条件性Stat3基因敲除小鼠模型的骨骼表型分析

摘要

本方案描述了一种用于理解体内调控破骨细胞活性的关键基因的经典方法。该方法利用转基因小鼠模型和一些经典技术来分析骨骼表型。

摘要

转基因小鼠模型在研究调控破骨细胞分化和活性的关键基因，以及骨质疏松症的机制和药物治疗方面具有重要作用。Cathepsin K (Ctsk)-Cre 小鼠已被广泛用于破骨细胞的功能研究。信号转导及转录激活因子3（STAT3）在骨稳态中具有相关性，但其在体内破骨细胞中的作用仍不明确。为了提供STAT3参与破骨细胞分化和骨代谢的体内证据，我们构建了破骨细胞特异性的Stat3基因敲除小鼠模型（Stat3^fl/fl; Ctsk-Cre），并分析了其骨骼表型。显微CT扫描和三维重建结果显示，条件性基因敲除小鼠的骨量增加。通过苏木精和伊红（H&E）染色、钙黄绿素与茜素红双荧光标记染色，以及抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色来检测骨代谢情况。简而言之，本实验方案描述了一些经典的方法和技术，用于分析骨骼表型，并在体内研究调控破骨细胞活性的关键基因。

引言

骨骼是人体主要的承重器官，在行走和运动过程中会受到来自内部和外部环境的压力¹。人的一生中，骨骼持续进行自我更新，这一过程由成骨细胞和破骨细胞共同维持平衡。破骨细胞清除旧骨、成骨细胞形成新骨的过程，维持了骨骼系统的稳态和机械功能²。这种平衡的破坏可能导致骨代谢疾病，例如骨质疏松症。骨质疏松症由破骨细胞活性过度增强引起，在全球范围内广泛存在，给社会带来巨大的经济负担^2,3,4。鉴于目前可用于治疗骨质疏松症的药物种类有限且存在不良反应风险⁴，阐明破骨细胞形成及其活性的详细机制显得尤为重要。

来源于单核/巨噬细胞造血谱系的破骨细胞具有多个细胞核（可含2至50个细胞核），且体积较大（直径通常大于100 μm）²尽管通过osteoclastic疾病机制的探索和药物筛选已得到显著改进 体外 破骨细胞培养中，复杂的有机反应使得靶向治疗必须依赖体内实验证据。由于小鼠与人类在遗传学和病理生理学上的相似性，转基因小鼠模型常被用于在体内研究人类疾病的机制及药物治疗。⁶Cre-loxP 系统是一种广泛应用的小鼠基因编辑技术，使研究人员能够以组织/细胞特异性的方式研究基因功能⁵组织蛋白酶K（CSTK）是一种由破骨细胞分泌的半胱氨酸蛋白酶，能够降解骨胶原。⁸众所周知，CTSK 仅在成熟的破骨细胞中选择性表达；因此 Ctsk-Cre 小鼠被认为是研究破骨细胞功能的有用工具，并已被使用⁶.

信号转导及转录激活因子（STAT）家族在免疫以及癌症的发生和发展过程中具有经典且重要的意义^7,8在七种STAT蛋白中，STAT3被报道与骨稳态关系最为密切^9,10多项体内研究表明，在成骨细胞中特异性失活STAT3会降低骨形成^9,10然而，关于STAT3在体内破骨细胞形成和骨代谢中作用的实证证据仍然有限。最近，我们通过破骨细胞特异性的 Stat3 基因敲除小鼠模型（Stat3^fl/fl；Ctsk-Cre，下文称为 Stat3^Ctsk) 表明STAT3参与破骨细胞分化和骨代谢¹¹在本研究中，我们描述了用于分析骨量、骨组织形态学以及骨同化与骨分解代谢变化所采用的方法与实验方案 Stat3^Ctsk 小鼠，以研究破骨细胞特异性STAT3缺失对骨稳态的影响。

方案

本研究所涉及的所有动物实验方法均经上海交通大学医学院 Institutional Animal Care and Use Committee（IACUC）批准。

1. 骨巨细胞特异性Stat3基因敲除小鼠的繁育

注意：Stat3^fl/fl 小鼠购自商业来源。Ctsk-Cre 小鼠由日本东京大学的 S. Kato 提供¹²。小鼠在机构动物饲养设施中标准化的特定病原体阴性（SPF）条件下进行繁育和饲养。

1. 将一只性成熟的雄性小鼠与两只同龄雌性小鼠配对。18天后开始每日检查是否有新生仔鼠。如有必要，将怀孕的雌性小鼠分离并单独饲养。如果雌性小鼠在配对后1个月内未怀孕，需在不同繁殖笼之间更换雄性小鼠。
2. 将Stat3^fl/fl小鼠与Ctsk-Cre小鼠进行杂交（F0代）。剪取尾尖进行基因型鉴定，并保留性成熟后的雄性Stat3^fl/+; Ctsk-Cre小鼠，其性成熟年龄约为6周（F1代）。使用以下引物：Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA；Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA；Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA；Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC。
3. 将6周龄的雄性Stat3^fl/+; Ctsk-Cre小鼠与雌性Stat3^fl/fl小鼠杂交。剪取尾尖进行基因型鉴定，并保留性成熟后的雄性Stat3 ^fl/fl; Ctsk-Cre小鼠，其性成熟年龄约为6周（F2代）。
4. 将6周龄的雄性Stat3 ^fl/fl; Ctsk-Cre小鼠与雌性Stat3^fl/fl小鼠进行杂交（F3代）。剪取尾尖进行基因型鉴定，并及时用年轻小鼠替换老旧的繁殖小鼠（F3+N代）。

