像，则相当于每种菌株可检测三个稀释度（孔），每孔使用两个成像位点。 - 以12小时感染后（HPI）为起点，每隔30分钟记录各突变株分离物的发育周期，持续36小时。
- 记录实验细节 采集备注 盒中，例如：A孔ABC1：野生型对照；A孔ABC2：突变株1；A孔ABC3：突变株2，依此类推… 成像：感染后12-48小时
- 从感染后12小时（HPI）开始进行图像采集。
5. 分离株验证的数据分析
- 创建清晰对焦的图像堆栈，并量化各个包涵体中的荧光表达
- 按照第 3.1 - 3.2 节所述方法，为每个包涵体生成荧光强度轨迹。
- 验证经诱变的沙眼衣原体（Ctr）分离株
注：为验证突变分离株的发育谱型是否发生改变，需使用 Python 笔记本将其表达谱型与野生型表达谱型进行比较。用于验证发育编程发生改变的突变克隆的 Python 笔记本已在补充数据中提供（clone_check-Markdown）。- 在 clone_check-Markdown Python 笔记本中导入并过滤克隆轨迹数据，操作方法同第 3.3 节。
- 使用 Calculate Mean & STD 单元格，计算每个分离株及野生型对照群体轨迹的均值和标准差（STD）。
- 使用 Graph Iso vs WT 单元格，绘制各突变克隆的均值及均值标准误（SEM）与野生型对照的对比图，以判断突变体的表达动力学是否偏离野生型样本（图 4）。
- 通过绘制突变体轨迹并与野生型包涵体轨迹进行散点图比较（方法同第 3.3 节，步骤 3.3.7–3.3.10），判断所获得的突变群体是否为单克隆（图 2，图 3）。若该分离株为混合群体，则散点图将显示一个群体与野生型重叠，另一个独立群体位于野生型散点云之外。若群体呈现混合状态，可依据第 3.4 节所述原始方法重新分离该突变体。
注：为确定某一分离株的发育谱型与野生型是否存在统计学差异，应采用方差分析（ANOVA）将各分离株的曲线与野生型进行比较。
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结果
直接对我们的启动子-报告基因衣原体菌株进行EMS诱变，导致其感染力下降约75%。利用所述的活细胞成像方案，在24小时期间内对约600个包涵体进行了成像和追踪。通过定制的Python笔记本脚本，可视化了每个包涵体中两个报告基因的荧光表达动力学。采用两种可视化方法以鉴定候选的诱变株 沙眼衣原体 用于分离。第一种方法（步骤 3.3.8）可视化半最大表达量所需时间 euo 和 hctB 来自单个沙眼衣原体分离株的启动子在交互式散点图中图2）。如果包涵体位于模拟处理组的散点云之外，则将其选为分离对象。候选克隆根据其在视觉上是否明显偏离对照组散点云进行挑选。随后对每个克隆进行验证。克隆A3-6-67和B3-8-58被选中用于分离，因其表现出更短的半最大表达时间 euo 启动子以及更长的时间 hctB (图2).
用于识别具有改变动力学特征包涵体的第二种可视化方法（步骤 3.3.9-10）...
