小鼠单侧输尿管梗阻模型中microRNA表达的定量实时PCR分析

摘要

我们描述了一种通过定量反转录聚合酶链式反应检测单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠肾脏中microRNA表达水平的方法。该方案适用于研究UUO小鼠以及其他病理条件下小鼠肾脏microRNA的表达谱。

摘要

microRNA（miRNA）是一类单链非编码RNA分子，通常通过与信使RNA（mRNA）3'非翻译区（UTR）中部分互补的靶位点结合，在转录后水平调控基因表达，从而降低mRNA的翻译效率和稳定性。尽管已有研究探讨了小鼠多种器官和组织中的miRNA表达谱，但目前尚无针对小鼠肾脏miRNA纯化与定量的标准方法。我们建立了一种有效且可靠的方法，利用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）提取并评估肾间质纤维化小鼠模型肾脏中的miRNA表达。该实验方案包括五个步骤：（1）构建假手术组和单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型；（2）从小鼠UUO模型中获取肾脏样本；（3）从肾脏样本中提取包含miRNA在内的总RNA；（4）以miRNA为模板进行逆转录合成互补DNA（cDNA）；（5）利用cDNA进行qRT-PCR检测。通过该方案，我们成功证实：与对照组相比，肾间质纤维化小鼠模型肾脏中miRNA-3070-3p的表达显著升高，而miRNA-7218-5p和miRNA-7219-5p的表达则显著降低。本方案可用于检测UUO小鼠肾脏中的miRNA表达水平。

引言

microRNA（miRNA）是一类短链非编码RNA，可导致信使RNA（mRNA）的降解和转录抑制¹，已被证实能够调控多种在生理和疾病过程中发挥关键作用的mRNA表达（例如炎症、纤维化、代谢紊乱和癌症）。因此，部分miRNA可能成为多种疾病的新型生物标志物和治疗靶点^2,3,4,5。尽管已有研究描述小鼠脑、心、肺、肝和肾等器官和组织中的miRNA表达谱^6,7,8,9,10，但目前尚无针对肾间质纤维化小鼠肾脏中miRNA提取与评估的标准方法。

我们设计了一种可重复的实验方案，用于纯化并检测肾间质纤维化小鼠肾脏中miRNA的表达。该方案包括以下五个主要步骤。（1）将8周龄的雄性C57BL/6小鼠分为两组：一组接受假手术处理（对照组），另一组接受单侧输尿管梗阻（UUO）手术，后者可诱导肾间质纤维化。（2）分别采集假手术组和UUO组小鼠的肾脏样本，在硅基匀浆器中分别进行匀浆处理，随后转移至微型离心柱上的生物聚合物降解系统^11,12。（3）利用基于二氧化硅膜的离心柱技术，从肾脏样本中提取包含miRNA的总RNA^12,13。（4）以所提取的总RNA为模板，在逆转录酶、多聚腺苷酸聚合酶和寡聚脱氧胸苷引物（oligo-dT primer）的作用下合成互补DNA（cDNA）^14,15。（5）采用嵌入染料法，通过定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测miRNA的表达水平^14,15。

本方案基于已获得有意义的miRNA提取与评估结果的多项研究^{11,12,13,14,15}，且该方案所采用的生物聚合物降解系统早在2006年即被证实可从组织中纯化出高质量的总RNA¹²。此外，先前的研究已验证了本方案中部分步骤的准确性与灵敏度（即利用逆转录酶、poly(A)聚合酶及oligo-dT引物，从提取的总RNA合成cDNA），可用于通过嵌入染料法qRT-PCR检测miRNA表达水平^14,15。由于新方案具有操作简便、节省时间以及减少技术误差等优势，因此适用于需要对中国台湾小鼠肾脏中miRNA表达谱进行准确且灵敏鉴定的研究。此外，该方案也可应用于多种病理状态的相关研究。

接下来，我们描述与肾间质纤维化相关的单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型中miRNA表达谱的测定方法。在人类中，肾间质纤维化是无论病因如何的慢性肾脏病和终末期肾病共有的常见且重要的特征^16,17。这种肾间质纤维化与肾功能衰竭的进展密切相关，其特征是间质区域细胞外基质成分（如胶原蛋白、纤连蛋白和α-平滑肌肌动蛋白）表达增加^17,18。

