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方法文章

一种用于缺血性肾损伤小鼠模型肾脏中 microRNA 定量检测的方法

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DOI：

10.3791/61378

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2020年9月11日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用实时定量反转录聚合酶链式反应检测急性肾损伤小鼠模型肾脏中微小RNA表达水平的实验方案。该方案重点针对缺血性肾损伤小鼠模型，并强调微小RNA样本的精细提取过程。

摘要

微小RNA（miRNA）参与多种疾病状态，在小鼠疾病的早期诊断和治疗中可作为有效的生物标志物。然而，目前尚未建立针对急性肾损伤（AKI）小鼠肾脏中miRNA纯化及其表达检测的标准操作流程。本研究建立了一种高效且简便的实验方案，用于在通过肾缺血-再灌注诱导的AKI小鼠模型中，利用实时定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）对肾脏中的miRNA进行纯化和定量分析。该方案包括五个步骤：1）通过肾缺血-再灌注诱导AKI；2）采集肾脏组织；3）从肾脏中提取包含miRNA在内的总RNA；4）通过miRNA的反转录合成cDNA；5）采用qRT-PCR检测miRNA的表达水平。利用本方案，可构建出轻度至重度不同表型的肾缺血-再灌注损伤AKI模型。此外，若严格按照操作流程执行，可获得个体差异极小、表型稳定的AKI模型。该qRT-PCR检测方法具有极宽的动态检测范围，能够区分成熟miRNA，并以高特异性实现准确量化。本方案可用于研究AKI肾脏中miRNA的表达谱。

引言

肾脏缺血-再灌注损伤（IRI）是急性肾损伤（AKI）发生的主要危险因素之一1。AKI 在患者预后中具有重要意义，但目前尚未建立特异性治疗手段和早期诊断生物标志物。

microRNA（miRNA）是一类短链非编码RNA，长度约为18–25个碱基。miRNA在体液中具有较高的稳定性，且其序列在动物中高度保守2。miRNA通过调控数千个靶基因，调节多种蛋白质的表达，从而影响多种信号通路2,3,4,5,6,7,8。近年来研究表明，miRNA参与多种疾病状态的发生发展，并可作为多种疾病早期诊断的有效生物标志物。

本实验方案的总体目标是成功纯化并检测由缺血-再灌注损伤（IRI）诱导的急性肾损伤（AKI）小鼠模型肾脏中的miRNA。该IRI模型是急性肾损伤和肾纤维化研究中广泛使用的模型。IRI模型的优点包括能够直观确认是否实现了缺血-再灌注，并能确定AKI发生的准确时间。然而，夹闭时间过长虽可导致广泛的肾小管损伤，但伴随较高的死亡率；而夹闭时间过短则不会引起肾小管损伤，从而导致该实验模型中肾小管损伤进展存在较大变异性。与双侧夹闭模型相比，单侧肾IRI模型中所采集的对侧肾切除组织可作为对照，并确保肾功能衰竭的发生。

使用玻璃匀浆器研磨肾脏样品，从中分离蛋白质和核酸，并进一步分离DNA和RNA9。采用基于二氧化硅膜的离心柱法从肾脏样品中纯化总RNA（包括miRNA）9。随后，以总RNA为模板，利用多聚腺苷酸酶和寡核苷酸-dT引物进行cDNA合成（逆转录）10。最后，通过使用嵌入染料的qRT-PCR检测miRNA的表达水平10。与终点法PCR扩增产物量的检测相比，qRT-PCR能够更准确地定量基因表达。qRT-PCR可测量高浓度样品，且具有宽广的动态范围，其定量结果依赖于循环次数，因而更为精确。既往研究报道，简单的操作流程即可有效纯化并检测组织中的miRNA8,9,10。本实验方案中所述的cDNA合成（逆转录）及利用嵌入染料进行qRT-PCR检测miRNA表达的方法，已被证实具有高准确性和高灵敏度10。

