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利用过滤法从尿液中分离L型细菌

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DOI：

10.3791/61380

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2020年6月13日

 ,  , 
1Centre for Bacterial Cell Biology, Biosciences Institute, Medical School, Newcastle University

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用过滤法从尿液中分离L型细菌的实验方案。同时描述了L型培养基的制备、相位差显微镜观察L型细菌以及在实验室条件下诱导形成L型细菌的配套方法。

摘要

细菌向L型状态的转变被认为可能在免疫逃逸以及使用靶向细胞壁的抗生素治疗期间的细菌持续存在中发挥一定作用。然而，L型细菌的分离与操作具有挑战性，主要原因是其对渗透压变化高度敏感。本文详细描述了L型培养基的制备、利用过滤法从尿液中分离L型细菌、通过相差显微镜检测尿液样本中的L型细菌以及体外诱导L型细菌的方法。L型细菌存活与生长的具体需求可能因菌株而异。因此，本文所提供的方法旨在作为各实验室建立自身L型细菌实验方案的基本指导，而非精确的操作指令。过滤法可能导致样本中L型细菌数量减少，因此不应用于定量分析。然而，该方法是目前唯一可用于有效分离无细胞壁变异体与其有壁对应形式，并用于鉴定能够发生L型转换的细菌菌株的方法，特别是在尿路感染患者中。过滤法有望被进一步改进，用于从其他类型细菌感染患者以及环境样本中分离L型细菌。

引言

几乎所有细菌都被一种称为细胞壁的结构所包围。细胞壁对于抵御环境胁迫具有重要作用，有助于细菌的正常分裂并维持其形态1。然而，细胞壁也是免疫系统某些组分以及一些最有效且最常用的抗生素（包括青霉素）的作用靶点2,3。尽管细胞壁具有重要功能，但革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在特定条件下偶尔也能在无细胞壁的状态下存活4,5,6,7,8。如果周围环境提供了足够的渗透保护以防止细胞破裂，同时存在靶向细胞壁的物质，细菌便可转变为无壁状态，这种状态被称为L型4,5,6,7,8。

大量研究报告表明，细菌在L型状态与有壁状态之间相互转换在体内可能具有重要意义，这种机制可帮助细菌逃避宿主免疫系统的攻击以及细胞壁靶向抗生素的治疗。9,10,11,12,13,14,15这种转变可能为复发提供一种强有力的应对策略 细菌感染9,10,11,12,13,14,15了解L型细菌的基本生物学特性及其与宿主的相互作用，对于阐明其在致病过程中的作用至关重要。然而，L型细菌的培养与操作具有较大挑战性。

首先，由于缺乏细胞壁，L型细菌在渗透压变化时容易破裂。此外，L型细菌的分裂方式高度不规则，生长模式难以预测（通常比具有细胞壁的对应菌株生长更慢），并且根据菌株的不同，可能在半固体培养基上比在固体或液体培养基中更易增殖。上述所有因素使得生长速率的定量分析和比较变得困难。不同细菌种类（甚至不同菌株）在L型转化和生长过程中具有各异的代谢需求。例如，某些依赖有氧呼吸的革兰氏阳性菌的L型细菌，相较于其具有细胞壁的对应菌株，对活性氧物种更为敏感16。

在实验室条件或宿主内诱导L型细菌通常由靶向细胞壁的因子驱动，例如抗生素和溶菌酶9。此类处理可能导致细胞壁仅部分缺失，因此样品中可能仍存在一些具有细胞壁（或部分具有细胞壁）的细菌，这使得难以区分所观察到的实验结果究竟是由L型细菌还是由有壁细菌所引起。体内诱导产生的L型细菌频率通常较低，意味着它们难以被发现和分离。最后，由于L型细菌具有多形性形态，它们在原位很容易与真核来源的结构（如凋亡小体或各种颗粒）相混淆。

