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方法文章

创建匹配的PDX与PDX来源类器官体内/体外患者来源模型对用于癌症药理学研究

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DOI：

10.3791/61382

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2021年5月5日

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1Crown Bioscience Inc., Changping District, Beijing, China, 2Crown Bioscience Inc., Taicang, Jiangsu, China, 3Crown Bioscience Inc., San Diego, CA, USA

本文内容

摘要

本文描述了一种利用患者来源的异种移植瘤（PDX）建立类器官的方法，用于体外筛选，从而获得匹配的体内/体外模型对。将PDX肿瘤通过机械或酶消化方法处理成小块，随后采用Clevers方法培养肿瘤类器官，并对这些类器官进行传代、冻存，以及与原始PDX进行比对表征。

摘要

患者来源的肿瘤异种移植模型（PDX）被认为是目前最具预测性的临床前模型，通常认为其由癌症干细胞（CSC）驱动，适用于传统抗癌药物的评价。大规模的PDX模型库能够反映患者群体的多样性，从而支持基于人群的临床前试验（“类II期小鼠临床试验”）；然而，PDX模型存在通量低、成本高和实验周期长等实际局限性。肿瘤类器官同样是源于患者的、由癌症干细胞驱动的模型，可被视为PDX的体外对应模型，在处理大规模类器官或化合物库时能够克服部分PDX模型的限制。本研究描述了一种建立PDX来源类器官（PDXO）的方法，从而获得可用于体外与体内药理学研究的配对模型。根据批准的解剖程序，当皮下移植的PDX-CR2110肿瘤在荷瘤小鼠体内生长至200–800 mm3时，收集肿瘤组织，去除邻近的非肿瘤组织，并将其解离为小的肿瘤片段。将小肿瘤片段洗涤后通过100 µm细胞筛网过滤，以去除碎片。收集细胞簇，悬浮于基底膜提取物（BME）溶液中，并以固体液滴形式接种于6孔板中，周围加入液体培养基，在CO2培养箱中进行培养。每周两次在光学显微镜下观察类器官生长情况并拍照记录，同时每周更换液体培养基2至3次。培养后的类器官在7天后通过机械剪切法进行传代（传代比例为1:2），并辅以胰蛋白酶和10 µM Y-27632的添加，以破坏嵌入BME中的类器官结构。类器官在经离心从BME中释放后，分装至冻存管中进行长期冷冻保存，同时采集样本（如DNA、RNA和FFPE组织块）用于进一步的表征分析。

引言

癌症是一类具有高度异质性的遗传性和免疫性疾病。有效治疗手段的成功开发在很大程度上依赖于能够准确预测临床结果的实验模型。长期以来，大量经过充分表征的患者来源异种移植瘤（PDX）模型库被视为测试化疗和/或靶向治疗的首选转化性体内系统，因其能够重现患者的肿瘤特征、肿瘤异质性以及药物反应1，从而支持开展类似II期临床试验的小鼠临床试验，以提高临床成功率2,3。PDX通常被认为是癌症干细胞疾病，具有遗传稳定性，与细胞系来源的异种移植模型形成对比2。在过去几十年中，全球已建立了大量的PDX模型库，现已成为当今抗癌药物研发的主要工具。尽管PDX模型被广泛使用并具有重要的转化价值，但这些动物模型本质上成本高昂、耗时较长且通量较低，因此不适用于大规模筛选。此外，由于PDX模型具有免疫缺陷特性4，也不适用于免疫肿瘤学（IO）测试。因此，难以充分利用现有的大规模PDX模型库资源。

近期发现由Hans Clevers实验室率先开展5，已促成 体外 由成人干细胞培养生成的大多数上皮来源人体器官类器官的培养物5这些方案已进一步优化，可用于从多种适应症的人类癌瘤中假定的肿瘤干细胞（CSCs）培养类器官6,7这些患者来源的类器官（PDOs）具有基因组稳定性8,9 并且已被证明对临床治疗结果具有高度预测性10,11,12此外， 体外 PDO 的特性使其适用于高通量筛选（HTS）13，因此可能相较于后者具有优势 体内 模型，并利用大规模类器官库作为患者群体的替代。PDOs 有望成为重要的发现与转化研究平台，克服上述 PDXs 的诸多局限性。

PDO 和 PDX 均为患者来源且由肿瘤干细胞驱动的模型，可用于个体化治疗或临床试验模式下的药物疗效评估。目前已有的大规模 PDX 文库，例如包含 >3000 个 PDX 的专有文库14,15,16,17，适用于快速构建肿瘤类器官文库（即 PDX 来源类器官，PDXO），从而获得与 PDX 模型配对的匹配型 PDX 与 PDXO 双模型文库。本报告描述了相对于其亲本 PDX-CR2110 模型，构建和表征结直肠癌 PDXO-CR2110 的实验流程16。