此外，该方案操作简便，且在不同实验室之间具有良好的重复性。因此，该方案适用于需要在小鼠急性肾损伤（AKI）肾脏中进行高精度和高灵敏度miRNA检测的研究。

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方案

所有动物实验方案均经日本医科大学动物伦理委员会批准，并依照日本医科大学实验动物使用与护理指南中的规定进行。

1. IRI 模型

注意：在整个操作过程中需密切监测低体温、肠道湿润度及麻醉深度。

  1. 准备以下物品：一个含有浸透异氟烷的棉球的50 mL离心管、加热手术垫、盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿、无菌手术刀片和无菌镊子。将PBS维持在37 °C。
    注意：本缺血-再灌注损伤（IRI）模型使用雄性C57BL/6小鼠（9周龄，20–25 g）建立，小鼠饲养于温度、湿度受控且具有12小时光照-黑暗循环的环境中。
  2. 使用异氟烷麻醉动物：诱导浓度为3%–5%，维持浓度为2%–3%，夹闭期间浓度为1%–1.5%。为防止麻醉期间角膜干燥，需在眼睛上涂抹眼用软膏。通过反射消失确认麻醉深度。吸入麻醉的优点是可灵活调整麻醉时间。由于需要剥离肾脏周围组织，手术可能耗时较长。然而，吸入麻醉的缺点是容易导致体温下降。在夹闭期间应维持足够的麻醉深度以防止对足趾夹捏产生反应，同时避免不必要的深度麻醉。
  3. 将麻醉后的小鼠仰卧固定于加热手术垫上，去除切口区域周围的毛发，并使用含氯己定的消毒液和70%乙醇对小鼠腹部皮肤进行消毒 。术前30分钟皮下注射布托啡诺，剂量为0.1 mg/kg。
  4. 使用手术刀片和镊子在腹部皮肤、肌肉和腹膜上做正中切口。
  5. 用PBS润湿的棉签轻轻将肠管推向腹腔外左侧，暴露右侧肾脏和输尿管。手术时间过长可能导致术后肠道损伤。因此，若能获得足够视野，建议不将肠管完全移出腹腔进行操作。避免肠道干燥。干燥的棉签或纱布可能造成肠道损伤。
  6. 用弯头镊子提起右侧输尿管，使用4/0编织丝线对右侧输尿管进行双重结扎。在两道结扎线之间剪断输尿管，保留靠近肾脏一侧的结扎线较长。
  7. 小心握住残留的结扎线，避免过度牵拉，钝性分离沿肾脏走行的结缔组织和脂肪组织。将肾脏轻柔牵出体外进行操作可降低对肝脏造成物理损伤的风险。
    1. 识别除肾上腺动静脉以外为右肾供血的血管，并予以结扎或夹闭。当右肾充分游离后，使用4/0编织丝线结扎右肾动脉和静脉。也可使用止血夹替代缝合。
    2. 用PBS润湿的棉签将肠管轻轻推向腹腔外右侧，暴露左肾，随后用湿润敷料覆盖肠管以防止其干燥。分离左肾周围的结缔组织和脂肪组织。
  8. 识别除肾上腺动静脉以外为左肾供血的血管，并予以结扎或夹闭。夹闭左肾动脉和静脉以诱导左肾缺血。止血夹应置于距离肾脏约1 cm处，以避免损伤肾实质。成功的缺血可通过肾脏颜色逐渐均匀变暗在视觉上确认。
  9. 将肠管复位回腹腔，注意避免肠管扭转；暂时关闭腹部皮肤并覆盖敷料以维持湿润环境。在夹闭期间维持适当的麻醉深度以防止对足趾夹捏产生反应，同时避免不必要的深度麻醉。夹闭时间为25–45分钟。更长的夹闭时间会导致更严重的肾损伤，但也会增加长期死亡率。可根据病理学结果进行调整。
  10. 缺血期结束后移除止血夹。确保血流再灌注恢复且肾脏颜色改善。在关闭腹部皮肤前确认肠管无扭曲。在腹壁分两层缝合前，腹腔内注射PBS作为液体补充。使用4-0尼龙线缝合腹部皮肤。对于较长的肾脏缺血时间，分别缝合腹壁和腹膜可能有助于减少肠粘连的发生。
  11. 为降低术后感染风险，对手术区域涂抹抗菌剂（如碘-酒精溶液）。根据需要皮下注射布托啡诺，剂量为0.1 mg/kg。