方案

所有动物实验方案均经日本医科大学动物伦理委员会批准，并依照日本医科大学实验动物使用与护理指南中的规定进行。

1. 假手术

1. 准备以下物品：异氟烷、软木板、脱毛膏、实验室擦拭纸、含磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿、4-0 尼龙线、镊子、手术剪、棉签以及 8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠。
2. 使用 1.5% 异氟烷对小鼠进行麻醉，并以 1.5% 维持麻醉。随后，将脱毛膏涂抹于小鼠腹部。数分钟后，用 PBS 浸润的实验室擦拭纸擦去脱毛膏。
3. 向小鼠腹部注射 70% 乙醇，然后将小鼠仰卧位固定于软木板上。
4. 使用手术剪和镊子在腹部皮肤做切口，并从膀胱至左侧肋骨下缘剪开肌肉层和腹膜。
5. 用 PBS 润湿两根棉签，小心将肠管推向一侧。放置湿润的棉签以暴露左侧肾脏和输尿管。
6. 缝合腹膜，然后用 4-0 尼龙线关闭切口。

2. UUO 手术

1. 准备以下物品：异氟烷、软木板、脱毛膏、实验室擦拭纸、含 PBS 的培养皿、4-0 丝线、4-0 尼龙线、2.5 mL 注射器、棉签、镊子、手术剪和 8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠。
2. 使用 1.5% 异氟烷麻醉小鼠，并以 1.5% 维持麻醉。然后将脱毛膏涂抹于小鼠腹部。数分钟后，用 PBS 浸润的实验室擦拭纸擦去脱毛膏。
3. 向小鼠腹腔注射 70% 乙醇，随后将小鼠仰卧位固定于软木板上。
4. 使用手术剪和镊子，在腹部皮肤做切口，并从膀胱至左侧肋骨下缘剪开肌肉层和腹膜。
5. 将 2.5 mL 注射器置于小鼠下方。取两根棉签，用 PBS 润湿。用镊子小心将肠管移向一侧，并适当放置湿润棉签以暴露左侧输尿管。用镊子轻轻提起左肾。
6. 使用 4-0 丝线在相距约 1 cm 的两个位置结扎左侧输尿管。在两处结扎点的中间剪断输尿管，然后使用 4-0 尼龙线缝合腹膜和切口。

3. 肾脏样本的采集

1. 准备以下物品：1.5 mL 微量离心管、异氟烷、软木板、70% 乙醇、含 PBS 的培养皿、镊子和手术剪刀。
2. 使用 1.5% 异氟烷麻醉小鼠，并以 1.5% 维持麻醉。向小鼠腹部注射 70% 乙醇，将小鼠仰卧置于软木板上。
3. 使用手术剪刀和镊子，在腹部皮肤做切口，并从膀胱向上至左侧肋骨下缘剪开肌肉层和腹膜。
4. 用镊子提起腹膜，用手术剪刀在腹膜上缘做横向切口，并沿肋骨最下缘继续剪开。
5. 随后，辨认左侧肾脏，用 PBS 反向灌注直至肾脏变为黄白色，以清除血管中的血液，然后用手术剪刀剪断左肾动静脉，将肾脏摘除。将肾脏放入培养皿中，并用 PBS 轻柔清洗。
6. 用手术剪刀和镊子将肾脏切成每份 10 mg 的组织样本（10 mg 是适合下一步操作的大小）。将每份肾组织放入单独的 1.5 mL 微量离心管中，并盖紧管盖。
7. 将每个微量离心管转移至液氮中，之后于 −80 °C 长期保存，待后续使用。