自1935年发现以来17，已开发出多种在实验室中处理L型细菌的方法。其中大多数方法依赖于在培养基中添加渗透保护剂，通常为糖类或盐类9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。如上所述，L型细菌常与有细胞壁的细菌共存于患者样本中，分离这两种群体可能十分困难。然而，已有研究表明，与有细胞壁的细菌不同，L型细菌由于具有较高的柔韧性和可变的大小，能够通过孔径为0.45 µm的滤膜。已有研究采用此类滤膜法从尿液中分离L型细菌10,19,20,21。

本文介绍了一种利用过滤法从尿液中分离L型细菌的实验方案（图1）。同时描述了L型培养基的制备、L型细菌的显微镜观察以及体外诱导L型细菌的配套实验方案。

方案

1. L型培养基（LM）的制备

  1. 在容量为所需培养基体积两倍的玻璃瓶中称取蔗糖（根据需要调整用量，以达到终浓度为 0.58 M）、MgSO4（终浓度为 8 mM）和脑心浸液（BHI）（按供应商推荐量）。若配制 0.5 L 培养基，则称取 100 g 蔗糖、1 g MgSO4 和 18.5 g BHI，置于 1 L 玻璃瓶中。此操作可为灭菌前更易重悬成分提供便利。
  2. 若需制备固体或半固体培养基，加入适量琼脂。对于固体培养基，在 0.5 L 培养基中加入 5 g 琼脂，使终浓度为 1%；对于半固体培养基，在 0.5 L 培养基中加入 1 g 琼脂，使终浓度为 0.2%。
  3. 用去离子水（DI 水）定容至所需最终体积。
  4. 盖紧瓶盖，通过振荡充分混匀。无需完全溶解各成分，只需确保其未在瓶底结块即可。旋松瓶盖，采用敏感培养基程序进行高压灭菌（115 °C，15 分钟）。建议在灭菌前混匀成分并使用敏感培养基程序，以防止成分结块及蔗糖焦化。
  5. 高压灭菌后目视检查培养基，应无结块，且呈琥珀色（图 2A）。
  6. 灭菌后，让培养基冷却至可用手舒适持握的温度。
  7. 若培养基用于诱导 L 型细菌，此时加入抗生素和/或溶菌剂（例如，磷霉素终浓度为 400 μg/mL，青霉素 G 为 200 μg/mL，D-环丝氨酸为 400 μg/mL，氨苄西林为 100 μg/mL，莫能霉素为 50 μg/mL，溶菌酶为 100 μg/mL，或溶葡萄球菌素为 5 μg/mL）。针对每种测试的细菌种类，需通过实验确定诱导 L 型的试剂种类（若需多种试剂则包括组合）及其浓度。
  8. 分装培养基时应佩戴手套，并在微生物安全柜中操作或使用本生灯。由于培养基可能需要长时间培养，无菌性至关重要。
    1. 制备固体培养基分装物时，用移液器将 25 mL 培养基转移至各个 92/16 mm 培养皿中，静置凝固。建议使用移液器而非直接倾倒的方式制备平板，以降低污染风险。切勿过度干燥平板。
    2. 制备半液体分装物时，用移液器将 5 mL 培养基分装至多个 30 mL 聚苯乙烯通用容器中，静置凝固。
  9. 培养基应立即使用，或在 4 °C 下保存不超过一周后再使用。含抗生素的培养基在保存前应查阅生产商建议，因为某些化合物可能随时间降解，导致浓度下降。