2. 肾脏样本采集

注意：本实验采用 45 分钟夹闭时间，于 24 小时后采集肾脏。

  1. 用5%异氟烷麻醉动物，并通过反射消失确认麻醉深度。
  2. 使用剪刀和镊子在腹部皮肤、肌肉和腹膜上做正中切口。用27 G针头穿刺下腔静脉采集血液。
  3. 在胸壁做正中切口，将23 G针头插入左心室，确认回血。在肝脏上做切口并注入20 mL PBS。随着血液排出，肝脏颜色由红色变为粉红色，表明血液已充分排出。
  4. 用镊子和剪刀取出左肾，在培养皿中用PBS冲洗。用镊子去除肾筋膜，注意避免肾脏干燥。
  5. 将肾脏切成两半，一半用于组织病理学检查，另一半用于下一步实验。避开肾盂，取30 mg肾组织，使用前保存于−80 °C。

3. 从肾脏样本中纯化miRNA

注意：此处使用玻璃匀浆器和微型离心柱中的生物聚合物剪切系统，对重约30 mg的肾脏样品进行匀浆处理。随后，采用基于二氧化硅膜的离心柱法从肾脏样品中分离miRNA。

  1. 准备以下物品：1.5 或 2.0 mL 微量离心管、100% 乙醇、氯仿、玻璃匀浆器、冰、置于微量离心柱中的生物聚合物剪切系统9、基于二氧化硅膜的离心柱9、基于苯酚/胍的裂解试剂、含胍和乙醇的洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 1）以及含乙醇的洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 2）。
  2. 将 30 mg 肾组织样本放入玻璃匀浆器中，并加入 700 µL 基于苯酚/胍的裂解试剂。此步骤需在冰上操作，因为组织对热敏感，易发生变性。
  3. 通过缓慢旋转研杵轻压样本，对肾组织进行匀浆。在冰上重复该过程数十次，直至肾组织完全溶解于基于苯酚/胍的裂解试剂中。若后续检测未能获得 miRNA，可能原因在于组织溶解不充分。
  4. 为进一步匀浆，将匀浆后的裂解液转移至置于 2.0 mL 收集管中的微量离心柱式生物聚合物剪切系统中。在室温下以 14,000 × g 离心 3 分钟。
  5. 将匀浆后的裂解液转移至新的微量离心管中。
  6. 向匀浆裂解液中加入 140 µL 氯仿，并牢固盖紧管盖。通过反复倒置混匀 15 秒。
  7. 在室温下孵育 2–3 分钟，随后在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。
  8. 将上清液（通常为 300 µL）小心转移至新的微量离心管中，避免扰动沉淀，并加入 1.5 倍体积（通常为 450 µL）的 100% 乙醇。通过涡旋振荡混匀 5 秒。
  9. 用移液器将最多 700 µL 样品加入置于 2.0 mL 收集管中的基于二氧化硅膜的离心柱中。盖紧柱盖，在 15,000 × g 下离心 15 秒。离心后，弃去收集管中的穿流液。
  10. 向基于二氧化硅膜的离心柱中加入 700 µL 洗涤缓冲液 1，彻底清洗样本。盖紧柱盖，在 15,000 × g 下离心 15 秒。离心后，弃去收集管中的穿流液。
  11. 向基于二氧化硅膜的离心柱中加入 500 µL 洗涤缓冲液 2，以去除任何残留的盐分。盖紧柱盖，在 15,000 × g 下离心 15 秒。离心后，弃去收集管中的穿流液。
    1. 重复步骤 3.11。
  12. 再次将基于二氧化硅膜的离心柱在 15,000 × g 下离心 1 分钟。离心后，弃去收集管中的穿流液。
  13. 将基于二氧化硅膜的离心柱放入新的 1.5 mL 收集管中。向柱中转移 25 µL 无 RNase 水，盖紧柱盖。在室温下静置 5 分钟，然后在 15,000 × g 下离心 1 分钟。
  14. 将含有 miRNA 的 25 µL 洗脱液转移至新的微量离心管中。由于 miRNA 在反复冻融过程中易降解，建议将样本分装至 2 或 3 个管中。使用前于 −80 °C 保存。

