方法文章

实时测量完整功能性膜蛋白的核苷酸结合

3.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61401

⸱

2021年3月11日

 ,  , 
1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Department of Chemistry and Neuroscience Program, Trinity College

本文内容

摘要

本方案介绍了一种在细胞环境中实时测量腺嘌呤核苷酸与受体结合的方法。该结合过程通过三硝基苯基核苷酸衍生物与标记了非天然荧光氨基酸的蛋白质之间的荧光共振能量转移（FRET）进行检测。

摘要

我们开发了一种方法，用于在细胞或膜环境中测量腺嘌呤核苷酸与完整且具有功能的跨膜受体的结合。该方法结合了携带荧光非经典氨基酸ANAP标记的蛋白表达，以及ANAP与荧光（三硝基苯基）核苷酸衍生物之间的荧光共振能量转移（FRET）。本文展示了在去除了胞质侧的质膜以及电压钳制下的外翻膜片中，对ANAP标记的KATP离子通道进行核苷酸结合测量的实例。后者可同时检测配体结合与通道电流，从而直接反映蛋白质功能。文中深入讨论了数据处理与分析方法，并指出了潜在的问题与假象。该方法为研究KATP通道的配体依赖性门控行为提供了丰富的机制性见解，并可便捷地拓展应用于其他受核苷酸调控的蛋白质，或任何能够找到合适荧光配体的受体研究。

引言

若干重要类别的蛋白质直接受配体结合的调控，这些蛋白质包括可溶性酶以及膜嵌入蛋白，如受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联受体（GPCRs）和离子通道。G蛋白偶联受体和离子通道分别约占当前所有药物靶点的34%和15%1,2。因此，开发能够提供配体-受体相互作用机制信息的方法具有重要的生物化学意义和医学价值。传统的配体结合检测方法，如光亲和标记和放射性配体结合实验，通常需要大量部分纯化的蛋白质，并且一般在非生理条件和非生理时间尺度下进行。理想的方法应仅需少量蛋白质，可在细胞或膜环境中表达的完整蛋白质上进行，能够实时监测，并且可与蛋白质功能的直接读出兼容。

荧光共振能量转移（FRET）是一种用于检测两个荧光标记分子之间接近程度的方法3FRET 发生在激发态的供体荧光分子以非辐射方式将能量转移给受体分子（通常为另一种荧光分子）时。能量转移导致供体荧光发射被淬灭，同时敏化受体的发射（如果受体为荧光分子）。转移效率取决于供体与受体之间距离的六次方th 供体与受体之间距离的六次方成反比。此外，供体与受体必须足够接近（通常小于10 nm）才能发生FRET。因此，FRET可用于测量荧光标记的蛋白受体与荧光配体之间的直接结合。

多种不同的蛋白质通过结合细胞内或细胞外的腺嘌呤核苷酸（ATP、ADP、AMP、cAMP）而受到调控或激活。许多转运蛋白在其反应循环中需要ATP水解，包括ATP结合盒转运蛋白以及如Na+/K+泵等P型ATP酶4,5。ATP敏感性K+（KATP）通道、囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）以及环核苷酸调控通道均为由细胞内腺嘌呤核苷酸结合所门控的离子通道，因而对细胞代谢和信号转导的变化极为敏感6,7,8。嘌呤能P2X和P2Y受体则响应细胞外ATP的变化，后者可作为神经递质释放，或在组织损伤时释放9。我们已开发出一种基于FRET的检测方法，可用于实时测量腺嘌呤核苷酸与膜蛋白的结合。此前我们已将该方法应用于研究核苷酸与KATP通道的结合10,11。

为了通过FRET测量核苷酸结合，首先必须对目标蛋白进行荧光标记。荧光标签必须在目标蛋白的特定位点插入，使其与配体结合位点足够接近以发生FRET，同时需特别注意确保该标签不影响蛋白的整体结构和功能。为实现这一点，我们采用Chatterjee等人开发的技术，利用琥珀终止密码子抑制方法，在指定位置插入一种荧光非天然氨基酸（l-3-(6-乙酰萘-2-基氨基)-2-氨基丙酸；ANAP）12。我们通过ANAP标记的蛋白与荧光三硝基苯基（TNP）核苷酸衍生物之间的FRET来检测核苷酸结合（图1A）。ANAP的发射光谱与TNP-核苷酸的吸收光谱重叠，这是发生FRET所必需的条件（图1B）。本文中我们概述了两种不同的结合实验类型。第一种是在经超声处理去顶的细胞中，测量ANAP标记的KATP通道胞内侧与核苷酸的结合，该处理使细胞质膜碎片仍附着在玻璃盖玻片上10,11,13,14。

在第二种方法中，通过电压钳制技术测量膜片上ANAP标记的KATP通道与核苷酸的结合情况，从而可同时检测离子电流和荧光信号。结合这两种实验方法，可将结合状态的变化直接与通道功能的变化相关联11。本文讨论了典型实验结果、潜在的实验陷阱以及数据分析方法。

