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方法文章

大鳞鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）鳃耙黏液的宏观流变学表征

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DOI：

10.3791/61379

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2020年7月10日

 ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, The George Washington University

本文内容

摘要

本方案介绍了一种对鲢鱼鳃耙（GRs）上附着的黏液进行流变学表征的方法。通过测量黏度、储能模量和损耗模量，获得GR-黏液的黏弹性特征，并据此评估其表观屈服应力，以理解鳃耙中的滤食机制。

摘要

鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）是一种入侵性的以浮游生物为食的滤食性鱼类，因其高效的滤食机制而侵入了密西西比河上游流域的天然水道。许多此类滤食性鱼类具有称为鳃耙（GRs）的特征性器官，有助于高效过滤大小为几微米的食物颗粒，例如浮游植物。

研究银鲫鳃耙黏液流变学特性的动机源于我们希望理解其在滤食过程中所起的作用。富含黏液的流体在“浓稠且黏滞”的状态下，可能有助于食物颗粒的黏附。该流体在鳃耙膜中的渗透与传输过程 在外加剪切力诱导出不同剪切应变速率的作用下，黏液流变学特性可为揭示鲢在滤食性鱼类中的显著竞争优势提供重要线索。据此推测，鲢的黏液可能具有黏附食物颗粒的功能，并可作为运输载体，协助完成滤食过程。

本实验方案的主要目的是测定黏液的屈服应力，即在具有结构的黏弹性材料中首次观察到不可逆塑性变形时，引发流动所需的最小剪切应力。因此，采用旋转流变仪研究了胃肠道黏液（GR黏液）的流变学特性，包括其非牛顿流体特性和剪切稀化行为下的黏度、储能模量和损耗模量。 

本方案用于分析从密苏里河哈特溪（Hart Creek）捕获的鲢鱼的鳃耙中提取的黏液的流变特性。该方案旨在建立一种有效的策略，以对假设为具有结构的黏弹性材料的黏液进行流变学测试和材料表征。

引言

鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）是一种以浮游生物为食的滤食性鱼类，属于入侵物种，已侵入美国多个天然水道。该物种最初被引入上密西西比河流域，用于控制藻华1,2,3。鲢鱼的摄食效率极高，通常可摄取的食物颗粒大小范围从4至20 μm的微小颗粒，到约80 μm大小的较大浮游动物3,4,5。该物种已排挤了其他本地鱼类，并可能通过限制资源可及性对本地水体生态系统造成巨大破坏1,2,6。因此，鲢鱼和鳙鱼等滤食性鱼类对五大湖构成了重大威胁1,2,6,7,8。

滤食性鱼类具有一种称为鳃耙（gill rakers, GRs）的特殊器官，其表面覆盖有一层薄薄的黏液。这些结构可提高从流入液体中过滤和聚集微小颗粒的效率。本实验方案旨在表征从银鲫（silver carp）鳃耙内表面获取的鳃耙黏液的非牛顿流体特性，具体包括其剪切稀化行为及屈服应力。本研究重点关注利用旋转流变仪测定的鳃耙黏液屈服应力值。所测得的屈服应力，也称为“表观屈服应力”，其数值依赖于测试方法，例如稳态剪切速率法或动态振荡应变法9,10。这种具有剪切稀化特性的“屈服应力流体”在施加的应力达到临界值时，会从类固态行为转变为类液态行为9,11。表观屈服应力是指启动流动所需的最小剪切应力，或首次观察到不可逆塑性变形时的应力，此时黏液从类凝胶状态转变为类流体状态。该行为常见于具有结构特征的黏弹性材料中。鳃耙黏液从类凝胶到类流体的转变具有两个功能：一是作为黏附介质以聚集食物颗粒，二是作为运输载体协助颗粒输送与过滤过程。黏液的其他延伸功能包括在疾病抵抗和呼吸过程中形成扩散屏障、实现营养因子、有毒成分及代谢废物的可控释放与排泄、构建摄食与筑巢相关的代谢通路、辅助抵御捕食者，以及通过改变边界层特性来提升运动能力和推进效率12,13,14。

