本文描述了一种利用患者来源的异种移植瘤（PDX）建立类器官的方法，用于体外筛选，从而获得匹配的体内/体外模型对。将PDX肿瘤通过机械或酶消化方法处理成小块，随后采用Clevers方法培养肿瘤类器官，并对这些类器官进行传代、冻存，以及与原始PDX进行比对表征。
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本文内容
摘要
摘要
患者来源的肿瘤异种移植模型（PDX）被认为是目前最具预测性的临床前模型，通常认为其由癌症干细胞（CSC）驱动，适用于传统抗癌药物的评价。大规模的PDX模型库能够反映患者群体的多样性，从而支持基于人群的临床前试验（“类II期小鼠临床试验”）；然而，PDX模型存在通量低、成本高和实验周期长等实际局限性。肿瘤类器官同样是源于患者的、由癌症干细胞驱动的模型，可被视为PDX的体外对应模型，在处理大规模类器官或化合物库时能够克服部分PDX模型的限制。本研究描述了一种建立PDX来源类器官（PDXO）的方法，从而获得可用于体外与体内药理学研究的配对模型。根据批准的解剖程序，当皮下移植的PDX-CR2110肿瘤在荷瘤小鼠体内生长至200–800 mm3时，收集肿瘤组织，去除邻近的非肿瘤组织，并将其解离为小的肿瘤片段。将小肿瘤片段洗涤后通过100 µm细胞筛网过滤，以去除碎片。收集细胞簇，悬浮于基底膜提取物（BME）溶液中，并以固体液滴形式接种于6孔板中，周围加入液体培养基，在CO2培养箱中进行培养。每周两次在光学显微镜下观察类器官生长情况并拍照记录，同时每周更换液体培养基2至3次。培养后的类器官在7天后通过机械剪切法进行传代（传代比例为1:2），并辅以胰蛋白酶和10 µM Y-27632的添加，以破坏嵌入BME中的类器官结构。类器官在经离心从BME中释放后，分装至冻存管中进行长期冷冻保存，同时采集样本（如DNA、RNA和FFPE组织块）用于进一步的表征分析。
引言
癌症是一类具有高度异质性的遗传性和免疫性疾病。有效治疗手段的成功开发在很大程度上依赖于能够准确预测临床结果的实验模型。长期以来，大量经过充分表征的患者来源异种移植瘤（PDX）模型库被视为测试化疗和/或靶向治疗的首选转化性体内系统，因其能够重现患者的肿瘤特征、肿瘤异质性以及药物反应1，从而支持开展类似II期临床试验的小鼠临床试验，以提高临床成功率2,3。PDX通常被认为是癌症干细胞疾病，具有遗传稳定性，与细胞系来源的异种移植模型形成对比2。在过去几十年中，全球已建立了大量的PDX模型库，现已成为当今抗癌药物研发的主要工具。尽管PDX模型被广泛使用并具有重要的转化价值，但这些动物模型本质上成本高昂、耗时较长且通量较低，因此不适用于大规模筛选。此外，由于PDX模型具有免疫缺陷特性4，也不适用于免疫肿瘤学（IO）测试。因此，难以充分利用现有的大规模PDX模型库资源。
近期发现由Hans Clevers实验室率先开展5，已促成 体外 由成人干细胞培养生成的大多数上皮来源人体器官类器官的培养物5这些方....