2. 从尿液中分离L型细菌

注意：进行实验操作时需佩戴手套和实验服。应在生物安全柜内操作或使用本生灯。过滤时需佩戴护目镜。

  1. 在预计尿液样本到达前至少1小时，用70%乙醇擦拭工作区域，并准备好所需数量的半液体LM培养基分装 aliquot。
    注意：本实验将使用在液体LM培养基中实验室诱导的 E. coli ST14410 L型细菌悬浮液，而非人类尿液样本，以演示该操作流程。
  2. 在处理样本前再次用70%乙醇擦拭工作区域。在实验台一侧放置所需数量的0.45 µm截留滤膜、20 mL注射器，以及与样本数量相等的若干无菌空30 mL聚苯乙烯通用容器。额外多准备几个滤膜，以防某些样本需要使用多个滤膜进行处理。将LM培养基分装 aliquot 和无菌空30 mL聚苯乙烯通用容器置于实验台中央的稳定支架中。若需同时进行显微镜检查，还需准备载玻片、22 × 22 mm盖玻片、2 µL和1 mL移液器、无菌10 µL和1 mL吸头、无菌1.5 mL离心管，并确保台式微量离心机可用。
  3. 在供体捐献后应尽快将尿液样本运送至实验室，以防止样本中L型细菌可能发生降解。
  4. 戴上手套和护目镜，从安全袋中取出尿液样本，喷洒乙醇后擦拭干净，并将其放置在靠近LM培养基分装 aliquot 和备用无菌30 mL聚苯乙烯容器的支架上。自此开始，每次仅处理一个样本。
  5. 松开含有LM培养基的试管、备用聚苯乙烯通用容器以及含尿液试管的盖子。
  6. 从包装中取出注射器，拔出活塞并放置于右侧。
  7. 撕下滤膜包装背面的保护纸，将注射器牢固连接至滤膜（保持滤膜面朝下，置于厂家提供的独立塑料支架中，以确保无菌状态）。
  8. 迅速但小心地取下LM培养基试管的盖子，并将装有注射器的滤膜置于试管上方。
  9. 取下尿液样本的盖子，轻柔地将约10 mL尿液倒入注射器中（仅需过滤2 mL，但保留过量体积可防止溅出），确保至少保留1 mL以上用于后续显微镜检查。实际仅需使用0.5 mL，但在过滤过程中精确量取该体积不切实际，因此保留近似过量体积。
  10. 非常小心地将活塞插入注射器后端。在活塞完全就位前会感受到轻微阻力，超过此点后容易导致样本溢出。在处理尿液样本前，建议先用水练习数次。
  11. 轻柔推动活塞，使2 mL尿液通过滤膜，直至感受到阻力增加。注意不要施加过大压力，以免样本溢出或滤膜破裂。若样本特别浓稠且产生过高阻力，应改用多个滤膜分步过滤，而非强行通过单一滤膜。
  12. 轻轻敲击滤膜，使其紧贴含有LM培养基的试管内壁，以释放残留的滤过液体；随后提起滤膜和注射器，迅速取备用30 mL聚苯乙烯通用容器的盖子盖上含有LM培养基和滤过尿液的试管，注意避免盖子边缘接触试管内部。安全丢弃滤膜、注射器及备用聚苯乙烯容器。
  13. 将样本在30 °C条件下静置培养最长1个月，以允许通过滤膜的L型细菌恢复细胞壁并以有壁细菌形式开始生长。
  14. 每天观察样本是否有生长迹象，将含有滤过样本的试管置于光源前观察。阳性样本通常在3至7天内出现可见生长。
  15. 一旦检测到生长，立即将样本转移至微生物安全柜或靠近本生灯的区域。打开试管，小心插入5 µL塑料接种环，尽量接触生长区域，随后在无渗透保护的标准固体BHI培养基上划线接种，力求获得单菌落22。
  16. 同时，取少量样本连同部分半液体培养基（约5 µL），按第3步所述方法进行显微镜检查。将样本与培养基一同转移至载玻片上，可防止样本中仍存在的L型细菌破裂，从而提高检出率。然而，此时大多数细菌预期已恢复为有壁形态，表现为典型的杆状或球状细菌。
  17. 将划线接种于BHI平板的样本在37 °C条件下静置培养过夜。
  18. 检查是否有菌落生长，用5 µL接种环从每块平板上挑取单个菌落，接种至5 mL液体BHI培养基中，在37 °C条件下振荡培养过夜。
  19. 利用过夜培养物制备甘油保存菌种，或采用合适方法（如Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit）提取DNA用于物种鉴定。