与简单流体不同，黏液等复杂流体的性质会随流动条件而变化，需要额外的测量参数来定义其宏观尺度的物理行为。为了监测鲢鱼胃后肠（GR）黏液的黏度和屈服应力，采用旋转流变仪进行流变学测量。旋转流变仪通过与流体样品接触的旋转圆盘施加稳定或振荡的剪切应力或应变，并测量其响应。采用该仪器和方法的理由在于，流变仪可提供一组测量数据，用于描述鲢鱼胃后肠黏液的材料特性，而这些特性无法仅通过黏度来定义。

黏液是一种具有黏弹性的材料，其在受到外加形变时的力学响应介于纯固体（遵循胡克弹性定律）和纯液体（遵循牛顿黏性定律）之间15,16。黏液内部包含复杂的高分子网络结构，能够在外力或形变作用下发生拉伸和重新取向。旋转流变仪由一个锥形转子和一个帕尔帖温控平板组成，如图1和图2所示（仪器参数详见表1 ）。本研究的目的是 建立一种测定胃反流（GR）黏液流变学特性的实验方案 。与黏度计相比，旋转流变仪的优势在于能够使用少量样品进行动态测量。本研究中GR黏液的样品体积约为1.4 mL。而黏度计则仅限于恒定剪切速率下的测量，且需要较大的样品量。

鲢鱼解剖结构内黏液的流变学特性预期存在显著差异。例如，鳃耙（GR）表面的黏液特性可能与上鳃器官中的黏液不同。为了考虑鱼类不同区域黏液特性的潜在变异性，采集的鳃耙黏液样品被稀释，并配制了三种浓度的溶液，使用旋转流变仪进行测试。执行本方案后报告的有关黏液流变学的数据和结果证明了该测量技术的有效性。本文所展示的示例性数据并不代表整个鲢鱼种群的普遍情况。本文提供的方案可进一步扩展，用于更大样本集的黏液流变学研究，以验证其他假设。

本研究旨在展示三种不同黏液浓度（400 mg/mL、200 mg/mL 和 100 mg/mL）下GR黏液流变学性质的变化。其中400 mg/mL浓度代表从鱼类GR中采集的原始黏液样品。使用去离子水（DI）将原始黏液样品稀释至200 mg/mL和100 mg/mL的浓度。通过稀释黏液样品，可评估剪切稀化程度和表观屈服应力随浓度的变化，并确定GR黏液转变为非牛顿流体行为的 临界浓度。实验中使用摇床破碎样品中可能存在的大块黏液团聚物，以减少因样品不均匀导致的流变学数据误差。

在包括鱼类在内的大多数脊椎动物中，主要的黏液形成大分子是糖蛋白（黏蛋白），它们通过分子链缠结或化学交联在水中膨胀，形成凝胶状物质12,13,17,18,19,20。这些高分子量、可形成凝胶的大分子以及高含水量，使得黏液具有滑腻的特性13。大分子间高度的相互作用导致凝胶的形成，而大分子间相互作用较弱或化学键断裂则产生高黏性液体21。

滤食性鱼类中食物颗粒的过滤过程得益于鳃耙（GR）黏液的相关特性（如内聚力和黏度），这些特性决定了黏液在黏附和黏着性方面的潜力22。基于黏液的黏附强度取决于特定的分子间作用力、静电作用或疏水相互作用23。Sanderson 等人24在黑鱼中开展了一项悬浮物摄食研究，发现了基于黏液黏附的证据。他们指出，悬浮食物颗粒与黏膜表面发生黏附后，黏液将颗粒聚集成团，随后在定向水流作用下将这些团块运输至消化器官24。由水流产生的剪切应变率作用于黏液，有助于将食物颗粒输送至消化器官。研究人员采用内窥镜技术观察了被过滤的颗粒24。

关于GR黏液流变学测试中剪切速率范围及实际限制的文献较为匮乏。因此，本研究参考了针对胃黏液、鼻黏液、宫颈黏液和肺黏液、鲑鱼皮肤黏液、盲鳗黏液以及骨关节表面润滑剂的流变学研究，在这些研究中探讨了其流变学特性及非牛顿流体属性11,12,25,26,27,28,29,30,31。最近，有研究采用恒定剪切速率黏度计，探讨了鱼类皮肤黏液对运动及推进效率的影响。关于 seabream、海鲈和 meagre 皮肤黏液的流变学研究（未进行任何稀释或均质化处理）表明，这些黏液在通常较低的剪切速率下表现出非牛顿流体行为14 。在另一项相关研究中，塞内加尔鳎背侧和腹侧的原始皮肤黏液样品均表现出非牛顿流体特性，且在所有考察的剪切速率下，腹侧黏液的黏度更高32。此外，文献中还报道了利用恒定剪切速率黏度计开展水凝胶支架构建及高浓度悬浮液研究的相关流变学方法33,34。