4. 从肾脏样本中提取总RNA

1. 准备以下物品：1.5 mL 微量离心管、2.0 mL 微量离心管、100% 乙醇、氯仿、硅胶匀浆器、冰、装于 2.0 mL 收集管中的生物聚合物离心柱^11,12、装于 2.0 mL 收集管中的膜锚定离心柱^12,13、基于苯酚/胍的裂解试剂、含胍和乙醇的洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 1）、含乙醇的洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 2）以及无 RNase 水。
2. 将 10 mg 肾组织样本放入硅胶匀浆器中，向匀浆器中加入 700 µL 基于苯酚/胍的裂解试剂。
3. 准备好匀浆器后，缓慢按压/旋转匀浆器的研杵，使其作用于肾组织样本以进行匀浆。重复按压/旋转操作，直至肾组织样本完全溶解于基于苯酚/胍的裂解试剂中。
4. 为进一步匀浆样本，将匀浆后的裂解液（置于 2.0 mL 收集管中）转移至生物聚合物离心柱中。
5. 在室温（RT）下以 14,000 x g 离心 3 分钟，然后将沉淀后的裂解液转移至一个新的 1.5 mL 微量离心管中。
6. 向管中的裂解液加入 140 µL 氯仿，然后 tightly 封闭管盖。通过将管倒置 15 次以充分混匀裂解液与氯仿。
   注意：氯仿可在无通风橱条件下使用。
7. 将每个样本在室温下孵育 2–3 分钟，然后在 4°C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟。
8. 小心操作，避免扰动沉淀物，将上清液（通常约为 300 µL）转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，然后加入 1.5 倍体积的 100% 乙醇（通常约为 450 µL）。涡旋混合 5 秒。
9. 将 700 µL 样本加载至置于 2.0 mL 收集管中的膜锚定离心柱中。盖紧柱盖，并以 15,000 x g 离心 15 秒。弃去收集管中的沉淀裂解液。
10. 向置于 2.0 mL 收集管中的膜锚定离心柱加入 700 µL 洗涤缓冲液 1，充分洗涤样本。盖紧柱盖，以 15,000 x g 离心 15 秒。弃去收集管中的沉淀裂解液。
11. 向置于 2.0 mL 收集管中的膜锚定离心柱加入 500 µL 洗涤缓冲液 2，以去除痕量盐分。盖紧柱盖，以 15,000 x g 离心 15 秒。弃去收集管中的沉淀裂解液。
    注意：膜锚定离心柱可分离 RNA 与 DNA。
12. 重复步骤 4.11。
13. 再次将置于 2.0 mL 收集管中的膜锚定离心柱以 15,000 x g 离心 1 分钟。弃去收集管中的沉淀裂解液。
14. 将膜锚定离心柱转移至新的 1.5 mL 收集管中。向柱中加入 30 µL 无 RNase 水以溶解总 RNA。盖紧柱盖，在室温下静置 5 分钟，然后以 15,000 x g 离心 1 分钟。
15. 将含有总 RNA 的全部样本转移至新的微量离心管中。将各管置于冰上，并通过分光光度法测定总 RNA 浓度。
16. 使用前，将含样本的各管于 −80 °C 保存以实现长期储存。

5. 利用总RNA的反转录合成cDNA

注意：MIQE（定量实时PCR实验发表的最低信息标准）指南的发布旨在促进更佳的实验实践，并帮助获得可靠且明确的结果¹⁹。在本方案中，使用逆转录酶、poly(A)聚合酶和oligo-dT引物，通过两步法从1.0 µg纯化的总RNA合成cDNA。

1. 准备以下物品：1.5 mL 微量离心管、带盖的八联管、每个八联管的管盖、蒸馏水、冰、逆转录试剂盒（参见材料表）^14,15（融化状态）、PCR仪和涡旋振荡器。
2. 启动PCR仪。
3. 配制预混液：将2.0 µL逆转录酶混合液（试剂盒提供）和2.0 µL 10x 核酸混合液加入4.0 µL 5x hi-spec缓冲液中（每管共得8.0 µL预混液）。
4. 将8.0 µL预混液加入八联管的每管中。
5. 调整总RNA浓度。为从肾组织样本中取1.0 µg总RNA溶于12 µL无RNase水中，根据步骤4.15中测得的浓度数据，将适量的总RNA转移至蒸馏水中。
   注意：若存在任何DNA污染，污染的DNA将在qRT-PCR中被共同扩增。
6. 向每管中加入12 µL总RNA，盖上管盖。离心15 × g，时间15秒。
7. 将八联管放入PCR仪中，37 °C孵育60分钟。随后立即在95 °C孵育5分钟，以完成cDNA合成。
8. 孵育完成后，将cDNA转移至新的1.5 mL微量离心管中，并用蒸馏水稀释10倍（1:10）。涡旋混匀后离心5秒。
9. 将稀释后的cDNA暂时置于冰上保存，并在使用前转移至−80 °C进行长期保存。

6. miRNA 的 qRT-PCR

注意：我们采用嵌入染料法进行miRNA的qRT-PCR检测。所用RNA引物包括U6小核RNA 2（RNU6-2）、miRNA-3070-3p、miRNA-6401、miRNA-7218-5p和miRNA-7219-5p。

1. 准备以下物品：1.5 mL 微量离心管、涡旋混合器、用于 qRT-PCR 的 96 孔反应板、96 孔反应板用粘性封膜、封膜压合器、96 孔离心转子、miRNA 特异性引物、实时 PCR 仪以及基于绿色染料的 PCR 试剂盒（参见材料表）^14,15，其中包含 2× PCR 预混液和 10× 通用引物。
2. 在 1.5 mL 微量离心管中混合以下组分并涡旋：6.25 µL 去离子水、1.25 µL 溶解于无核酸酶水中的 5 µM miRNA 引物、12.5 µL 2× PCR 预混液以及 2.5 µL 10× 通用引物。
3. 取按步骤 5 所述合成的 cDNA，解冻后涡旋并离心 5 秒。
4. 将步骤 6.2 中配制的试剂 22.5 µL 分装至 96 孔板的每个孔中。
5. 将 2.5 µL cDNA 分装至每孔中。
6. 使用封膜压合器将粘性封膜牢固地封在 96 孔板上。将板子使用 96 孔离心转子在 1,000 × g 条件下离心 30 秒，使反应液沉降至各孔底部。