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方案

所有涉及动物护理与使用的方案、修订或操作程序，在研究开始前均经过 Crown Bioscience 机构动物护理与使用委员会（IACUC）的审查和批准。动物的护理与使用严格遵循美国实验动物评估与认证协会（AAALAC）国际指南，即《实验动物护理与使用指南》（美国国家研究委员会，2011年）中的规定。所有动物实验均在SPF（无特定病原体）设施中以无菌条件进行，并严格遵守来自不同政府机构（如美国国立卫生研究院）发布的《实验动物护理与使用指南》。相关实验方案已获得实验设施所属机构动物实验伦理委员会（例如，机构IACUC委员会）的批准。

1. 肿瘤移植的准备工作

  1. 动物饲养
    1. 将Balb/c裸鼠（n=5）饲养于独立通风笼具中，环境温度为20–26 °C，相对湿度为30–70%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，垫料为玉米芯，每周更换一次，自由摄取经辐照灭菌的干燥颗粒饲料和无菌饮水。
  2. 供体肿瘤组织制备
    1. 密切监测荷瘤供体小鼠的体重（BW，使用电子天平称量）和肿瘤体积（TV，使用游标卡尺测量）。
    2. 当肿瘤体积达到800–1000 mm3时，在生物安全柜中对荷瘤动物实施安乐死。
      1. 将小鼠放入带有盖子的安乐死舱，通过盖子向舱内输送CO2气体。气体流速应足以使动物迅速失去意识，同时最大程度减少痛苦。CO2的适宜流速约为2–2.5 Lpm。
      2. 通过观察动物是否恢复意识，确认安乐死完成。
      3. 在出现明显临床死亡后，继续通气>1分钟，以最大程度降低动物复苏的可能性。
    3. 使用碘伏棉签对肿瘤周围皮肤进行消毒。去除邻近的非肿瘤组织后，将肿瘤组织收集至含有20 mL预冷（4 °C）PBS的培养皿中，预冷操作应在安乐死前完成。
    4. 在另一培养皿中用PBS清洗肿瘤组织以去除血液成分，随后将其切开并剔除多余的皮肤、血管、钙化组织和/或坏死组织。
    5. 仅将完整的肿瘤组织块转移至含有20 mL PBS的无菌50 mL离心管中，随后运送至独立的动物房进行移植操作。

2. 皮下肿瘤生长

  1. 将肿瘤组织块皮下接种至免疫缺陷小鼠
    1. 使用手术刀将PDX肿瘤切割成2 mm大小的组织块，并将每块置于套管针中，用于皮下（SC）植入。
    2. 使用5%异氟烷对受体动物进行麻醉（通过鼻罩维持1%浓度）。动物将逐渐放松，失去翻正反射，最终变得静止且对疼痛无反应。将麻醉后的小鼠固定于实验板上，呈右侧卧位，并用碘伏棉签消毒，尤其注意肿瘤接种部位周围的区域。
    3. 在左后肢上方肩胛区皮肤处，使用手术刀做一长约0.5 cm的切口，然后用钝头镊子在皮下向肩前方向钝性分离，形成一个长约2–3 cm的皮下隧道 。
    4. 无菌操作下，从培养基中取出一块肿瘤组织，植入皮下隧道深处，每个接种位点植入一块。在使用伤口夹关闭切口前，需目视确认组织块已正确放置。
    5. 监测接种肿瘤后的小鼠（5只），直至其恢复意识并能维持胸腹位卧姿，待其完全从麻醉中恢复后，再将其放回笼中。
  2. 荷瘤小鼠的健康监测
    1. 每日检查饮水和进食情况，每周记录一次体重。
    2. 在常规观察中检查小鼠状态，记录其活动能力、呼吸、理毛行为、整体外观、摄食饮水情况、体重增减、腹水等任何异常表现。
    3. 每周使用游标卡尺测量两次肿瘤体积（TV），以mm3表示，计算公式为：TV = 0.5 a × b2，其中a和b分别为肿瘤的长径和短径。
    4. 当出现以下任一情况时，应实施安乐死以采集样本：体重减轻>20%；活动能力受损（无法进食或饮水）；因明显腹水或腹部肿大而无法正常移动；呼吸困难；死亡。

3. 尸检与肿瘤组织采集

  1. 当肿瘤体积达到 200–800 mm3 时，按照批准的方案对小鼠实施安乐死（参见步骤 1.2.2）。
  2. 通过去除邻近的非肿瘤组织来收集肿瘤组织，随后将组织置于含有 AD+++ 的 50 mL 塑料管中（置于冰上），再进行解离。

