Method Article

有条件 统计3 删除鼠标模型的骨骼表型分析

DOI:

10.3791/61390

⸱

July 3rd, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Science, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology, 2Department of Stomatology, Dalian Medical University, 3The 2nd Dental Center, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

此协议描述了一种规范的方法，以了解控制体内骨质疏松活动的关键基因。该方法采用转基因小鼠模型和一些规范技术来分析骨骼表型。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

转基因小鼠模型对于了解控制骨质疏松症分化和活动的关键基因，以及研究骨质疏松症的机制和药物治疗具有强大的作用。导热素K（Ctsk）-Cre小鼠已广泛用于骨质疏松的功能研究。转录3（STAT3）的信号传感器和活化剂与骨平衡有关，但它在体内骨质疏松中的作用仍然定义不明确。为了提供STAT3参与骨质疏松和骨代谢的体内证据，我们生成了一个骨质疏松特异性Stat3删除小鼠模型（Stat3 fl/fl:克茨克-克雷）并分析了其骨骼表型。微CT扫描和3D重建意味着有条件的淘汰小鼠的骨量增加。进行了H&E染色、钙素和阿利扎林红色双染色，以及耐酸磷酸（TRAP）染色，以检测骨骼新陈代谢。简言之，本协议描述了一些规范的方法和技术来分析骨骼表型和研究控制体内骨质活性的关键基因。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

骨骼骨是人体的主要承重器官，在行走和锻炼过程中受到来自内外环境的压力。在整个生命中，骨骼不断经历自我更新，由骨细胞和骨细胞平衡。骨细胞清除旧骨骼和形成新骨的骨骼的过程，保持了骨骼系统2的平衡和机械功能。平衡中的干扰可能会诱发骨代谢疾病，如骨质疏松症。骨质疏松症是由过度的骨质疏松症活动引起的，在全球普遍存在，给社会造成重大经济损失。根据可用于骨质疏松症治疗的药物数量有限及其不良反应的风险4，必须公布骨质疏松症形成和活动的细节。

从单核细胞/巨噬细胞血细胞系中提取的骨细胞具有多个核（可能有2至50个核），并且很大（通常直径大于100μm）2。虽然通过体外骨质疏松培养，对骨质疏松症药物的探索和药物筛选得到了广泛的改进，但复杂的有机反应使得体内证据成为靶向治疗不可或缺的。由于小鼠与人类的遗传和病理生理学相似性，基因工程小鼠模型常用于研究体内人类疾病的机理和药物治疗。Cre-loxP系统是一种广泛使用的小鼠基因编辑技术，使研究人员

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

与动物有关的所有方法均得到上海交通大学医学院动物保护与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 孕育骨质疏松特 异性Stat3 删除小鼠

注: 统计3fl/fl 小鼠是商业获得的。 克茨克-克里 小鼠由加藤（东京大学，东京，日本12）提供。这些小鼠是在标准化条件下在机构动物设施中特定的无病原体条件下繁殖和饲养的。

  1. 将性成熟的雄性小鼠与两只同龄雌性小鼠配对。18天后，检查新生儿的每日检查。分离怀孕的雌性小鼠，并在需要时单独保存。如果雌性小鼠在配对后1个月内未怀孕，则在不同的育种笼中更换雄性小鼠。
  2. 将统计 3fl/fl鼠标交叉到克茨克-克里小鼠 （F0）。剪辑的尾巴为基因，并保持男性Stat3fl/+:Ctsk-Cre小鼠，直到他们性成熟，这是大约6周的年龄（F1）。使用以下引物:统计3 F-TT加特格特克特克塔卡:统计3 R-塔加塔格卡卡卡:克茨克 - 克雷 F - 加克特加特加卡;克茨克 - 克雷 R - 克塔卡克格特克特克特克特克。
  3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用本协议，生成了骨质疏松特异性Stat3删除小鼠，以研究STAT3删除对骨质疏离的影响。Stat3Ctsk小鼠及其野生类型 （WT） 垃圾在基因化后繁殖和保存。骨髓巨噬细胞被分离并培养成骨细胞，并演示了Stat3Ctsk小鼠的STAT3缺失（图1）。

与WT小鼠（图2）相比，Stat3Ctsk小鼠的骨质增加。

通过H&E染色（图3）检查了WT和Stat3Ctsk小鼠股骨的组织形态。

TRAP染色检测出小鼠的骨质原活性。骨质疏松是T.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基因工程小鼠模型常用于研究人类疾病的机理和药物治疗。Ctsk-Cre小鼠已广泛应用于骨质疏松6的功能研究。本研究描述了分析骨骼表型和研究控制体内骨质活性的关键基因的方法的协议。

神学分析是检测骨代谢的最佳直观方法。石蜡部分的质量是组织学分析的基础。足够的时间对骨组织进行完全固定和贴花是非常必要的，因为骨组织可以被分割。专注于股骨和头骨的研究人员应该将股骨和头骨置于嵌入步骤的 90° 角度。为了进行可靠和高质量的组学分析，我们选择了软骨层对称的下垂石蜡部分，并在H&E染色中显示了清晰的M形线，代表了这些连续部分的适当角度和深度。另一方面，如果您需要观察膝盖关节和相邻的关节韧带，股骨和头骨应放置在120°角。

数十年来，TRAP一直作为骨质疏松功能14的生化标志物，因为它主要表现在骨质疏松15、16。<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢祖卫国教授和加藤教授为试剂和小鼠以及Zu实验室的成员进行了有益的讨论。我们还感谢上海第九人民医院颅面异常数字化口腔学研究中心的帮助。这项工作部分得到了中国国家自然科学基金委员会（NSFC）的资助 [81570950，81870740，81800949]， 上海峰会与高原学科，上海精密医学研究所、上海市第九人民医院、上海交通大学医学院（JC201809）的SHIPM-mu基金，上海交通大学医学院高层次创新团队激励项目，上海第九人民医院跨学科研究基金，上海交通大学医学院[JYJC201902]。L.J.是上海"医学人才之星"青年发展计划和上海交通大学"陈星"项目的学者。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4% 多聚甲醛溶液Sangon biotech Co.， Ltd.
上海丙酮实验试剂有限公司
茜素Sigma-AldrichA5533
氨溶液上海实验试剂有限公司
钙黄绿素Sigma-AldrichC0875
Ctsk-Cre小鼠日本东京大学 S. Kato 的礼物
DDSA电子显微镜科学13710
DeCa 快速脱钙剂Pro-CureDX1100
DMP-30电子显微镜科学13600
EDTA上海实验试剂有限公司60-00-4
嵌入 812 树脂电子显微镜 科学14900
荧光显微镜奥林巴斯IX73
苏木精溶液Beyotime BiotechanologyC0107
Micro-CTScanco MedicalAGμCT 80
NaHCO3上海实验试剂有限公司
中性香脂Sangon biotech Co.， Ltd.
NMAElectron Microscopy Sciences19000
石蜡桑贡生物科技有限公司
石切片机LeicaRM2265
Stat3fl/fl小鼠GemPharmatech Co.， LtdD000527
TRAP染色试剂盒Sigma-Aldrich387A
甲苯上海实验试剂有限公司1330-20-7
E6720028000036010018918E675007A601889二

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
  2. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  3. Cummings, S. R., Melton, L. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stat3 Deletion Mouse ModelOsteoclast DifferentiationSkeletal Phenotype AnalysisMicro CT ScanningTRAP StainingCalcein Alizarin Red LabelingH and E StainingParaffin SectioningBone Mass MeasurementOsteoclastogenic Activity

Related Articles