7. PCR 循环

1. 启动实时荧光定量PCR系统，并将按步骤6.6所述制备的PCR板放入系统中。随后设置实验参数，确定实验名称，并选择以下选项： "96孔（0.2 mL）" 作为该系统的实验类型， "相对定量CT（ΔΔCT）" 作为定量方法， "SYBR Green 试剂" 用于检测目标序列的试剂，以及 "标准" 作为系统的运行。
2. 为样本和目标miRNA命名，然后为每个孔中的样本和目标miRNA指定名称。为确保结果的可靠性，样本应设置重复孔以获得适当的数据支持。选择一个参考样本和一个内参对照，并选择 "无" 将染料用作被动参照。为确保消除试剂交叉污染，必须设置miRNA表达的阴性逆转录对照和无模板对照。
3. 确保反应体积设置正确 "20 µL" PCR扩增条件设置为95 °C预变性15 min，随后进行40个循环：94 °C变性15 s，55 °C退火30 s，70 °C延伸30 s。
4. qRT-PCR 过程完成后，使用系统的软件程序分析 qRT-PCR 数据。确保软件程序自动选定的阈值线适用于每个孔。
5. 检查每个样本中内源性对照和目标miRNA的循环阈值（CT）值。CT值由扩增曲线与阈值线的交点确定。在本研究中，我们使用RNU6-2作为目标miRNA表达水平的内源性对照，并采用ΔΔCT法计算各目标miRNA的相对表达水平。²⁰.

结果

通过结扎8周龄雄性小鼠（体重20–25 g）的左侧输尿管，建立单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型，具体方法如文献²¹所述。使用4-0丝线对输尿管进行双重结扎，以实现完全梗阻。术前及术后连续两天每日皮下注射镇痛剂（美洛昔康，5 mg/kg）。术后第8天采集肾脏组织，用PBS冲洗后解剖，并保存于液氮中以备后续分析。假手术小鼠作为对照组。若小鼠左侧肾脏出现肾积水，则表明双重结扎成功。基于该UUO模型获得的miRNA qRT-PCR数据，与对照组相比，UUO小鼠肾脏中miRNA-3070-3p水平显著升高，而miRNA-7218-5p和miRNA-7219-5p水平明显降低（图1）。

讨论

上述qRT-PCR方案成功测定了靶向miRNA的表达水平。在获取有意义的qRT-PCR数据时，对提取的miRNA进行评估至关重要；为在qRT-PCR前确认miRNA的质量，应使用分光光度计检测其在260 nm与280 nm处的吸光度比值。若qRT-PCR无法获得预期长度和熔解温度的单一PCR扩增产物，或熔解曲线呈单峰形态，则可能存在DNA污染或反应板每孔中出现引物二聚体。

除qRT-PCR外，miRNA的表达水平还可通过多种方法进行检测，包括微阵列（microarray）、Northern印迹（northern blotting）和核糖核酸酶保护分析（ribonuclease protection assay）。然而，qRT-PCR是一种操作简便、高度可重复、准确且灵敏的方法，且与Northern印迹和核糖核酸酶保护分析相比，qRT-PCR所需的样本量更小²²。此外，由于微阵列技术能够同时检测数万个miRNA的表达水平，因此可用于筛选候选的miRNA标志物。微阵列数据与qRT-PCR获得的数据总体上具有较高的相关性

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Qiagen	79216	洗涤缓冲液2
Qiagen	1067933	洗涤缓冲液1
Tokyo Laboratory Animals Science	未指定
Thermo Fisher Scientific	4316813	96孔反应板
Thermo Fisher Scientific	4311971	96孔反应板用粘性封膜
Qiagen	MS00001701	5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3'
Qiagen	MS00065141	5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3'
Qiagen	MS00068067	5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3'
Qiagen	MS00068081	5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3'
Qiagen	217004	带膜固定式离心柱（置于2.0 mL收集管中）
Qiagen	218161	逆转录试剂盒
Qiagen	218073	基于绿色染料的PCR试剂盒
Qiagen	79654	生物聚合物离心柱（置于2.0 mL收集管中）
Qiagen	79306	基于苯酚/胍的裂解试剂
Thermo Fisher Scientific	4472380	实时PCR仪
Thermo Fisher Scientific	4472380	实时PCR仪软件
Qiagen	129112
Qiagen	MS00033740	未披露
Takara Bio	9790B	硅基匀浆器
ASKUL	GA04SW
AS ONE	ER1004NA45-KF2,62 -9968-32