3. 通过相差显微镜检查尿液样本中L型细菌的存在

  1. 将剩余的0.5 mL尿液样本放入微量离心管中，在台式微量离心机中以8,000 × g 离心1分钟。
  2. 小心移除上清液，留下约20 µL，并通过上下轻柔吹打3次重悬沉淀。
  3. 取1 µL样品滴加至玻璃显微镜载玻片上，盖上22 × 22 mm的盖玻片（若检测5 µL样品（见步骤2.16），应使用22 × 50 mm盖玻片，以确保盖玻片能牢固贴附于载玻片）。用无菌棉垫轻轻按压盖玻片，形成密封，并检查盖玻片是否固定不动。丢弃棉垫。
  4. 使用配备100倍相差物镜的显微镜观察载玻片，检测是否存在类似L型结构（图3）。
    注意：为确认患者样本中类似L型结构的细菌来源，建议使用针对细菌序列的寡核苷酸探针，通过荧光原位杂交（FISH）对样本进行检测10,23。

4. 体外诱导L型细菌

  1. 在含有非渗透保护性培养基（例如BHI）的平板上，将所选的有壁细菌划线至单菌落22，并在37 °C静置培养过夜。
  2. 次日，按步骤1所述方法制备含有选定L型诱导剂的渗透保护性LM培养基，并制备所需数量的固体培养基平板。
  3. 使用无菌的5 µL塑料接种环或牙签，从前一晚在非渗透保护性BHI平板上培养的菌落中挑取足量菌体（约4–5个菌落量）。
  4. 使用接种环的平面部分（而非边缘）在LM平板上进行划线。首先沿平板边缘以连续动作划线，然后将平板旋转90°，将接种环轻触第一条划线的末端，并以连续动作在一个象限内逐步稀释涂布细菌，通过多次重叠划线实现稀释（可根据需要使用整个平板；若仅使用一个象限，则其余象限可用于多种诱导条件）。
    注意：图4A 示意了划线方向。此步骤的目的是获得尽可能多纯L型细菌的生长区域，而非分离单菌落。因此，划线过程中无需更换接种环。L型细菌的单菌落通常极难获得，接种菌量过少可能导致完全无L型生长；反之，若使用的有壁细菌过多，则并非所有细菌都会完成形态转换，部分可能仍保留细胞壁。最佳的L型生长区域通常出现在划线的中部。
  5. 将平板置于塑料袋或其他容器中以防止干燥，并在30 °C培养（某些细菌的L型在厌氧条件下可能生长更佳，因此可尝试在厌氧环境中培养以提高L型生成效率）。每日观察平板上的生长情况，通常在3至7天内可见生长，生长量因菌株而异。图4B 展示了L型生长的一个示例。
  6. 使用显微镜确认L型细菌的存在。在显微镜载玻片上滴加2 µL LM培养基，用移液器吸头从划线中部挑取少量细胞，悬浮于液滴中。
    1. 盖上22 × 22 mm的盖玻片，使用100倍相差物镜的显微镜观察L型细菌的存在情况。代表性结果见图4C。

结果

含有蔗糖的L型培养基在高压灭菌后可能发生不同程度的焦糖化，这会伴随颜色变化。图2展示了含蔗糖培养基高压灭菌后的典型结果。图2A显示了LM培养基的一个典型示例，其在高压灭菌后变为琥珀色。图2B显示了1.16 M蔗糖溶液（配制LM培养基所需浓度的2倍）在高压灭菌后的典型情况。偶尔，LM培养基或蔗糖在高压灭菌过程中可能发生严重焦糖化，若出现此情况，则不建议使用该培养基。图2C展示了一种过度焦糖化的蔗糖培养基示例。

L型细菌可能具有高度异质性，图3展示了在患者尿液样本中可观察到的类似L型结构的示例。为确认尿液样本中发现的类似L型结构的细菌来源，建议使用针对细菌序列的荧光探针进行荧光原位杂交（FISH）10,23。

