本文介绍了一种高效制备高滴度戊型肝炎病毒(HEV)毒种的方法,可用于有效感染肝癌细胞。利用该方法,可收获非包膜型和包膜型病毒颗粒,并用于接种多种细胞系。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文介绍了一种高效制备高滴度戊型肝炎病毒(HEV)毒种的方法,可用于有效感染肝癌细胞。利用该方法,可收获非包膜型和包膜型病毒颗粒,并用于接种多种细胞系。
戊型肝炎病毒是导致肝硬化和肝功能衰竭的主要原因,其全球发病率正不断上升。这种单链RNA病毒主要通过输血、卫生条件不足以及受污染的食品传播。迄今为止,许多患者主要采用超说明书使用的抗病毒药物利巴韦林(RBV)进行治疗。然而,仍尚未确定针对戊型肝炎病毒的特异性治疗方法。由于缺乏高效的戊型肝炎病毒细胞培养系统,目前对HEV生命周期及致病机制的研究受到严重阻碍。一个稳定的细胞培养系统对于研究病毒生命周期(包括其致病过程)至关重要。通过本文所述的方法,可获得高达 3 × 106 焦点形成单位/毫升(FFU/mL)的非包膜型HEV病毒滴度,以及高达 5 × 104 FFU/mL 的包膜型HEV病毒滴度。利用这些病毒颗粒,可以感染多种来源的细胞,包括原代细胞以及人源和动物源性细胞系。通过质粒产生具有感染性的HEV颗粒,可提供无限的病毒来源,使该实验方案极为高效。
戊型肝炎是一种相对常见的 患病率在全球范围内被低估的疾病。每年约有2000万例感染,导致超过70,000人死亡1. 其致病因子戊型肝炎病毒(HEV) recently 被重新分类,现归属于科 Hepeviridae 包括正肝炎病毒属(Orthohepevirus)和鱼肝炎病毒属(Piscihepevirus)。来源于不同宿主的HEV被归类于正肝炎病毒属A至D种,包括来自人类、猪、兔、大鼠、鸟类及其他哺乳动物的分离株。2目前,已鉴定出八种不同的正链单股RNA病毒基因型(GT)。2尽管它们在序列同源性、传播途径和地理分布上存在差异,但其基因组结构高度保守。具体而言,7.2 kbp的HEV基因组分为三个主要的开放阅读框(ORF1-3)。其中,ORF1编码宿主细胞内成功复制所需的所有酶,ORF2编码衣壳蛋白,而ORF3蛋白则作为功能性离子通道,参与感染性病毒颗粒的组装与释放。3一旦释放到基底侧或顶侧腔隙中,HEV会以准包膜型和无包膜(裸露)型两种形式存在,具体形式取决于病毒来源于血液还是粪便。4,5.
虽然GT1和GT2主要存在于发展中国家,仅通过粪-口途径感染人类6,但GT3、GT4和GT7则主要出现在发达国家1,7,多种动物可作为其储存宿主,例如猪8、大鼠9、鸡10,11、鹿12、獴13、蝙蝠14、兔子15,16、野猪17等众多物种7,18,19,表明存在人畜共患传播的证据7,20,21,22。除了卫生条件不良23和受污染的食品12,24,25,26外,HEV还可通过输血和器官移植传播27,28。HEV是导致肝硬化和肝功能衰竭的常见原因29,尤其在已有肝病的患者、免疫功能低下者(基因型3、4和7)以及孕妇(基因型1)中更为严重。值得注意的是,HEV还可引起肝外表现,如造血系统疾病30,31,32、神经系统疾病33和肾脏损伤34。
迄今为止,超说明书用药利巴韦林(ribavirin, RBV)仍是许多感染患者的首选治疗方案35,36。然而,已有治疗失败及临床长期预后不佳的病例报道。治疗失败与慢性感染患者体内病毒的诱变作用及病毒异质性增加相关37,38,39。相反,最近一项欧洲回顾性多中心研究未能将聚合酶突变与RBV治疗失败相关联40。在临床观察和体外实验中,干扰素41,42,43、索非布韦44,45、锌盐46以及银莲花素(silvestrol)47,48也显示出抗病毒作用。尽管如此,由于对戊型肝炎病毒(HEV)生命周期及其致病机制的认识仍不足,特异性HEV治疗方案的开发仍受到阻碍。因此,迫切需要建立一个稳定的细胞培养系统,用于病毒学研究及新型抗病毒药物的开发49。
遗憾的是,与其他肝炎病毒类似,戊型肝炎病毒(HEV)在常规细胞系中难以增殖,通常进展非常缓慢,导致病毒载量较低。尽管如此,一些研究团队通过建立细胞系亚克隆50或调整培养基添加剂51,成功提高了病毒载量。最近,cDNA克隆的构建52以及通过连续传代适应细胞培养的原代患者分离株53,54进一步改善了HEV在体外细胞培养中的增殖能力55。在本实验方案中,我们使用了适应细胞培养的Kernow-C1株基因组(称为p6_WT)54 ,以及携带复制增强突变的突变株(称为p6_G1634R)37。Kernow-C1是HEV体外培养中最常用的毒株,能够产生较高的病毒载量。通过检测病毒RNA拷贝数,可在体外监测HEV的复制情况。然而,这些技术无法评估所产生的具有感染性病毒颗粒的数量。因此,我们建立了免疫荧光染色法以测定焦点形成单位(FFU/mL)。
本文所述方法56可用于产生全长的感染性病毒颗粒,这些病毒颗粒能够感染多种来源的细胞类型,包括原代细胞和哺乳动物细胞系。这是解析HEV感染机制和嗜性特征的重要前提。该方法无需依赖通常数量有限的患者分离株进行接种。通过质粒生产感染性HEV颗粒可提供无限的病毒来源,使本实验方案具有较高的效率。此外,该系统可用于反向遗传学研究,从而分析在体内发现的基因组变异及其对HEV复制能力和适应性的影响。该技术克服了诸多限制,可为药物开发、诱变研究以及病毒与宿主相互作用(如限制因子或病毒进入因子)的评估开辟新途径。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
注意:所有实验均在生物安全二级(BSL-2)条件下进行。所有接触过戊型肝炎病毒RNA或感染性病毒的材料,在丢弃前必须在生物安全柜内的废液容器中用4% Kohrsolin FF充分冲洗。
1. 质粒制备
2. 线性化与DNA纯化

