用于制备高滴度戊型肝炎病毒储备液的细胞培养模型

摘要

本文介绍了一种高效制备高滴度戊型肝炎病毒（HEV）毒种的方法，可用于有效感染肝癌细胞。利用该方法，可收获非包膜型和包膜型病毒颗粒，并用于接种多种细胞系。

摘要

戊型肝炎病毒是导致肝硬化和肝功能衰竭的主要原因，其全球发病率正不断上升。这种单链RNA病毒主要通过输血、卫生条件不足以及受污染的食品传播。迄今为止，许多患者主要采用超说明书使用的抗病毒药物利巴韦林（RBV）进行治疗。然而，仍尚未确定针对戊型肝炎病毒的特异性治疗方法。由于缺乏高效的戊型肝炎病毒细胞培养系统，目前对HEV生命周期及致病机制的研究受到严重阻碍。一个稳定的细胞培养系统对于研究病毒生命周期（包括其致病过程）至关重要。通过本文所述的方法，可获得高达 3 × 10⁶ 焦点形成单位/毫升（FFU/mL）的非包膜型HEV病毒滴度，以及高达 5 × 10⁴ FFU/mL 的包膜型HEV病毒滴度。利用这些病毒颗粒，可以感染多种来源的细胞，包括原代细胞以及人源和动物源性细胞系。通过质粒产生具有感染性的HEV颗粒，可提供无限的病毒来源，使该实验方案极为高效。

引言

戊型肝炎是一种相对常见的 患病率在全球范围内被低估的疾病。每年约有2000万例感染，导致超过70,000人死亡¹. 其致病因子戊型肝炎病毒（HEV） recently 被重新分类，现归属于科 Hepeviridae 包括正肝炎病毒属（Orthohepevirus）和鱼肝炎病毒属（Piscihepevirus）。来源于不同宿主的HEV被归类于正肝炎病毒属A至D种，包括来自人类、猪、兔、大鼠、鸟类及其他哺乳动物的分离株。²目前，已鉴定出八种不同的正链单股RNA病毒基因型（GT）。²尽管它们在序列同源性、传播途径和地理分布上存在差异，但其基因组结构高度保守。具体而言，7.2 kbp的HEV基因组分为三个主要的开放阅读框（ORF1-3）。其中，ORF1编码宿主细胞内成功复制所需的所有酶，ORF2编码衣壳蛋白，而ORF3蛋白则作为功能性离子通道，参与感染性病毒颗粒的组装与释放。³一旦释放到基底侧或顶侧腔隙中，HEV会以准包膜型和无包膜（裸露）型两种形式存在，具体形式取决于病毒来源于血液还是粪便。^4,5.

虽然GT1和GT2主要存在于发展中国家，仅通过粪-....

方案

注意：所有实验均在生物安全二级（BSL-2）条件下进行。所有接触过戊型肝炎病毒RNA或感染性病毒的材料，在丢弃前必须在生物安全柜内的废液容器中用4% Kohrsolin FF充分冲洗。

1. 质粒制备

1. 将含有编码全长 HEV gt3 Kernow-C1p6 序列质粒（pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]⁵⁴ 或 pBluescript_SK_HEVp6-G1634R³⁷）的转化后 Escherichia coli JM109 接种至 200 mL 含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基中。在 37 °C、持续振荡（170 rpm）条件下培养 16 小时。
   注：质粒提取使用质粒提取试剂盒进行（参见材料表）。
2. 按照生产商提供的操作说明，将 200 mL 过夜培养物在 6,000 x g、4 °C 条件下离心 10 分钟，沉淀菌体，弃去上清液。细菌沉淀可冷冻并保存于 -20 °C。
   1. 用 10 mL 血清移液管和移液器辅助装置反复吹打，将细菌沉淀重悬于 4 mL 重悬缓冲液中。同时剧烈涡旋振荡。
   2. 加入 4 mL 预热（30–40 °C）的裂解缓冲液。轻柔颠倒数次，室温（RT）孵育 5 ....

结果

在本实验方案中，我们描述了高滴度感染性HEVcc的制备方法。第一步是分离质粒DNA（pBluescript_SK_HEVp6⁵⁴ 和 pBluescript_SK_HEVp6-G1634R³⁷，图8a），随后通过限制性酶切将其线性化，并纯化用于体外转录（图1）。可通过琼脂糖凝胶电泳比较未酶切与酶切后的质粒DNA，以验证线性化是否成功。除出现大小迁移外，仅应观察到一条代表线性化形式的DNA条带。当位于线性化条带上、下两侧分别代表切口环状和超螺旋形式的两条额外条带完全消失时，表明线性化已完全（图8b）。纯化所得DNA的浓度应超过150 ng/µL。只有满足上述条件的线性化DNA方可用于体外转录。体外转录所得RNA也应通过凝胶电泳进行检测，若RNase污染较少，则应呈现清晰分明的条带，而非弥散的涂抹状（图8c）。.......