本研究采用剪切速率可控的旋转流变仪检测GR黏液的流变特性，该仪器已广泛用于复杂生物流体的流变学实验25。对于牛顿流体，其表观黏度保持恒定，不依赖于剪切速率，且剪切应力随剪切应变率呈线性变化（图3A、B）。对于非牛顿流体（如剪切稀化流体），其黏度依赖于剪切速率或形变历史（图3A、B）。损耗模量（G”）反映材料抵抗流动的程度，代表流体的黏性特征（图4）。储能模量（G’）反映材料在应力引起的形变后恢复其原始形状的趋势，等同于弹性（图4）。相位角（δ）或损耗正切值由G”/G’的反正切计算得出，表示能量耗散与储存之间的平衡关系，也是表征黏弹性材料的常用参数（胡克固体δ = 0°；纯黏性液体δ = 90°；黏弹性固体δ < 45°，黏弹性液体δ > 45°）（图4）25。结构化流体中的表观屈服应力（σy）代表一种物态转变，可在稳态扫描和动态应力-应变扫描的流变数据中观察到10。当外加应力小于表观屈服应力时，材料发生弹性形变。当应力超过表观屈服应力（在 图3B中标记为“平均应力”）时，材料将从弹性形变转变为塑性形变，并开始以液态形式流动35。通过在振荡应力（或应变）条件下测定黏液样品的储能模量（G’）和损耗模量（G”），可量化材料状态从类凝胶行为向黏弹性液体行为的转变过程。

本文描述了用于监测与 储能模量（G’）、损耗模量（G”）和表观黏度（η）相关数据的流变仪测试类型。动态振荡测试（应变扫描和频率扫描）在控制锥形几何结构振荡的条件下监测G’和G”。动态应变扫描测试通过监测材料的内在响应来确定黏液的线性黏弹性区域（LVR）（图4）。应变扫描用于在恒定振荡频率和温度下确定材料的屈服行为。动态频率扫描测试则在恒定振幅（应变或应力）和温度下，监测材料对频率（形变速率）递增的响应。在进行动态频率扫描测试时，应变保持在线性黏弹性区域（LVR）内。稳态剪切速率测试在锥形几何结构的稳定旋转条件下监测表观黏度（η）。对GR黏液施加逐步增加的应力，监测不同剪切速率（ý，1/s）下的表观黏度（η，Pa·s）。

本文所述方案将银鲤鳃耙（GR）黏液视为一种具有未知黏弹性且在一定范围内呈现线性黏弹性响应的复杂结构材料。鱼黏液由密苏里河哈特溪（Hart creek）捕捞作业期间采集的银鲤鳃耙中提取，该工作由乔治·华盛顿大学生物科学系的L. Patricia Hernandez教授完成  1,2,36。 银鲤口腔内一组鳃耙的实物图像见图5A，示意图见图5B。离体鳃耙的图像见图5C。 黏液从银鲤鳃耙中提取的过程以示意图形式展示于图5D、E中。所有流变仪测试均在恒定且受控的温度条件下进行，温度设定为22 ± 0.002 °C，即捕捞现场记录的实际温度1,2,36。 每个黏液样品均使用流变仪重复测试三次，最终结果以平均值表示，并包含统计误差棒。