在实验室条件下诱导产生的L型细菌的生长水平具有菌株特异性。图4B展示了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）L型细菌生长的一个示例，图4C展示了由图4B中诱导产生的L型细菌的显微形态。

尿液样本孵育过程及细菌菌株鉴定示意图，DNA提取步骤。
图1：利用过滤法分离L型细菌——示意图。 将尿液样本通过0.45 µm滤膜过滤至含有渗透保护性LM培养基（添加0.2%琼脂）的聚苯乙烯通用容器中。随后将样本置于30 °C静置孵育，最长可达一个月，并每日肉眼观察是否有生长迹象。此孵育过程可使样本中可能存在的L型细菌恢复其细胞壁。一旦观察到生长，即可将细菌重新划线接种至常规固体非渗透保护性培养基平板（如营养琼脂或脑心浸出液培养基），以分离单菌落，随后对单菌落进行DNA提取和测序，从而鉴定所分离的细菌种类。 请点击此处查看该图的放大版本。

色谱实验，三个溶剂相，分离结果的视觉比较。
图 2：L-型培养基。（A）高压灭菌后的 LM 培养基。（B）高压灭菌后的 1.16 M 蔗糖（2 倍浓度）。（C）严重焦糖化的 LM 培养基。请点击此处查看此图的放大版本。

细菌细胞聚集的显微镜图像、细胞相互作用的实验分析、示意图。
图3：通过相差显微镜在复发性尿路感染患者尿液中观察到的类L型结构示例。（A,B）悬浮在尿液中、典型表现为分裂状态的细菌L型结构。（C,D）与真核细胞相关的、典型表现为分裂状态的细菌L型结构。（E,F）革兰氏阴性菌L型特有的新月形结构（红箭头所示）。（F,G）细胞壁完整细胞向L型转化中间阶段的典型结构（G中红箭头所示）。（H）大L型细胞特有的胞内囊泡结构。比例尺 = 5 µm。本图改编自10。请点击此处查看该图的放大版本。

划线接种示意图、琼脂平板划线、细菌菌落显微镜图像，用于微生物分离。
图4：在固体培养基上诱导L型细菌的划线接种技术。（A）使用平板四分之一区域进行细菌划线以诱导L型细菌的示意图。箭头指示划线方向。（B）按照（A）所示方法划线后，Bacillus subtilis L型细菌在30 °C下培养3天后的生长实例。（C）由（B）中诱导产生的L型细菌，通过相差显微镜观察。比例尺＝5 µm。图B和图C已根据文献16 修改 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本论文中描述的实验方案已被用于从人类尿液中分离和培养多种细菌的L型，包括E. coli、Streptococcus、Staphylococcus、Klebsiella、Pseudomonas、Enterococcus和Enterobacter spp，这些细菌通常与尿路感染相关10,24。然而，某一实验室建立的L型培养方法可能无法直接适用于其他实验室，且对某一菌株有效的条件可能对另一菌株无效。因此，本文所述方案可能需要多次尝试并进一步优化。特别是营养需求、氧气供应、 渗透保护剂浓度 以及培养基的流动性均需进行测试。L型转化与生长的最佳条件可能不同于同种细菌有壁形态生长的最佳条件。此外，在实施这些实验方案时可能会遇到若干技术问题。

制备L型培养基时常见的问题是蔗糖在高压灭菌后发生焦糖化。如果培养基颜色变为深棕色，则应弃用，并重新配制一批。可以考虑将蔗糖溶于水配制成一瓶，其余成分配制成另一瓶，两者均配为2倍浓度。高压灭菌后，将这两种2倍浓缩液按1:1比例混合，即可获得所需的终浓度。蔗糖单独高压灭菌后可能略呈黄色（图2B），这是可接受的；但如果变为深棕色（图2C），则不应用于实验。可能需要调整高压灭菌的时间和温度，以减轻蔗糖焦糖化现象。建议将调整灭菌程序后制备的培养基取等份样品，在37 °C下孵育至少3天，以检测其无菌性。最后，如果焦糖化问题持续存在，可能需要尝试其他渗透保护剂（如盐）作为替代方案18。