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方案
所有涉及动物护理与使用的方案、修订或操作程序，在研究开始前均经过 Crown Bioscience 机构动物护理与使用委员会（IACUC）的审查和批准。动物的护理与使用严格遵循美国实验动物评估与认证协会（AAALAC）国际指南，即《实验动物护理与使用指南》（美国国家研究委员会，2011年）中的规定。所有动物实验均在SPF（无特定病原体）设施中以无菌条件进行，并严格遵守来自不同政府机构（如美国国立卫生研究院）发布的《实验动物护理与使用指南》。相关实验方案已获得实验设施所属机构动物实验伦理委员会（例如，机构IACUC委员会）的批准。
1. 肿瘤移植的准备工作
- 动物饲养
- 将Balb/c裸鼠（n=5）饲养于独立通风笼具中，环境温度为20–26 °C，相对湿度为30–70%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，垫料为玉米芯，每周更换一次，自由摄取经辐照灭菌的干燥颗粒饲料和无菌饮水。
- 供体肿瘤组织制备
- 密切监测荷瘤供体小鼠的体重（BW，使用电子天平称量）和肿瘤体积（TV，使用游标卡尺测量）。
- 当肿瘤体积达到800–1000 mm3时，在生物安全柜中对荷瘤动物实施安乐死。
- 将小鼠放入带有盖子的安乐死舱，通过盖子向舱内输送CO
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结果
在光学显微镜下，PDXO 的形态特征与类器官典型形态一致，且经 H&E 染色证实与亲本 PDX 相符
在光学显微镜下，PDXO-CR2110 呈现典型的囊状结构（图 1A），这与既往报道的患者来源类器官（PDO）的形态相似，表明在相同培养条件下，PDXO 与 PDO 具有形态学上的相似性。
通过H&E染色进行的组织病理学检查显示，PDXO-CR2110（图1B）的组织结构和细胞类型与原始的PDX-CR2110（图1C）一致，表明PDX和PDXO均源自同一肿瘤样本CR2110。该结果为PDXO与其亲本PDX在组织病理学上的相似性提供了证据。
转录组表达与全外显子组测序显示 PDXO-CR2110 与亲本 PDX-CR2110 具有高度相关性
PDX-CR.......
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讨论
本报告中关于PDX-/PDXO-CR2110的初步数据表明，在基因组学、组织病理学和药理学方面，PDX与其衍生模型PDXO具有生物学等效性，因为两种模型均代表了源自患者原始肿瘤干细胞（CSC）的疾病形态。这两种模型均为患者来源的疾病模型，有望预测患者的临床治疗反应。10,11,12,21. 配对的 体外 和 体内 模型可以相互补充以 体外 筛选与验证 体内，提高药物发现的成功率，并可能降低临床开发中的淘汰率。值得注意的是，PDXO 现在可使高通量筛选（HTS）利用现有的大规模患者来源类器官文库，而 PDX 由于高昂成本和操作难度在此方面存在局限 体内 成本更高且耗时更长。毋庸置疑，匹配的PDX-PDXO文库有望在不久的将来成为支持药物发现和转化研究的首选平台。
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披露
所有作者均为 Crown Bioscience, Inc. 的现任或前任全职员工。
致谢
作者谨此感谢 Jody Barbeau 博士、Federica Parisi 和 Rajendra Kumari 对稿件的审阅与编辑。作者同时感谢 Crown Bioscience 肿瘤学体外与体内研究团队在技术方面所付出的大量努力。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高级DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | 基础培养基 |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | 洗涤液 |
| II型胶原酶 | Invitrogen | 17101015 | 消化肿瘤 |
| Matrigel | 康宁 | 356231 | 类器官培养基质（基底膜提取物，生长因子减量） |
| N-乙酰基 | Sigma | A9165 | 类器官培养基 |
| A83-01 | Tocris | 2939 | 类器官培养基 |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | 类器官培养基 |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 类器官培养基 |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | 类器官培养基 |
| 烟酰胺 | Sigma | N0636 | 类器官培养基 |
| SB202190 | Sigma | S7076 | 类器官培养基 |
| 胃泌素 | Sigma | G9145 | 类器官培养基 |
| R-spondin | Peprotech | 120-38-1000 | 类器官培养基 |
| L-谷氨酰胺 | Life Technologies | 35050038 | 类器官培养基 |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | 类器官培养基 |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | 15140122 | 类器官培养基 |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | 类器官培养基 |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | 筛选实验 |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | 筛选实验（发光型ATP指示剂） |
| 多通道分液器 | 赛默飞世尔科技 | Multidrop combi | 类器官铺板/CellTiter-Glo 3D 加样 |
| 数字分配器 | Tecan | D300e | 化合物添加 |
| Envision 酶标仪 | Perkin Elmer | 2104 | 发光检测 |
| Balb/c裸鼠 | 北京豪沃康生物科技有限公司 | ||
| RNAeasy Mini 试剂盒 | Qiagen | 74104 | tRNA 纯化试剂盒 |
| DNAeasy 血液 & 组织试剂盒 | Qiagen | 69506 | DNA纯化试剂盒 |
| Histogel | 赛默飞世尔科技 | HG-4000-012 | 类器官包埋 |
参考文献
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Gao, H., et al. High-throughput screening us....
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重印与许可