4. PDX来源类器官培养的准备

注意：以下所有步骤均须按照组织培养的标准指南在生物安全柜内进行。使用前，将预热的96孔、24孔和6孔培养板置于37 °C培养箱中备用。

  1. 试剂准备
    1. 制备基底膜提取物（BME）溶液（生长因子减少型，无酚红）。将10 mL BME置于4 °C冰箱中过夜。解冻后，轻轻旋转BME瓶以确保均匀分散。
    2. 制备基础培养基/洗涤缓冲液AD+++。使用5 mL移液器向Advanced DMEM/F12培养基中加入5 mL 200 mM L-谷氨酰胺、1 M HEPES和青霉素-链霉素（Pen/Strep）。
    3. 按照Sato等人的方法18配制结肠类器官培养基：在基础培养基中添加N-Ac（1 mM）、A83-01（500 nM）、B27（1x）、EGF（50 ng/mL）、Noggin（100 ng/mL）、烟酰胺（10 mM）、SB202190（10 nM）、R-spondin（500 ng/mL）、L-谷氨酰胺（2 mM）、HEPES（10 µM）、青霉素-链霉素（1x）和Y-27623（10 µM）19。
    4. 制备AD+++消化液：在10 mL 1x类器官培养基中加入500 µL胶原酶II型（20 mg/mL）和10 µL Rho激酶抑制剂Y-27632（10 mM）。
  2. 肿瘤组织解离20
    1. 将肿瘤转移至50 mL塑料管中，再放入10 cm培养皿内。用尺子作为参照拍摄大体照片，并记录其状态描述（如大小、脂肪组织、血管化程度、坏死情况等）。
    2. 通过抽吸去除过量AD+++，用剪刀将肿瘤组织剪成小块，随后将1–2块组织转移至2 mL微量离心管中，在干冰上快速冷冻。于-80 °C保存以用于基因组分析。将剩余组织继续剪碎成更小片段，用AD+++转移至50 mL塑料管中。
    3. 用35 mL AD+++洗涤剪碎的组织2–3次，然后加入10 mL消化液（见步骤4.1.4），置于37 °C恒温摇床上以4 × g振荡1小时。
    4. 使用5 mL无菌塑料移液器反复吹打消化后的组织使其均质化，随后加入20 mL AD+++，并通过100 µm细胞滤网过滤。
    5. 用AD+++洗涤滤过物两次（每次以450 × g离心5分钟），然后用BME重悬沉淀（加入沉淀体积4倍量的BME），置于冰上保存19。
  3. 类器官培养的制备
    1. 将BME细胞悬液以多滴形式加入6孔板中，每孔总量为200 µL。
    2. 将培养板转移至37 °C培养箱。30分钟后，凝胶液滴将固化。
    3. 向每孔中加入2 mL类器官培养基，并在转移至培养箱（37 °C，5% CO2）前通过显微摄影记录代表性液滴。
    4. 每隔3–4天更换培养基以维持类器官培养，每7天或根据其生长状态和密度按1:2比例传代。

5. 组织病理学与下一代测序（NGS）分析

  1. 组织病理学
    1. 使用 P1000 移液器将现有培养基中的类器官从孔中收集，随后离心（450 × g，5 分钟），用 PBS 洗涤，并在 10% 甲醛中固定 1 小时。
    2. 将固定的类器官置于 50 mL 锥形管底部的 100% 明胶中，随后进行常规组织处理和包埋。
    3. 对 4 mm 石蜡切片采用标准方案进行苏木精–伊红（H&E）染色。
  2. RNA测序和全外显子组测序
    1. 使用 P1000 移液器将现有培养基中的类器官从孔中收集，随后在 4 °C 条件下以最大速度（12,000 × g）用微量离心机离心 5 分钟。
    2. 去除上清液以收集沉淀，确保无可见的 BME 存在，随后在微量管中速冻（干冰），然后转移至 -80 °C 冰箱保存。
    3. 按照制造商提供的标准程序提取 RNA 或 DNA，并对 RNA测序和全外显子组测序（WES）进行高通量测序分析。