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方案

1. 不同浓度黏液溶液的制备

注意：本实验需配制三种浓度的黏液溶液（分别为 400 mg/mL、200 mg/mL 和 100 mg/mL，对应体积约为 1 mL、1 mL 和 2 mL）。 

  1. 为计算黏液的质量，测量装有（的离心管的平均质量M含黏液 ; mg）且无黏液（M小瓶 ; mg）。然后用含有黏液的离心管质量减去不含黏液的离心管质量（M黏液 = M含黏液 - M小瓶 ; mg).  
  2. 用去离子水将黏液稀释成三种浓度（400、200、100 mg/mL）。
    1. 使用移液器向黏液中加入0.6 mL去离子水，配制浓度为400 mg/mL的黏液溶液。
      注意：由于提取的黏液体积约为1.4 mL，因此400 mg/mL溶液的总体积约为2 mL。
    2. 将400 mg/mL黏液溶液小瓶置于摇床中，确保黏液溶液充分均质化，并减少任何黏液颗粒的聚集。
    3. 使用移液器将一半体积的第一浓度黏液溶液转移至新小瓶中，并向新小瓶中加入1 mL去离子水，配制第二浓度的黏液溶液（200 mg/mL）。
    4. 对含有黏液溶液的第一和第二小瓶重复步骤1.2.2。
    5. 使用移液器将200 mg/mL溶液的一半体积（1 mL）转移至新小瓶中，并加入去离子水，配制浓度为100 mg/mL的黏液溶液。
    6. 对每种浓度的黏液溶液，在相应的样品瓶中重复步骤1.2.2（参见 补充图1).
    7. 将黏液溶液小瓶存放在冰箱中，直至进行流变仪校准和测试。