图1:质粒线性化与DNA纯化的实验示意图。 请点击此处查看该图的高清版本。
注意:线性化可增加体外转录过程中的RNA产量(步骤3)
3. 全长HEV基因型3 p6 DNA的体外转录及RNA纯化

图2:实验装置示意图 体外 转录与RNA纯化 请点击此处以查看此图的放大版本。
注意:体外转录是利用质粒 DNA 制备病毒基因组 RNA 所必需的步骤。
4. 用于细胞培养衍生的HEV(HEVcc)生产的HepG2细胞的制备

图3:用于制备细胞培养来源的戊型肝炎病毒(HEVcc)的HepG2细胞的示意图实验流程。 请点击此处查看该图的放大版本。
注意:为避免污染,细胞制备、电穿孔、感染、收获及细胞固定均在生物安全二级设施内的无菌条件下进行。涉及细胞的 37 °C 培养步骤均在含 5% CO2 的培养箱中完成。
5. HepG2 细胞的电穿孔

图4:HepG2细胞电穿孔的示意图实验装置。 请点击此处查看该图的放大版本。
6. 收获细胞内和细胞外的HEVcc

图5:收获细胞内和细胞外HEVcc的实验流程示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。
7. 胞内和胞外HEVcc对HepG2/C3A细胞的感染

图6:HepG2/C3A 细胞感染细胞内和细胞外 HEVcc 的实验设计示意图。 请点击此处查看该图的高清版本。
注意:HepG2/C3A 细胞的感染应确保已产生感染性病毒颗粒。此外,通过测定收获的细胞内和细胞外 HEVcc 的滴度,可计算病毒滴度(单位为 FFU/mL)。此步骤后续将被称为感染对照(IC)。
8. 转染与感染对照的免疫荧光染色

图7:转染与感染对照的免疫荧光染色实验示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。
9. FFU 测定
注意:一个蚀斑形成单位(FFU)定义为一个或多个ORF2阳性细胞,其与另一个蚀斑形成单位之间至少被三个阴性细胞隔开。