方案

1. 盖玻片的准备

注意：这些步骤必须在无菌的组织培养罩内进行。所给用量适用于制备10个培养皿。

  1. 将十片经高压灭菌的30 mm硼硅酸盐盖玻片分别放入十个35 mm未处理的无菌培养皿中，每片用2 mL无菌蒸馏水冲洗一次。
  2. 将1 mL的0.1%（w/v）聚-L将-赖氨酸溶液加入无菌蒸馏水中，定容至10 mL（终浓度为0.01% w/v）。充分混匀后，用移液器吸取1 mL滴加至每张盖玻片上，室温孵育20分钟。
  3. 吸出多聚物L-赖氨酸，每张盖玻片用至少2 mL无菌蒸馏水洗涤两次，静置至完全干燥，即至少3小时。

2. 接种 HEK-293T 细胞

注意：这些步骤必须在组织培养罩内进行。选择HEK-293T细胞是因为其电流背景低，且在培养中易于生长。本方案可适用于其他细胞类型。

  1. 用 12 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗一个 80-90% 汇合度的 HEK-293T 细胞 T75 培养瓶一次，然后加入 2 mL 胰蛋白酶孵育 2-5 分钟，或直至细胞完全脱落且几乎完全解离。
  2. 加入 10 mL 添加了 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）重悬细胞。轻轻吹打培养瓶底部，以分散残留的细胞团块。
  3. 向含有包被盖玻片的若干 35 mm 培养皿中各加入 2 mL 上述添加物的 DMEM 培养基，再向每皿中加入 100 µL 重悬的细胞悬液。在 37 °C 下孵育过夜。

3. 转染

注意：这些步骤必须在组织培养罩内进行。所列用量适用于10个培养皿的转染。对于位点特异性的ANAP掺入，目标标记位置的DNA密码子必须替换为琥珀（TAG）终止密码子。该构建体需与两个质粒共转染：pANAP 和 peRF1-E55D12,15。pANAP 编码多个ANAP特异性tRNA/tRNA合成酶对的拷贝。在存在ANAP的条件下，转染该质粒可产生携带ANAP的tRNA，该tRNA能够识别琥珀终止密码子。peRF1-E55D 编码一种显性负性核糖体释放因子，可提高全长ANAP标记蛋白的表达产量。

  1. 在1.5 mL离心管中加入10 µg pANAP、10 µg peRF1-E55D以及用于ANAP标记的构建体DNA，用未添加补充物的DMEM定容至500 μL。
  2. 在另一管中，每1 µg DNA加入3 µL脂质体转染试剂（见材料表），并用未添加补充物的DMEM定容至500 μL。
  3. 将DNA混合物与转染试剂混合液合并至同一离心管中，室温孵育20分钟。
  4. 将400 µL的1 mM ANAP储备液（三氟乙酸盐溶于30 mM NaOH中）加入20 mL含补充物的DMEM中，使ANAP终浓度为20 µM。将铺板细胞的旧培养基更换为每孔2 mL含ANAP的新培养基。
  5. 将10%的DNA转染混合液移取至每孔细胞中。实验前在33 °C下孵育2–4天。33 °C孵育可减缓细胞分裂并提高每细胞的蛋白表达量16。