2. 使用流变仪进行测量和数据采集

注意：本实验方案中用于流变仪仪器控制和数据采集的软件在文中已注明。 材料表 该软件将被称为“流变仪仪器控制软件”。

  1. 设置并校准流变仪仪器。
    1. 打开流变仪的压缩空气供应，并使用气泡水平仪确保气动台和流变仪均已调平。拧下流变仪转轴上的保护帽，并在拧松时固定转轴。
    2. 打开流变仪的主电源开关，以启动流变仪上的磁悬浮轴承。
    3. 打开装有流变仪仪器控制软件的流变仪控制计算机，并启动该软件（参见 补充图2).
    4. 通过选择标签“校准仪器”来执行仪器校准，校准 | 仪器“从软件窗口中选择”仪器“选项。点击”校准“在‘惯性。记录仪器惯性校准值 μN.m.s2 并至少重复校准3次，以确保校准值之间的差异在10%以内（参见 补充材料  图3).
  2. 将流变仪的测量几何体安装到流变仪的转轴上。
    1. 点击“几何形状流变仪仪器控制软件中的“标签”
    2. 用所需几何形状的锥形头（直径40 mm）进行清洁，◦ 0’ 11’’ 锥形) 和含异丙醇的帕尔帖板（参见 表1，材料表, 图1，以及 图2).
      注意：帕尔帖板已安装在流变仪上；可在其直接固定于流变仪的状态下用异丙醇清洁。
    3. 确保帕尔帖板夹具无可见灰尘，必要时用异丙醇清洁。若帕尔帖板尚未预装在流变仪中，则将其安装并连接散热器接口。
    4. 按下“锁定按钮将流变仪上的锁紧装置固定到与锥形几何结构相连的锁轴上。这样可固定轴的位置，但允许其在该位置自由旋转。
    5. 点击“智能切换 | 已启用在流变仪仪器控制软件标签中点击“自动检测几何结构”以启用几何结构的自动识别（参见 补充图4).
    6. 转动流变仪顶部的轴以安装转子。软件将检测到直径为40 mm、1◦ 0’ 11’’ 锥角几何结构在此阶段（参见 表1 和 材料列表).
    7. 重复步骤 2.2.5 – 2.2.6，以确保几何结构被检测到。
    8. 选择‘间隔’ 在“控制面板流变仪仪器控制软件中的“选项’ 图标并选择 ‘轴向力“选项。将轴向力设置为‘1 牛顿’；这是为了确保锥形几何体与帕尔帖板接触，以实现零间隙初始化（参见 补充图5).
  3. 执行流变仪几何结构校准。
    1. 选择标签页，“几何学“从软件窗口中。点击”校准“在‘惯性。记录几何惯性校准值 μN.m.s2 重复此步骤2-3次，以确保校准值之间的差异在10%以内。
    2. 点击“校准“在‘摩擦力软件窗口中记录几何摩擦校准值 μN.m/(rad/s) 并重复此步骤2-3次，以确保校准值之间的差异在10%以内（参见 补充图6).
  4. 执行零间隙初始化
    注意：由于在没有参考“零点”位置的情况下，无法准确地将测量头抬离帕尔贴板进行测量，因此需执行零间隙初始化。出于测量目的，测量头具有内置的几何间隙 24 µm 以及一个修剪间隙 28 µm. 修整间隙的设定旨在有效清除可能溢出几何表面区域的多余液体。这些间隙对于使用样品和流变仪准确测量数据至关重要。步骤 2.4.1 是必须执行的，以确保将几何夹具调至零间隙，从而实现所需的几何间隙和修整间隙 24 µm 和 28 µm分别。
    1. 点击“零间隙“图标”位于“间隔“选项卡中的“控制面板’ 软件窗口中。当几何体所受轴向力大于或等于 1 N 时，表明其已接触帕尔帖板，初始化即完成。应确保流变仪的间隙已归零，以保证其参考位置准确（参见 补充图7 和 补充图8).
    2. 按压‘上下箭头流变仪仪器上的控制装置或‘几何形状的升高与降低“’ 图标在 ‘间隙在流变仪仪器控制软件的“选项卡”中，将测量夹具升至任意高度。流变仪仪器的控制屏幕和流变仪仪器控制软件的控制面板将显示（相同的）间隙高度。
  5. 在流变仪仪器控制软件中设置实验程序。使用锥形-帕尔帖板几何结构表征流变特性，于 22 °C.
    注意：2018年9月20日，在哈特溪（Hart Creek）地点捕捞用于GR黏液实验的银 carp 时，美国地质调查局网站被用于确定该河流的水温36黏液的温度会影响其流变特性。将数值调整至河流温度的意义在于，使其接近能够真实估算黏液特性的实际环境温度。  
    1. 选择标签页，“实验在流变仪仪器控制软件中输入并填写相关信息，例如名称', '操作员', '项目' 等。  （参见 补充图9)
    2. 选择标签页，“几何学’并确保信息与步骤 2.2.5 - 2.2.7 一致（参见 补充图10).
    3. 选择标签页，“步骤，使用设置的箭头键1：振荡幅度步骤。（参见 补充图11).
    4. 初始化环境控制设置如下：“温度 = 22 °C；“浸泡时间 = 120 s”，并勾选“等待温度”复选框（参见 补充图11).
    5. 初始化测试参数设置参数如下：“频率 = 1 Hz”；选择“对数扫描”；“扭矩 = 10 至 10000 μN.m'；“每十倍频程点数 = 5”（参见 补充图11).