在从患者样本中分离L型细菌时，也可能遇到一些问题。如实验方案中所述，样本中存在的L型细菌可能会发生潜在的退化；因此，样本采集后应尽快运送到实验室。出于同样原因，强烈不建议将样本储存在低温条件下或改变样本成分（例如添加PBS）。

过滤方法本身存在局限性。某些L型细菌可能因培养基流经滤膜时产生的剪切力而破裂。在Mickiewicz等人开展的研究中，对照样本（含有实验室诱导产生的E. coli L型细菌）中仅有41%的L型细菌能够通过滤膜10。这表明过滤法可能导致阳性样本数量被低估，因此不推荐用于定量研究。

在极少数情况下，经过过滤后，用于L型细菌分离的半液体培养基分装样品中可能在次日观察到明显的生长。这可能表明过滤过程中滤膜破损，导致有壁细菌通过，或者样品受到污染。建议丢弃此类样品，或至少谨慎处理。每天对样品进行肉眼观察至关重要，以防止出现假阳性结果。在通过过滤法处理尿液样品之前，建议先让若干实验室诱导产生的L型细菌、有壁细菌以及无菌培养基样品通过所选滤膜，以验证L型细菌分离的效率、检测滤膜破损是否可能导致有壁细菌通过，并确保所采用的无菌操作技术有效可靠。

在极少数情况下，可通过过滤法分离得到稳定的L型，且显微镜下无法检测到有细胞壁的形态。为了维持L型细菌的活性，建议每隔3至7天（根据生长效率而定）将数“环”样品转接到含有新鲜半液体LM培养基的试管中，或重新划线接种于固体渗透保护培养基上。若经过多次传代后仍未出现有细胞壁的形态，可尝试将样品在–80 °C条件下用40%甘油冷冻保存以维持菌种；然而，部分L型可能对该处理过程耐受性较差。

尽管存在局限性，过滤法仍是目前用于从患者样本中分离L型细菌与有壁细菌的唯一方法。该方法能够鉴定出可在体内发生L型转换的细菌菌株。未来有望对该过滤法进行改进和优化，以用于从其他类型的人体或环境样本（例如血液或植物）中分离L型细菌。

综合考虑上述所有因素，我们建议将本文所述的实验方案作为各实验室建立定制化L型细菌实验流程的良好起点，而非一成不变的操作指令。操作L型细菌需要极大的细心、投入和耐心，但通过实践，这一过程将极具回报。我们希望本文提出的指导原则能够成为建立L型细菌实验方案的基准，并鼓励更多基础与临床研究团队开展对这些独特细菌形态的研究。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由欧洲研究理事会（资助号 670980）资助，授予杰夫·埃林顿（纽卡斯尔大学细菌细胞生物学中心主任）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.45 µL 截断滤器Sarstedt83.1826
20 mL 注射器Fisher17955460
30 mL 聚苯乙烯通用管StarlabE1412-3010
92 × 16 mm 培养皿Starstedt82.1473
琼脂OxoidLP0011
氨苄青霉素Sigma-AldrichA9518
脑心浸液OxoidCM1135
盖玻片（22 × 22 mm，22 × 50 mm）VWR631-0137/-0125
D-环丝氨酸Sigma-AldrichC6880
玻璃显微镜载玻片VWR631-1550P
溶葡萄球菌素Sigma-AldrichL7386
溶菌酶Sigma-AldrichL4919
MgSO4VWR25165.26
莫诺霉素Sigma-Aldrich32404
青霉素 GSigma-Aldrich13752
磷霉素Sigma-AldrichP5396
蔗糖Sigma-Aldrich84100

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