2. 标本采集

1. 分别使用二氧化碳窒息法处死六对8周龄雄性Stat3^fl/fl和Stat3^Ctsk同窝小鼠。
   注意：CO₂流速应每分钟置换笼内体积的30%（例如，对于45 cm × 30 cm × 30 cm的笼子，CO₂流速为40 L/min）。
2. 将小鼠仰卧放置，用手轻轻脱位双侧髋关节。使用眼科剪从胫骨远端垂直剪开皮肤，然后将后肢皮肤完全剥离。
3. 用剪刀剪断右侧髋关节和膝关节的关节韧带，分离后肢。剪除转子以及腓骨连接处，然后将后肢浸入4%多聚甲醛中。将右侧后肢保留用于第3步。在骨骼两端适当剪切，以确保骨髓能被4%多聚甲醛充分浸透并固定。
4. 用剪刀剪断左侧髋关节和膝关节的关节韧带，轻轻去除软组织，并小心分离胫骨和股骨。将胫骨和股骨分别浸入75%乙醇中。将股骨保留用于第4步，胫骨保留用于第6步。注意保持转子完整。

3. 石蜡切片制备

1. 将右后肢在4%多聚甲醛中4 °C固定48 h。
2. 脱钙：用1×PBS轻柔清洗标本，每次10 min，共3次。将标本置于15% EDTA（150 g EDTA溶于800 mL ddH₂O和100 mL 10×PBS）中，使用超声脱钙仪脱钙3至4周，直至骨骼可弯曲。每隔一天更换新鲜脱钙液。
3. 用1×PBS轻柔清洗标本3次，每次10 min，然后于4 °C下浸入75%乙醇过夜。
4. 脱水：第二天，依次将标本浸入95%乙醇、100%乙醇和二甲苯中，每种试剂各1 h，重复两次。
5. 将标本浸入1/2二甲苯与1/2石蜡混合液中30 min。随后在65 °C下浸入纯石蜡过夜。
6. 包埋：选择合适的包埋模具进行包埋。将胫骨均匀置于下方，股骨与胫骨呈90°角放置。待石蜡完全冷却凝固后，从包埋模具中取出。对标本编号，并于-20 °C保存过夜。
7. 使用切片机连续切取5 μm厚切片，共切20–40片。将切片展于37 °C水中，贴附于载玻片上，然后在42 °C下烘烤过夜。

4. 微型计算机断层扫描与分析

1. 使用微型CT扫描仪扫描左侧股骨。分辨率：10 μm；电压：70 kV；电流：114 μA；滤波：0.5 mm Al；旋转步长：0.5°。
2. 根据制造商说明，使用扫描仪配套软件重建皮质骨和小梁骨的三维图像。感兴趣区域（ROI）位于靠近远端生长板的1 mm宽小梁骨区域，以及位于股骨中段的1 mm宽皮质骨区域。
3. 计算定量的微结构参数：骨矿物密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、小梁厚度（Tb.Th.）、小梁数量（Tb.N.）、小梁间距（Tb.Sp.）以及皮质骨厚度（Ct.Th.）。

5. TRAP 染色

1. 将石蜡切片在 65 °C 下烘烤 30 分钟。
2. 脱蜡：将切片浸入二甲苯中 10 分钟，更换新鲜二甲苯重复此步骤共 3 次。
3. 水化：将切片依次浸入 100% 乙醇、95% 乙醇、70% 乙醇和 ddH₂O 中，每种溶液各 5 分钟，重复两次。
4. 根据 TRAP 染色试剂盒的说明书配制染色液，并预热至 37 °C。
   注意：TRAP 染色液应在每次实验前新鲜配制。
5. 向每个样本加入 50–100 μL 染色液，在 37 °C 湿润孵育盒中孵育 20–30 分钟。每 5 分钟在光学显微镜下观察破骨细胞的染色情况，直至可见红色多核破骨细胞为止。用 ddH₂O 终止反应。
6. 用苏木精溶液复染 30 秒。将切片浸入 1% 氨水溶液中 1 分钟，形成稳定的蓝色。用缓慢流动的自来水冲洗。
7. 用中性树胶封片，室温过夜干燥。
8. 用显微镜采集 3–5 个感兴趣的视野。使用 Image J 分析骨小梁周长：使用“直线”工具测量标尺长度（Ls）作为 L1，再使用“分段线”工具测量骨小梁周长长度作为 L2，实际长度（Lp）= Ls × L2 / L1。计数含有三个以上细胞核的 TRAP 阳性细胞数量。