访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
在本实验方案中,我们描述了高滴度感染性HEVcc的制备方法。第一步是分离质粒DNA(pBluescript_SK_HEVp654 和 pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37,图8a),随后通过限制性酶切将其线性化,并纯化用于体外转录(图1)。可通过琼脂糖凝胶电泳比较未酶切与酶切后的质粒DNA,以验证线性化是否成功。除出现大小迁移外,仅应观察到一条代表线性化形式的DNA条带。当位于线性化条带上、下两侧分别代表切口环状和超螺旋形式的两条额外条带完全消失时,表明线性化已完全(图8b)。纯化所得DNA的浓度应超过150 ng/µL。只有满足上述条件的线性化DNA方可用于体外转录。体外转录所得RNA也应通过凝胶电泳进行检测,若RNase污染较少,则应呈现清晰分明的条带,而非弥散的涂抹状(图8c)。...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
从质粒制备开始,DNA 产量应超过 150 ng/µL,以便能够从同一质粒储备中进行 多次线性化,从而最大限度地降低细菌诱导关键基因组序列突变的风险。此外,必须通过凝胶电泳检测限制性酶切是否实现了质粒的完全线性化(图 8b)。若缺乏线性化的质粒 DNA,将引发滚环扩增,导致体外转录效率降低。另外,应确认 RNA 的完整性,以评估样品中 RNase 的含量(图 8c)。只有在完成上述步骤后,才可考虑对靶细胞进行电穿孔。需要注意的是,在开始 HepG2 细胞制备前,务必确保所有物品均已准备就绪,避免出现长时间等待。特别是,细胞和 RNA 在电穿孔前应短暂保存于 Cytomix 中。为防止电穿孔过程中细胞受热,必须提前将缓冲液置于冰上预冷。电脉冲持续时间不应超过 20–25 ms,电压为 270 V。电穿孔后,细胞需迅速转移至新鲜培养基中,以确保细胞存活率。在感染靶细胞前,应检测转染细胞(TC)中 ORF2 阳性细胞的比例。如果转染细胞中未检测到 ORF2 阳性细胞,则很可能是电穿孔失败或染色未成功,此时应重复实验...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者无任何利益冲突需要披露。
我们感谢Suzanne Emerson提供的戊型肝炎病毒p6克隆。HEV特异性兔高免血清由德国弗里德里希·勒夫勒研究所的Rainer Ulrich慷慨提供。此外,我们感谢波鸿鲁尔大学分子与医学病毒学系所有成员给予的支持与讨论。图1-7使用BioRender.com生成。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.45 µm 网格 | Sarstedt | 83.1826 | 收集细胞外病毒 |
| 4 % Histofix | CarlRoth | P087.4 | 免疫荧光 |
| 乙酸 | CarlRoth | 6755.1 | 胶原工作液 |
| Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | 病毒收获 |
| 氨苄青霉素 | Sigma-Aldrich | A1593 | 转化细菌筛选 |
| ATP | Roche | 11140965001 | 体外转录与电穿孔 |
| BioRender | BioRender | 图像生成 | |
| CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
| 0.4 % 无菌胶原R溶液 | Serva | 47256.01 | 胶原工作液 |
| CTP | Roche | 11140922001 | 体外转录 |
| 电穿孔杯 | Biorad | 165-2088 | 电穿孔 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | 免疫荧光 |
| DMEM | gibco | 41965-039 | 细胞培养 |
| DNA酶 | Promega | M6101 | 体外转录 |
| DTT | Promega | 包含于P2077中 | 体外转录 |
| EGTA | Roth | 3054.3 | Cytomix |
| 大肠杆菌 JM109 | Promega | L2005 | 转化 |
| 胎牛血清 | gibco | 10270106 | 细胞培养 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | 免疫荧光 |
| GenePulser Xcell 电穿孔系统 | BioRad | 1652660 | 电穿孔 |
| 庆大霉素 | gibco | 15710049 | 细胞培养 |
| GTP | Roche | 11140957001 | 体外转录 |
| H2O | Braun | 184238001 | 免疫荧光 |
| Hepes | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
| 马血清 | gibco | 16050122 | 免疫荧光 |
| K2HPO4 | Roth | P749.1 | Cytomix |
| KCL | Roth | 6781.3 | Cytomix |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | Cytomix |
| L-谷氨酰胺 | gibco | 25030081 | 细胞培养 |
| 还原型L-谷胱甘肽 | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
| MEM | gibco | 31095-029 | 细胞培养 |
| MEM 非必需氨基酸(100×) | gibco | 11140-035 | 细胞培养 |
| MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
| 微量紫外-可见分光光度计 NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | DNA/RNA 浓度测定 |
| MluI 酶 | NEB | R0198L | 线性化 |
| NEB 缓冲液 | NEB | 包含于 R0198L 中 | 线性化 |
| NucleoSpin 质粒提取试剂盒 | Macherey & Nagel | 740588.250 | 质粒制备 |
| NucleoSpin RNA 纯化试剂盒 | Macherey & Nagel | 740948.250 | RNA 纯化 |
| PBS | gibco | 70011051 | 细胞培养 |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher | 15140122 | 细胞培养 |
| 编码全长HEV基因组的质粒(p6_G1634R) | Todt 等 | 病毒生产 | |
| 编码全长HEV基因组的质粒(p6_WT) | Shukla 等 | GenBank 登录号 JQ679013 | 病毒生产 |
| 一抗 1E6 | LS-Bio | C67675 | 免疫荧光 |
| 一抗 8282 | 德国弗里德里希-勒弗勒研究所 Rainer Ulrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 | Qiagen | 27106 | DNA 提取 |
| Ribo m7G 加帽类似物 | Promega | P1711 | 体外转录 |
| RNase away | CarlRoth | A998.3 | RNA 纯化 |
| RNasin(RNase抑制剂) | Promega | N2515 | 体外转录 |
| 二抗 驴抗小鼠 488 | Thermo Fisher | A-21202 | 免疫荧光 |
| 二抗 山羊抗兔 488 | Thermo Fisher | A-11008 | 免疫荧光 |
| 丙酮酸钠 | gibco | 11360070 | 细胞培养 |
| T7 RNA 聚合酶 | Promega | P2077 | 体外转录 |
| 转录缓冲液 | Promega | 包含于 P2077 中 | 体外转录 |
| 吐温 X-100 | CarlRoth | 3051.3 | 免疫荧光 |
| 胰蛋白酶-EDTA(0.5 %) | gibco | 15400054 | 细胞培养 |
| 超低IgG | gibco | 1921005PJ | 细胞培养 |
| UTP | Roche | 11140949001 | 体外转录 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。