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讨论
目前可用的遗传工具存在局限性，这阻碍了对控制衣原体发育周期机制的解析。通过将我们的启动子-报告基因系统应用于Chlamydia，并结合活细胞自动显微镜技术，构建了一套可在24小时时间内对单个包涵体内的细胞类型发育过程进行实时监测的系统。该系统结合化学诱变和包涵体直接分离技术，建立了一种能够快速、克隆性筛选出具有改变的发育特征的Chlamydia的方法（图5）。
当提供细胞内离子环境和能量来源时，衣原体的原体（EBs）在宿主外具有代谢活性5,12。本研究利用这种原体的无细胞代谢特性，在宿主细胞外对纯化的原体进行诱变。在本实验方案中，正在代谢的原体直接使用EMS进行诱变处理。结果发现，EMS处理显著降低了原体的活力，并如预期那样产生了发育动力学表现各异的突变原体。
据估计，所述的EMS诱变方案每EB可产生约5-20个DN...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢华盛顿州立大学的 Anders Omsland 博士提供 CIP-1 无菌培养基。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金 R01AI130072、R21AI135691 和 R21AI113617 的资助。此外，爱达荷大学以及通过 NIH 基金 P20GM104420 资助的“复杂相互作用建模中心”提供了启动资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔聚苯乙烯板 | Corning | 3524 | 用于分离株再感染的细胞培养生长 |
| 6孔玻璃底板 | Cellvis | P06-1.5H-N | 用于成像的细胞培养生长 |
| 96孔玻璃底板 | Nunc | 165305 | 用于成像的细胞培养生长 |
| Bold line CO2 控制单元 | OKO Labs | CO2 UNIT BL | 显微镜载物台培养箱的CO2控制 |
| Bold line T 控制单元 | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | 显微镜载物台培养箱的温度控制 |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | Sutter Instrument | B1005010 | 毛细管 |
| BrightLine 带通发射滤光片（514/30nm） | Semrock | FF01-514/30-25 | 荧光滤光立方体 |
| BrightLine 带通发射滤光片（641/75nm） | Semrock | FF02-641/75-25 | 荧光滤光立方体 |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | 显微注射仪 |
| Chlamydia trachmatis 血清型 L2 | ATCC | VR-577 | 沙眼衣原体 |
| CIP-1 培养基 | 自制 | NA | 无细胞培养基。IPB 添加 1% 胎牛血清、25 μM 氨基酸、0.5 mM G6P、1.0 mM ATP、0.5 mM DTT 以及 50 μM GTP、UTP 和 CTP。（Omsland, A. 2012）自制。 |
| Cos-7 细胞（ATCC） | ATCC | CRL-1651 | 非洲绿猴肾细胞（宿主细胞） |
| 放线菌酮 | MP Biomedicals | 194527 | 宿主细胞生长抑制剂 |
| 甲基磺酸乙酯，99% | Acros Organics | AC205260100 | 诱变剂 |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | 基础培养基补充剂 |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | 开源图像分析软件。https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 培养箱 | Eppendorf | CO1700100X | 细胞培养孵育 |
| gblocks（荧光蛋白变体：Clover 和 mKate2） | Integrated DNA Technologies | NA | 用于克隆至 p2TK2SW2 的 Ctr 优化荧光蛋白变体的 gblock ORF |
| 庆大霉素 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | 生长培养基用抗生素 |
| HBSS（Hank's 平衡盐溶液） | Corning | 21-020-CM | 宿主细胞清洗 |
| 肝素钠 | Amersham Life Science | 16920 | 抑制并逆转宿主细胞与EB之间的早期静电相互作用 |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | 生长培养基的pH缓冲液 |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | 显微操作器 |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | 包涵体轨迹可视化。https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | 滤光轮控制器 |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | 用于控制 Bold line T 和 CO2 单元的界面 |
| Prior XY 载物台 | Prior | H107 | 电动XY显微镜载物台 |
| PrismR 离心机 | Labnet | C2500-R | 温控微量离心机 |
| Problot 杂交炉 | Labnet | H1200A | 用于沙眼衣原体感染的摇动孵育器 |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ显微镜载物台控制器 |
| Purifier Class 2 生物安全柜 | Labconco | 362804 | 细胞培养操作 |
| RPMI-1640（无酚红） | Gibco | 11835-030 | 成像用基础生长培养基 |
| RPMI-1640（含酚红） | GE Life Sciences | SH30027.01 | 基础生长培养基 |
| scopeLED 激发光源 LED（470nm, 595nm） | scopeLED | F140 | 激发光源 |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | 超声破碎仪，用于重悬沙眼衣原体沉淀 |
| 显微镜载物台培养箱 | OKO Labs | H301-K-FRAME | 多孔板孵育室 |
| 蔗糖-磷酸盐-谷氨酸缓冲液 1X（SPG） | 自制 | NA | 沙眼衣原体储存缓冲液。（10 mM 磷酸钠 [8 mM K2HPO4, 2 mM KH2PO4]，220 mM 蔗糖，0.50 mM L-谷氨酸；pH 7.4） |
| T-75 培养瓶 | Thermo Scientific | 156499 | 细胞培养生长 |
| TE 300 倒置显微镜 | Nikon | 16724 | 显微镜 |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | 白光光源 |
| 胰蛋白酶 | Corning | 25-052-CI | 将宿主细胞从培养瓶中解离以接种至培养板 |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | 成像相机 |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | 开源自动化显微镜控制软件包 |
参考文献
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