我们描述了一种通过定量反转录聚合酶链式反应检测单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠肾脏中microRNA表达水平的方法。该方案适用于研究UUO小鼠以及其他病理条件下小鼠肾脏microRNA的表达谱。
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摘要
摘要
microRNA（miRNA）是一类单链非编码RNA分子，通常通过与信使RNA（mRNA）3'非翻译区（UTR）中部分互补的靶位点结合，在转录后水平调控基因表达，从而降低mRNA的翻译效率和稳定性。尽管已有研究探讨了小鼠多种器官和组织中的miRNA表达谱，但目前尚无针对小鼠肾脏miRNA纯化与定量的标准方法。我们建立了一种有效且可靠的方法，利用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）提取并评估肾间质纤维化小鼠模型肾脏中的miRNA表达。该实验方案包括五个步骤：（1）构建假手术组和单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型；（2）从小鼠UUO模型中获取肾脏样本；（3）从肾脏样本中提取包含miRNA在内的总RNA；（4）以miRNA为模板进行逆转录合成互补DNA（cDNA）；（5）利用cDNA进行qRT-PCR检测。通过该方案，我们成功证实：与对照组相比，肾间质纤维化小鼠模型肾脏中miRNA-3070-3p的表达显著升高，而miRNA-7218-5p和miRNA-7219-5p的表达则显著降低。本方案可用于检测UUO小鼠肾脏中的miRNA表达水平。
引言
microRNA（miRNA）是一类短链非编码RNA，可导致信使RNA（mRNA）的降解和转录抑制1，已被证实能够调控多种在生理和疾病过程中发挥关键作用的mRNA表达（例如炎症、纤维化、代谢紊乱和癌症）。因此，部分miRNA可能成为多种疾病的新型生物标志物和治疗靶点2,3,4,5。尽管已有研究描述小鼠脑、心、肺、肝和肾等器官和组织中的miRNA表达谱6,7,8,9,10，但目前尚无针对肾间质纤维化小鼠肾脏中miRNA提取与评估的标准方法。
我们设计了一种可重复的实验方案，用于纯化并检测肾间质纤维化小鼠肾脏中miRNA的表达。该方案包括以下五个主要步骤。（1）将8周龄的雄性C57BL/6小鼠分为两组：一组接受假手术处理（对照组），另一组接受单侧输尿管梗阻（....
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方案
所有动物实验方案均经日本医科大学动物伦理委员会批准，并依照日本医科大学实验动物使用与护理指南中的规定进行。
1. 假手术
- 准备以下物品：异氟烷、软木板、脱毛膏、实验室擦拭纸、含磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿、4-0 尼龙线、镊子、手术剪、棉签以及 8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠。
- 使用 1.5% 异氟烷对小鼠进行麻醉，并以 1.5% 维持麻醉。随后，将脱毛膏涂抹于小鼠腹部。数分钟后，用 PBS 浸润的实验室擦拭纸擦去脱毛膏。
- 向小鼠腹部注射 70% 乙醇，然后将小鼠仰卧位固定于软木板上。
- 使用手术剪和镊子在腹部皮肤做切口，并从膀胱至左侧肋骨下缘剪开肌肉层和腹膜。
- 用 PBS 润湿两根棉签，小心将肠管推向一侧。放置湿润的棉签以暴露左侧肾脏和输尿管。
- 缝合腹膜，然后用 4-0 尼龙线关闭切口。
2. UUO 手术
- 准备以下物品：异氟烷、软木板、脱毛膏、实验室擦拭纸、含 PBS 的培养皿、4-0 丝线、4-0 尼龙线、2.5 mL 注射器、棉签、镊子、手术剪和 8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠。
- 使用 1.5% 异氟烷麻醉小鼠，并以 1.5% 维持麻醉。然后将脱毛膏涂抹于小鼠腹部。数分钟后，用 PBS 浸润的实验室擦拭纸擦去脱毛膏。 ....
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结果
通过结扎8周龄雄性小鼠（体重20–25 g）的左侧输尿管，建立单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型，具体方法如文献21所述。使用4-0丝线对输尿管进行双重结扎以实现完全阻塞。术前及术后连续2天每日皮下注射镇痛剂（美洛昔康5 mg/kg）。术后第8天采集肾脏组织，用PBS冲洗，解剖后置于液氮中保存，用于后续分析。假手术小鼠作为对照组。若左肾出现肾积水，则表明双重结扎成功。基于该UUO模型获得的miRNA qRT-PCR数据表明，与对照组相比，UUO小鼠肾脏中miRNA-3070-3p的表达水平显著升高，而miRNA-7218-5p和miRNA-7219-5p的表达水平明显降低（图1）。
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讨论
上述qRT-PCR方案成功测定了靶向miRNA的表达水平。在获取有意义的qRT-PCR数据时，对提取的miRNA进行评估至关重要；为在qRT-PCR前确认miRNA的质量，应使用分光光度计检测其在260 nm与280 nm处的吸光度比值。若qRT-PCR无法获得预期长度和熔解温度的单一PCR扩增产物，或熔解曲线呈单峰形态，则可能存在DNA污染或反应板每孔中出现引物二聚体。
除qRT-PCR外，miRNA的表达水平还可通过多种方法进行检测，包括微阵列（microarray）、Northern印迹（northern blotting）和核糖核酸酶保护分析（ribonuclease protection assay）。然而，qRT-PCR是一种操作简便、高度可重复、准确且灵敏的方法，且与Northern印迹和核糖核酸酶保护分析相比，qRT-PCR所需的样本量更小22。此外，由于微阵列技术能够同时检测数万个miRNA的表达水平，因此可用于筛选候选的miRNA标志物。微阵列数据与qRT-PCR获得的数据总体上具有较高的相关性
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢 Edanz Group（https://en-author-services.edanzgroup.com/）的 Michelle Goody 博士对本文初稿的编辑工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Qiagen | 79216 | 洗涤缓冲液2 | |
| Qiagen | 1067933 | 洗涤缓冲液1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | 未指定 | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96孔反应板 | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 96孔反应板用粘性封膜 | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | 带膜固定式离心柱（置于2.0 mL收集管中） | |
| Qiagen | 218161 | 逆转录试剂盒 | |
| Qiagen | 218073 | 基于绿色染料的PCR试剂盒 | |
| Qiagen | 79654 | 生物聚合物离心柱（置于2.0 mL收集管中） | |
| Qiagen | 79306 | 基于苯酚/胍的裂解试剂 | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | 实时PCR仪 | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | 实时PCR仪软件 | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | 未披露 | |
| Takara Bio | 9790B | 硅基匀浆器 | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
参考文献
- Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
- Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.....
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