  6. 设置实验以测定已知浓度（100 mg/mL）黏液的线性黏弹性范围（LVR）
    1. 使用合适的微量移液器和移液器吸头，吸取约 0.3 mL 浓度为 100 mg/mL 的鱼黏液溶液（参见步骤 1.2）， 材料表).
    2. 使用微量移液器将黏液溶液加入Peltier板上（参见 图2).
    3. 按压‘修剪间隙点击流变仪上的“下降”按钮，使测量几何部件下降至帕尔帖板上。或者，点击“修剪间隙“’ 图标位于“间隙“选项卡中的“控制面板流变仪仪器控制软件中的“选项”（参见 补充图12).
    4. 使用移液枪配合枪头移除多余的黏液溶液，确保液体位于几何结构下方，且几何结构边缘附近无液体溢出。
      注意：流体加载不当会导致测量误差。样品填充不足会降低扭矩分布，而样品填充过多则会因边缘溢出导致应力分布错误。
    5. 选择‘运动’ 和 ‘速度以5 rad/s和0 rad/s交替设置转速，直至样品在测量夹具下方的惯性和速度达到最小。流变仪仪器的控制屏幕及流变仪控制软件的操作面板将显示转速（见 补充图13).
    6. 按压‘几何间隙点击流变仪上的“下降”按钮，使测量夹具下降至针对特定夹具预设的合适间隙。或者，点击“几何间隙“图标”位于“间隙“选项卡中的“控制面板流变仪仪器控制软件中的“选项”（参见 补充图14).
  7. 运行实验以测定已知浓度（100 mg/mL）黏液的线性黏弹性范围（LVR）。
    1. 点击“开始流变仪仪器控制软件上的“图标”（参见 补充图15).
      注意：流变仪可执行自动测量；一旦启动‘开始“开始”按钮按下后，流变仪大约需要20分钟完成测试。步骤2.5.5中的“每十倍频程采样点数”设置将决定流变仪完成测量所需的时间。
    2. 点击“运行实验”是在弹出的对话框中点击“确定”，如果尚未将几何间隙调整至正确距离，请根据提示将其降至适当位置以开始实验。  
    3. 观察流变仪生成的实时图谱，该图谱报告储能模量（G’）和损耗模量（G’’）。
      注意：G’ 和 G” 分别为储能模量和损耗模量。储能模量表示材料在应力诱导变形后恢复其原始形状的趋势，相当于弹性。损耗模量表示材料抵抗流动趋势的程度，代表流体的黏度（参见 图4).
    4. 将图表的 X 轴设置为“振荡应变百分比。为此，请右键单击所显示的图表并选择“图形变量”选项卡 （参见 补充图16).
    5. 测试完成后，从图中记录材料进入非线性黏弹性范围之前的振荡应变百分比范围。
    6. 按压‘上下箭头流变仪仪器上的控制装置或‘几何升降“图标位于“间隙在流变仪仪器控制软件的“上升”选项卡中，将几何转子升至高于帕尔帖板的任意指定高度。
    7. 将包含实验步骤和结果的文件以流变仪仪器控制软件的原生文件格式保存，以确定黏液样本的线性黏弹性区域（LVR）。
      注意：可通过将图表的 X 轴设置为应变振幅（%）和/或振荡应力来实现 figure-protocol-1 在数据进入非线性黏弹性区域（NLVR）之前（参见 补充图16).
  8. 在线性粘弹性范围内（LVR），对已知浓度为100 mg/mL的黏液进行动态扫描和稳态剪切速率流动测试实验，从三个独立的100 mg/mL黏液样本中获取结果。对所有可获得的不同黏液浓度样本分别执行上述步骤。 
    1. 重复步骤 2.5.1 – 2.5.4。
    2. 初始化测试参数参数设置如下：“频率 = 1 Hz”；设置为“对数扫描”；“应变% = 100 至 10000 %”；“每十倍频程点数 = 10”。
    3. 选择“步骤“标签，然后使用箭头键设置‘2：振荡频率’程序。”
    4. 初始化环境控制设置如下：温度 = 22 °C浸泡时间 = 0.0 s
    5. 初始化测试参数参数设置如下：“应变 % = 1 %”；设置为“对数扫描”；“频率 = 20 至 1 Hz”；“每十倍频程点数 = 10”。
    6. 选择“步骤“标签，并使用箭头键设置‘3: 流速扫描’程序。”
    7. 初始化环境控制设置如下：温度 = 22 °C浸泡时间 = 0.0 s
    8. 初始化测试参数剪切速率 = 1 至 10000 1/s；每十倍频程点数 = 10；勾选“稳态感应”复选框。
    9. 重复步骤 2.7.1 – 2.7.2，并等待实验完成，约需 45 分钟。
    10. 按压‘上下箭头使用流变仪仪器上的控制按钮，或在流变仪仪器控制软件的“间隙（Gap）”选项卡下点击“几何夹具升降（geometry raise and lower）”图标，将几何夹具升至任意高度。
    11. 使用一次性擦拭巾和手套，用异丙醇溶液清除帕尔帖板上的黏液（参见 材料表).
    12. 将包含实验步骤和结果的文件以流变仪仪器控制软件的原生文件格式保存。 