讨论

从质粒制备开始，DNA 产量应超过 150 ng/µL，以便能够从同一质粒储备中进行 多次线性化，从而最大限度地降低细菌诱导关键基因组序列突变的风险。此外，必须通过凝胶电泳检测限制性酶切是否实现了质粒的完全线性化（图 8b）。若缺乏线性化的质粒 DNA，将引发滚环扩增，导致体外转录效率降低。另外，应确认 RNA 的完整性，以评估样品中 RNase 的含量（图 8c）。只有在完成上述步骤后，才可考虑对靶细胞进行电穿孔。需要注意的是，在开始 HepG2 细胞制备前，务必确保所有物品均已准备就绪，避免出现长时间等待。特别是，细胞和 RNA 在电穿孔前应短暂保存于 Cytomix 中。为防止电穿孔过程中细胞受热，必须提前将缓冲液置于冰上预冷。电脉冲持续时间不应超过 20–25 ms，电压为 270 V。电穿孔后，细胞需迅速转移至新鲜培养基中，以确保细胞存活率。在感染靶细胞前，应检测转染细胞（TC）中 ORF2 阳性细胞的比例。如果转染细胞中未检测到 ORF2 阳性细胞，则很可能是电穿孔失败或染色未成功，此时应重复实验.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.45 µm 网格	Sarstedt	83.1826	收集细胞外病毒
4 % Histofix	CarlRoth	P087.4	免疫荧光
乙酸	CarlRoth	6755.1	胶原工作液
Amicon Ultra-15	Merck Millipore	UFC910024	病毒收获
氨苄青霉素	Sigma-Aldrich	A1593	转化细菌筛选
ATP	Roche	11140965001	体外转录与电穿孔
BioRender	BioRender		图像生成
CaCl2	Roth	5239.2	Cytomix
0.4 % 无菌胶原R溶液	Serva	47256.01	胶原工作液
CTP	Roche	11140922001	体外转录
电穿孔杯	Biorad	165-2088	电穿孔
DAPI	Invitrogen	D21490	免疫荧光
DMEM	gibco	41965-039	细胞培养
DNA酶	Promega	M6101	体外转录
DTT	Promega	包含于P2077中	体外转录
EGTA	Roth	3054.3	Cytomix
大肠杆菌 JM109	Promega	L2005	转化
胎牛血清	gibco	10270106	细胞培养
Fluoromount	SouthernBiotech	0100-01	免疫荧光
GenePulser Xcell 电穿孔系统	BioRad	1652660	电穿孔
庆大霉素	gibco	15710049	细胞培养
GTP	Roche	11140957001	体外转录
H2O	Braun	184238001	免疫荧光
Hepes	Invitrogen	15630-03	Cytomix
马血清	gibco	16050122	免疫荧光
K2HPO4	Roth	P749.1	Cytomix
KCL	Roth	6781.3	Cytomix
KH2PO4	Roth	3904.2	Cytomix
L-谷氨酰胺	gibco	25030081	细胞培养
还原型L-谷胱甘肽	Sigma-Aldrich	G4251-5G	Cytomix
MEM	gibco	31095-029	细胞培养
MEM 非必需氨基酸（100×）	gibco	11140-035	细胞培养
MgCl2	Roth	2189.2	Cytomix
微量紫外-可见分光光度计 NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	DNA/RNA 浓度测定
MluI 酶	NEB	R0198L	线性化
NEB 缓冲液	NEB	包含于 R0198L 中	线性化
NucleoSpin 质粒提取试剂盒	Macherey & Nagel	740588.250	质粒制备
NucleoSpin RNA 纯化试剂盒	Macherey & Nagel	740948.250	RNA 纯化
PBS	gibco	70011051	细胞培养
青霉素/链霉素	Thermo Fisher	15140122	细胞培养
编码全长HEV基因组的质粒（p6_G1634R）	Todt 等		病毒生产
编码全长HEV基因组的质粒（p6_WT）	Shukla 等	GenBank 登录号 JQ679013	病毒生产
一抗 1E6	LS-Bio	C67675	免疫荧光
一抗 8282			德国弗里德里希-勒弗勒研究所 Rainer Ulrich
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒	Qiagen	27106	DNA 提取
Ribo m7G 加帽类似物	Promega	P1711	体外转录
RNase away	CarlRoth	A998.3	RNA 纯化
RNasin（RNase抑制剂）	Promega	N2515	体外转录
二抗 驴抗小鼠 488	Thermo Fisher	A-21202	免疫荧光
二抗 山羊抗兔 488	Thermo Fisher	A-11008	免疫荧光
丙酮酸钠	gibco	11360070	细胞培养
T7 RNA 聚合酶	Promega	P2077	体外转录
转录缓冲液	Promega	包含于 P2077 中	体外转录
吐温 X-100	CarlRoth	3051.3	免疫荧光
胰蛋白酶-EDTA（0.5 %）	gibco	15400054	细胞培养
超低IgG	gibco	1921005PJ	细胞培养
UTP	Roche	11140949001	体外转录