4. miRNA 的逆转录

注意：此处使用逆转录酶、poly(A)聚合酶和oligo-dT引物，将1.0 µg的分离RNA进行逆转录。

  1. 准备以下物品：1.5 mL 微量离心管；8 孔条状管；无 RNase 水；冰；含有脱氧核苷酸、核糖核苷三磷酸和 oligo-dT 引物的 10x 核酸混合液；poly(A) 聚合酶与逆转录酶混合液；以及激活缓冲液，包括 Mg2+、脱氧核糖核苷酸、oligo-dT 引物和随机引物10。
  2. 配制主混合液，每管总量为 8.0 µL，包含 2.0 µL 10x 核酸混合液、2.0 µL poly(A) 聚合酶与逆转录酶混合液，以及 4.0 µL 5x 激活缓冲液（含 Mg2+、脱氧核糖核苷酸、oligo-dT 引物和随机引物）。
  3. 将 8.0 µL 主混合液加入每根离心管中。
  4. 向每根管中加入 1.0 µg 从肾组织样本中分离纯化的 miRNA。
  5. 用无 RNase 水补加至每管总体积为 20 µL，通过移液器反复吹打充分混匀，并在 1,500 x g 条件下离心 15 秒。
  6. 将样品在 37 °C 下孵育 60 分钟，随后立即在 95 °C 下孵育 5 分钟。此步骤可在热循环仪中进行。
  7. 将 cDNA 转移至新的微量离心管中，并用无 RNase 水稀释 10 倍（1:10）。
  8. 稀释后的 cDNA 可短期保存在冰上，长期保存则需置于 −80 °C，使用前取出。

5. miRNA 的 qRT-PCR

注意：miRNA 的 qRT-PCR 采用嵌合染料法进行。此处使用了针对 U6 小核 RNA-2（RNA-2）、miRNA-17-5p、miRNA-18a-5p、miRNA-21a-5p、miRNA-132-3p、miRNA-212-3p、miRNA-223-3p 和 miRNA-574-5p 的引物。

  1. 准备以下物品：1.5 mL 微量离心管、用于 qRT-PCR 的 96 孔反应板、96 孔反应板用粘性封膜、miRNA 特异性引物、包含 Taq DNA 聚合酶、PCR 缓冲液、脱氧核苷酸和通用引物10 的 PCR 主混合液，以及实时 PCR 仪器。
  2. 为每孔配制主混合液，包含 12.5 µL 的 2x PCR 主混合液、2.5 µL 溶解于无核酸酶水中的 miRNA 引物（5 µM）以及 1.25 µL 的 10x 通用引物。
  3. 将 22.5 µL 主混合液加入 96 孔板的每个孔中。
  4. 向每个孔中加入 2.5 µL 模板 cDNA。
  5. 使用 96 孔反应板粘性封膜密封反应板，随后在 1,000 × g 条件下离心 30 秒。
  6. 使用实时 PCR 仪器及配套软件运行 PCR 扩增程序，步骤如下：
    1. 将反应板放入实时 PCR 仪器中，利用实时 PCR 软件为每孔的样品和目标 miRNA 指定名称。
    2. 根据说明书，在实时 PCR 软件中设置以下扩增程序：95 °C 预变性 15 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 15 秒、55 °C 退火 30 秒和 70 °C 延伸 30 秒。
  7. 使用实时 PCR 仪器的软件分析 qRT-PCR 数据，检查是否存在非特异性反应。通过分析解离曲线或熔解曲线，确认未发生非目标扩增。
    1. 以 RNU-6 作为内参对照，对目标 miRNA 的表达水平进行标准化处理，并采用 2−ΔΔCT 法11 计算目标 miRNA 的相对表达水平。