6. 钙黄绿素与茜素红双重标记

1. 样本制备：在第0天腹腔注射20 mg/kg的钙黄绿素（calcein，1 mg/mL溶于2% NaHCO₃溶液），第4天腹腔注射25 mg/kg茜素红S（AL，2 mg/mL溶于H₂O）。第7天处死小鼠，小心分离胫骨，并在4 °C条件下用4%多聚甲醛固定48小时。
2. 脱水：固定后，用1×PBS轻轻洗涤胫骨3次，每次5分钟。随后将样本依次浸入95%乙醇、100%乙醇和二甲苯中，每种试剂各处理两次，每次5分钟。
3. 将样本浸入丙酮中12小时，再浸入1/2丙酮与1/2树脂的混合液中2小时，最后在纯树脂中置于干燥烘箱内过夜。
   注意：树脂按照商业可得的树脂产品（例如Embed 812 Resin）的说明书配制。
4. 包埋：将纯树脂加入合适的硅胶包埋模具中，轻柔放入样本以避免产生气泡。在60 °C干燥烘箱中聚合树脂48小时。
5. 使用旋转式切片机将样本连续切成5 μm厚的切片。其余样品连同干燥剂一起在室温下保存。
6. 用镊子将切片转移至一滴75%乙醇中贴片，使用中性树胶封片。用荧光显微镜采集红色和绿色荧光标记图像。
7. 测量两个标记线之间的宽度（Ir.L.Wi）、单标记小梁周长（sL.Pm）、双标记小梁周长（dL.Pm）以及总小梁周长（Tb.Pm）。计算矿化沉积率（MAR）和骨形成率（BFR/BS）。MAR = Ir.L.Wi / 间隔天数。BFR/BS = (dL.Pm ± sL.Pm/2) × MAR / Tb.Pm × 100%。

结果

采用本实验方案，构建了破骨细胞特异性Stat3基因敲除小鼠，用于研究STAT3缺失对破骨细胞分化的影响。Stat3^Ctsk小鼠及其野生型（WT）同窝小鼠经基因型鉴定后进行繁育和饲养。分离骨髓巨噬细胞并诱导其分化为破骨细胞，证实了Stat3^Ctsk小鼠中STAT3的缺失（图1）。

通过显微CT对股骨进行重建和定量分析表明，与野生型小鼠相比，Stat3^Ctsk 小鼠的骨量增加（图2）。

通过H&E染色检测了野生型和Stat3^Ctsk小鼠股骨的组织形态学（图3）。

讨论

转基因小鼠模型常用于研究人类疾病的发病机制及药物治疗¹³。Ctsk-Cre小鼠已广泛应用于破骨细胞的功能研究⁶。本研究描述了用于分析骨骼表型以及在体内研究调控破骨细胞活性的关键基因的方法流程。

组织学分析是检测骨代谢最直观的方法，而石蜡切片的质量是组织学分析的基础。由于骨组织容易碎裂，因此对骨组织进行充分的固定和脱钙至关重要。针对股骨和胫骨的研究人员，在包埋步骤中应将股骨与胫骨以90°角放置。为了进行可靠且高质量的组织学分析，我们选择矢状面石蜡切片，其中软骨层对称，并在H&E染色中呈现清晰的M形线条，这表明连续切片的角度和深度合适。另一方面，若需观察膝关节及邻近的关节韧带，则应将股骨和胫骨以120°角放置。

几十年来，TRAP 一直被用作破骨细胞功能的生物化学标志物¹⁴，因为它主要在破骨细胞中表达¹⁵

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% 多聚甲醛溶液	生工生物工程（上海）股份有限公司	E672002
丙酮	上海实验试剂有限公司	80000360
茜素红	Sigma-Aldrich	A5533
氨水溶液	上海实验试剂有限公司
钙黄绿素	Sigma-Aldrich	C0875
Ctsk-Cre 小鼠			东京大学东京校区 S. Kato 教授惠赠
DDSA	电子显微镜科学公司	13710
DeCa 快速脱钙剂	Pro-Cure	DX1100
DMP-30	电子显微镜科学公司	13600
EDTA	上海实验试剂有限公司	60-00-4
EMBED 812 包埋剂	电子显微镜科学公司	14900
荧光显微镜	奥林巴斯	IX73
苏木精溶液	碧云天生物技术	C0107
微型计算机断层扫描	Scanco Medical AG	μCT 80
NaHCO₃	上海实验试剂有限公司	10018918
中性树胶	Sangon Biotech Co., Ltd.	E675007
NMA	Electron Microscopy Sciences	19000
石蜡	Sangon Biotech Co., Ltd.	A601889
旋转式切片机	Leica	RM2265
Stat3fl/fl 小鼠	集萃药康有限公司	D000527
TRAP 染色试剂盒	Sigma-Aldrich	387A
二甲苯	上海实验试剂有限公司	1330-20-7