3. 对黏液溶液的其他浓度（200 mg/mL 和 400 mg/mL）重复该方案。

  1. 对剩余两种浓度的黏液溶液（200 mg/mL 和 400 mg/mL）执行步骤 2.5 – 2.8，包括其中列出的所有子步骤。 

4. 图形化表示与数据分析

注意：补充代码文件中提供的代码可对数据进行平均处理，并生成重复性误差，叠加所有实验的数据。该流变仪仪器的控制软件不具备标准差计算功能。该代码使用一种用于数据分析、后处理和图形化表示的编程语言编写（详见材料表中的说明）。   

  1. 通过点击流变仪仪器控制软件中的标签“文件 | 导出 | Excel”，将步骤 2.8 中获得的 100 mg/mL GR 黏液浓度数据以及步骤 3.1 中获得的 200 mg/mL 和 400 mg/mL GR 黏液浓度数据 导出为电子表格格式（参见补充图 17）。
  2. 运行补充代码，生成表观黏度（η）随剪切应变率（figure-protocol-2）变化的曲线图，以及损耗模量（G”）、储能模量（G’）和相位角（δ）随振荡应力（figure-protocol-3）变化的曲线图，并生成代表性结果。

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结果

本部分介绍了使用旋转流变仪（锥形几何结构，直径40 mm，角度1° 0’ 11’’）和帕尔帖温控平板对胃食管反流（GR）黏液进行实验的结果。这些实验有助于表征GR黏液的非牛顿流体特性、剪切稀化行为以及表观屈服应力，后者反映了黏液从类凝胶物质向类流体物质转变的过程。代表性结果包含了对旋转流变仪仪器低扭矩极限和二次流动效应的定量描述。仪器的测量限制、稳态及动态应变率测量有助于准确确定GR黏液的黏弹性行为趋势及其表观屈服应力。表观屈服应力的测量提供了观察GR黏液发生不可逆塑性变形并开始流动所需的最小应力的方法。GR黏液的流动起始倾向可归因于其对食物颗粒的黏附与运输功能。GR黏液的黏附与运输功能是宏观层面的材料属性，由本实验方案中的流变学测量结果所揭示。因此，本方案通过宏观流变学方法对GR黏液进行了表征。

实验所用黏液取自最多三条鲢鱼的数个鳃耙，无任何可见的血液痕迹1,2。所获取的样品按方案稀释为另外两个样品。所有测量均在22 ± 0.002 °C的受控温度下进行

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讨论

开发本方案的主要目标之一是证明其适用于在样品体积非常小的情况下对鳃耙黏液进行流变学表征。我们承认，需要采集更多鲢鱼群体的样品才能全面表征鳃耙黏液的流变特性，本文所提供的数据不能推广至整个鲢鱼种群。本研究所采用的技术因其在小样品体积流变学表征中的有效性，以及在涉及更大数量黏液样品的深入研究中的适用性而具有合理性。

该方案中的关键步骤包括制备不同浓度的黏液溶液、使用旋转流变仪进行测量和数据采集，以及通过图形表示和数据分析获得物理特性方面的深入认识。

从所示图形表示中获得对GR黏液数据的物理理解 图3 和 图4，这些数据用预期材料行为的属性进行标注。零剪切应变率黏度（ηo在低剪切应变速率下，材料分子的流动性占主导地位，此时可观察到相应的值（图3A 和 图8A）。无限...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

作者感谢乔治华盛顿大学仿生与仿生工程中心提供的支持和资助。我们感谢乔治华盛顿大学生物科学系的L. Patricia Hernandez教授为本研究提供了灵感和持续的合作，她在银鲤生理学方面的专业知识以及所提供的黏液样本对研究至关重要。我们感谢实验室工作的协助者：David Palumbo先生、Carly Cohen女士、Isaac Finberg先生、Dominick Petrosino先生、Alexis Renderos先生、Priscilla Varghese女士、Carter Tegen先生和Raghav Pajjur先生；同时感谢TA Instruments公司（位于美国特拉华州纽卡斯尔）的Thomas Evans先生和James Thomas先生在流变仪使用培训和设备维护方面提供的支持。图5A和5C的图像由乔治华盛顿大学生物科学系L. Patricia Hernandez教授在解剖过程中拍摄。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料
Kim擦拭纸VWR470224-038用于清洁板上的样品
手套VWR89428-750防止样品污染
移液器VWR89079-974用于将样品从瓶中转移至流变仪
移液器吸头Thermo Scientific72830-042用于将样品从瓶中转移至流变仪
振荡器VWR89032-094用于均匀混合黏液样品
样品瓶VWR66008-710用于盛装定量体积的样品
电子天平OhausScout –SPX Balances用于称量黏液样品的质量
化学试剂
去离子水 (H20)--液体
无菌70%异丙醇 (C3H8O)VWR89108-162液体
GR黏液
100 mg/mL浓度，2mL--黏弹性材料
400 mg/mL浓度，1mL--黏弹性材料
200 mg/mL浓度，1mL--黏弹性材料
软件
MATLABMathworksR2017a数据分析、后处理及图形化表示
TriosTA Instrumentsv4.5.042498流变仪仪器控制与分析软件

参考文献

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