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结果

本研究探讨了急性肾损伤（AKI）小鼠中的miRNA表达谱。目前，miRNA表达谱已在小鼠的多种器官和组织中得到研究。miRNA是重要的转录后调控因子，现已被广泛应用于包括急性肾损伤（AKI）在内的多种疾病的特征分析中。miRNA有望帮助阐明病理状态，并可用于AKI的治疗12。AKI的主要病因包括缺血-再灌注损伤（IRI）、肾毒性损伤和脓毒症。肾脏的缺血-再灌注损伤（IRI）是导致AKI发生的主要危险因素之一。已有大量研究报道多种miRNA参与了AKI的发生发展过程13。

本研究采用此处所述方案，探究了在脓毒症和缺血-再灌注损伤（IRI）模型中均发生改变的miRNA。根据微阵列分析结果，筛选出在急性肾损伤（AKI）小鼠肾脏中表达上调的17种miRNA，并进一步研究其中已有报道在人体中表达的7种miRNA。通过本论文所述qRT-PCR方案检测发现，与假手术小鼠相比，IRI小鼠肾脏中6种miRNA（miRNA-17-5p、miRNA-18a-5p、miRNA-21a-5p、miRNA-132-...

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讨论

根据本文所述方案，成功从缺血-再灌注损伤（IRI）小鼠的肾脏中纯化出miRNA，并通过qRT-PCR进行检测。在该方案中诱导IRI过程的关键点包括对体温和麻醉浓度的密切监控，这些因素已知会影响急性肾损伤（AKI）20。本方案的优势在于能够直观确认是否已实现缺血-再灌注。然而，该IRI模型也存在一些局限性。延长夹闭时间以诱导严重缺血会增加动物死亡率。此外，若使用左肾动脉夹闭未能实现肾缺血，原因可能是除肾动脉和肾静脉外的其他向肾供血血管未被结扎或夹闭。诱导AKI的替代方法还包括药物注射（如叶酸、马兜铃酸、顺铂、庆大霉素、甘油、L-咪唑啉、CoCL2、卡那霉素和呋塞米）。与药物诱导的AKI模型相比，本模型可精确确定AKI的发生时间，且AKI分期的个体差异极小。与双侧肾缺血模型相比，采用本文所述方案可更可靠地诱导IRI。在本模型中，易于在IRI前后给予药物干预，包括应用调控基因或蛋白的miRNA或相关化合物，且切除的右侧肾组织可作为对照使用。

本方案中关于miRNA纯化有三个关键点。第一，必须在冰上提取总RNA，因为mi...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

感谢 Nam Nguyen 博士对本文初稿的编辑。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无钩弯头锥形镊子Natsume SeisakushoMA-47
Buffer RLTQiagen79216洗涤缓冲液1
Buffer RWTQiagen1067933洗涤缓冲液2
C57B6小鼠SLC未分配
带齿镊子Natsume SeisakushoMA-49
无齿镊子Natsume SeisakushoMA-48-1
止血夹Natsume SeisakushoKN−353
用于qRT-PCR的MicroAmp光学96孔反应板Thermo Fisher Scientific431681396孔反应板
MicroAmp光学粘性封膜Thermo Fisher Scientific431197196孔反应板用粘性封膜
miRNA-132-3p引物QiagenMS000034585'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG
miRNA-17-5p引物QiagenMS000292745'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
miRNA-18a-5p引物QiagenMS000315145'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG
miRNA-212-3p引物QiagenMS000038155'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC
miRNA-21a-5p引物QiagenMS000090795'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
miRNA-223-3p引物QiagenMS000038715'UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA
miRNA-574-5p引物QiagenMS000436175'UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU
miRNeasy Mini试剂盒Qiagen217004基于硅胶膜的离心柱
miScript II RT试剂盒Qiagen218161
miScript SYBR Green PCR试剂盒Qiagen218073
QIA shredderQiagen79654微型离心柱中的生物聚合物破碎系统
QIAzol裂解试剂Qiagen79306基于苯酚/胍的裂解试剂
QuantStudio 12K Flex实时荧光定量PCR系统Thermo Fisher Scientific4472380实时荧光定量PCR仪器
QuantStudio 12K Flex软件版本1.2.1Thermo Fisher Scientific4472380实时荧光定量PCR仪器软件
RNU6-2引物QiagenMS00033740未公开
手术剪Natsume SeisakushoB-2
血管夹施夹器VITALITEC1621420

参考文献

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