6. IC50 测定20

  1. 用于IC50检测的类器官在384孔板中的接种
    1. 向每个孔（6孔板）中加入20 µL的100倍浓度dispase溶液，该孔中已含有2 mL类器官培养基，用于消化基底膜基质（BME）并使类器官从BME液滴中解离，随后在37 °C孵育30分钟。
    2. 将所有孔中消化后的类器官通过70 µm滤网用移液器转移至一个50 mL塑料离心管中，以收集类器官。
    3. 在显微镜下计数类器官以确定其浓度。使用培养基重悬类器官，然后在冰上加入BME，使其最终浓度达到5%（v/v）。
    4. 根据384孔板的加样图，使用液体分配器将50 µL类器官悬液加入每个孔中，接种密度为每孔200个CR2110 PDXO，使用相应的类器官培养基。
  2. 顺铂和伊立替康处理
    1. 使用顺铂（最高浓度为100 µM）和“伊立替康”（最高浓度为10 µM）。根据药物梯度稀释方案，通过数字分配器进行连续稀释，向各孔中加入SN-38（伊立替康的代谢产物，而非通常用于in vivo研究的伊立替康本身），共设置9个剂量梯度。
    2. 使用数字分配器的软件工具创建加样图。包括一个显示100%存活率的阴性对照（仅含溶剂），以及一个显示0%存活率的阳性对照（含5 µM星形孢菌素）。
    3. 将加药后的384孔板重新放回37 °C培养箱中孵育。
  3. 药物处理后类器官细胞活力的测定
    1. 在药物处理5天结束后，按照制造商推荐的操作流程，使用发光型细胞活力检测试剂测定类器官细胞活力。使用液体分配器将发光试剂加入各孔，在板式振荡器上混匀5分钟，随后在室温避光条件下孵育30分钟。
    2. 使用发光多孔板读板仪记录各孔的发光信号。
    3. 根据读板仪的原始读数计算各孔的归一化活力值，并通过非线性曲线拟合生成剂量-反应曲线及IC50值。

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结果

在光学显微镜下，PDXO 的形态特征与类器官典型形态一致，且经 H&E 染色证实与亲本 PDX 相符
在光学显微镜下，PDXO-CR2110 呈现典型的囊状结构（图 1A），这与既往报道的患者来源类器官（PDO）的形态相似，表明在相同培养条件下，PDXO 与 PDO 具有形态学上的相似性。

通过H&E染色进行的组织病理学检查显示，PDXO-CR2110（图1B）的组织结构和细胞类型与原始的PDX-CR2110（图1C）一致，表明PDX和PDXO均源自同一肿瘤样本CR2110。该结果为PDXO与其亲本PDX在组织病理学上的相似性提供了证据。

转录组表达与全外显子组测序显示 PDXO-CR2110 与亲本 PDX-CR2110 具有高度相关性
PDX-CR...

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讨论

本报告中关于PDX-/PDXO-CR2110的初步数据表明，在基因组学、组织病理学和药理学方面，PDX与其衍生模型PDXO具有生物学等效性，因为两种模型均代表了源自患者原始肿瘤干细胞（CSC）的疾病形态。这两种模型均为患者来源的疾病模型，有望预测患者的临床治疗反应。10,11,12,21. 配对的 体外 和 体内 模型可以相互补充以 体外 筛选与验证 体内，提高药物发现的成功率，并可能降低临床开发中的淘汰率。值得注意的是，PDXO 现在可使高通量筛选（HTS）利用现有的大规模患者来源类器官文库，而 PDX 由于高昂成本和操作难度在此方面存在局限 体内 成本更高且耗时更长。毋庸置疑，匹配的PDX-PDXO文库有望在不久的将来成为支持药物发现和转化研究的首选平台。

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披露

所有作者均为 Crown Bioscience, Inc. 的现任或前任全职员工。

致谢

作者谨此感谢 Jody Barbeau 博士、Federica Parisi 和 Rajendra Kumari 对稿件的审阅与编辑。作者同时感谢 Crown Bioscience 肿瘤学体外与体内研究团队在技术方面所付出的大量努力。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高级DMEM/F12Life Technologies12634028基础培养基
DMEMHycloneSH30243.01洗涤液
II型胶原酶Invitrogen17101015消化肿瘤
Matrigel康宁356231类器官培养基质（基底膜提取物，生长因子减量）
N-乙酰基SigmaA9165类器官培养基
A83-01Tocris2939类器官培养基
B27Life Technologies17504044类器官培养基
EGFPeprotechAF-100-15类器官培养基
NogginPeprotech120-10C类器官培养基
烟酰胺SigmaN0636类器官培养基
SB202190SigmaS7076类器官培养基
胃泌素SigmaG9145类器官培养基
R-spondinPeprotech120-38-1000类器官培养基
L-谷氨酰胺Life Technologies35050038类器官培养基
HepesLife Technologies15630056类器官培养基
青霉素-链霉素Life Technologies15140122类器官培养基
Y-27632AbmoleM1817类器官培养基
DispaseLife Technologies17105041筛选实验
CellTiter-Glo 3DPromegaG9683筛选实验（发光型ATP指示剂）
多通道分液器赛默飞世尔科技Multidrop combi类器官铺板/CellTiter-Glo 3D 加样
数字分配器TecanD300e化合物添加
Envision 酶标仪Perkin Elmer2104发光检测
Balb/c裸鼠北京豪沃康生物科技有限公司
RNAeasy Mini 试剂盒Qiagen74104tRNA 纯化试剂盒
DNAeasy 血液 & 组织试剂盒Qiagen69506DNA纯化试剂盒
Histogel赛默飞世尔科技HG-4000-012类器官包埋

参考文献

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