4. 去除膜实验

  1. 使用镊子将含有转染细胞的盖玻片破碎成较小的碎片。
  2. 采用以下任一方法对细胞进行去顶处理。
    1. 若使用预包被的盖玻片，用 PBS 冲洗一片盖玻片，然后将其放入含有 2 mL PBS 的 35 mm 培养皿底部。将探头超声仪（50 W，20%–40% 振幅，3 mm 探头）置于样品上方 3–5 mm 处，短暂超声处理，以去除细胞顶部结构，留下贴附的质膜碎片（图2A，C).
      注意：可通过调整超声波破碎仪的功率、处理时间以及探头距样品的高度，以获得大量去顶膜，同时避免将盖玻片表面完全剥离。
    2. 若未使用预包被的盖玻片，请先用 PBS 冲洗盖玻片碎片，然后浸入含有 0.1% w/v 多聚赖氨酸的离心管中L-赖氨酸处理约30秒，随后短暂超声（如步骤4.2.1所述），以去除细胞顶部结构，留下去顶或部分去顶的质膜碎片（图2A、C、D）。短暂暴露于多聚-L-赖氨酸已被证明可增强对盖玻片的黏附性13.
  3. 将超声处理后的片段放入含有2 mL灌流液的35 mm玻璃底培养皿中，并置于倒置显微镜载物台上，显微镜配备高数值孔径60倍水浸物镜。显微镜的相机接口串联连接至光谱仪和高灵敏度CCD相机。使用蠕动泵以0.5–1 mL/min的流速向灌流腔持续灌注缓冲液。缓冲液的成分根据所研究的蛋白质而有所不同。
    注意：如果用户无法使用长工作距离物镜，可能难以聚焦于去屋顶的膜碎片，这是由于盖玻片额外增加了高度。另一种方法是直接将细胞接种到含有多聚-L-赖氨酸的培养皿中L-赖氨酸玻璃底（参见 材料表 例如）。这还将减少因透过两片玻璃聚焦而引起的潜在图像畸变。这些畸变不会影响所获取光谱的形状。
  4. 通过寻找通道荧光来识别表达ANAP标记通道的去屋顶膜片段图2C，D).
    注意：建议使用额外的荧光标记（其发射光谱可与ANAP的发射光谱相区分），以帮助识别含有目标蛋白的去被膜结构。本研究中的实验 图2C，D 在C端带有荧光蛋白标签的ANAP标记通道上进行。
  5. 将光谱仪遮罩部分开启（抬起约10%），置于显微镜的相机端口与光谱仪之间。遮罩的阴影将出现在相机图像上。通过调节显微镜载物台，使去顶膜与光谱仪遮罩对齐。采集去顶膜的明场和荧光图像，用于后续分析中选定感兴趣区域。
  6. 将微体积灌流系统的尖端靠近去除了膜的区域。
    注意：为了降低背景荧光，将灌流系统的流出端更换为由硼硅酸盐玻璃制成的定制尖端。
  7. 为了成像荧光光谱，使用385 nm LED光源，通过390/18 nm带通激发滤光片和416 nm边缘二向色镜激发样品膜，并通过400 nm长通发射滤光片收集发射光图2B).
  8. 接合光谱仪掩模，确保发射的光能够通过。安装光谱仪光栅（300 条/毫米）。光栅就位后，光谱仪衍射的光将投射到CCD相机芯片上，生成光谱图像。图3A）。这些图像保留了空间信息 y 维度。该 x 维度被替换为波长。
  9. 可选地，如果目标蛋白带有荧光蛋白标签，使用适当的滤光片组合采集该荧光蛋白的光谱图像。
  10. 在实验开始时，于灌注无核苷酸缓冲液的同时，采集一次或多次0.1-10秒的曝光图像。这些图像将用于校正和归一化后续实验中的数据（见下文第5节）。
    注意：曝光时间的选择取决于表达水平、荧光染料的亮度以及光学系统。应选择能够最大化信号并最小化观察到的漂白速率的曝光时间。4.10 中给出的曝光时间范围适用于平衡结合测量，也可用于测量较慢的动力学变化10使用短曝光时间追踪更快动力学的能力将受限于蛋白表达水平和光漂白，而非硬件。
  11. 应用一系列浓度的TNP-ATP（通常用灌流液配制）以建立浓度-反应曲线。每种溶液灌流时间不少于1分钟，以确保达到稳态，并用灌流液冲洗至少1分钟以洗脱每种浓度。
    注意：必须确保灌注系统能够迅速达到平衡（图 2E）并达到TNP-ATP的正确局部浓度（图 2F).
  12. 在每个浓度以及每次洗脱结束时，进行一次曝光（曝光时间与步骤 4.10 中所用时间相同）。

5. 光谱分析

注意：这些说明是针对分析代码“pcf.m”编写的，该代码可在 GitHub 上获取：https://github.com/mpuljung/spectra-analysis10。其他或替代代码可从 https://github.com/smusher/KATP_paper_201911 获取。本文已描述了软件执行的操作，以便用户可自行编写代码或选择手动分析数据。

  1. 在命令行中输入程序名称（“pcf”）以启动分析程序。
  2. 当打开带有提示的文件/文件夹选择对话框时：“选择用于 ROI 的文件”，选择与去顶膜的明场和荧光图像相关联的文件名。命令行将出现提示，要求输入输出文件的名称。
  3. 输入文件名，然后按回车键。
  4. 当软件显示明场和荧光图像时，根据软件提示，在光谱图像中选择与去屋顶膜片段或切除膜片（见第6节）位置相对应的兴趣区域（ROI）。在同一光谱图像中选择一个背景区域（代表与ROI相同的波长范围），该区域应对应于无膜附着的盖玻片或培养皿部分。图3A）。软件将提示点击顶部的 感兴趣区域 并按压 输入，点击底部的 感兴趣区域 并按压 进入 然后对背景区域重复此过程。
  5. 当打开文件/文件夹对话框并出现提示：“选择文件以获取荧光光谱选择与荧光蛋白（FP）光谱相关的文件名（可选步骤4.9）。如果未获取FP光谱，则选择其他光谱文件。FP光谱用于质量控制，以区分标记蛋白与背景荧光。
  6. 当打开带有提示的文件/文件夹选择对话框时： “选择用于分析的文件”，选择所有与ANAP光谱对应的文件（从步骤4.10至4.12），包括用于漂白校正所需的文件。
  7. 当打开文件/文件夹对话框时 以提示“开始选择用于漂白采集的文件”，选择步骤5.6中对应的子集文件，这些文件来自实验开始时在无核苷酸溶液中获取的初始光谱，或在无核苷酸溶液洗涤过程中获取的光谱，用于校正（来自步骤4.10至4.12）。
  8. 对每张图像进行线平均以生成光谱，即对所有像素的强度进行平均 y 每个波长下感兴趣区域（ROI）或背景区域的尺寸。图3B）。从ROI获得的平均光谱中减去经平均处理的背景光谱，以消除背景荧光及未结合TNP-ATP的荧光（图3C）。这些步骤由软件自动完成。
  9. 通过取减去背景光谱后ANAP峰周围5 nm窗口（通常约为470 nm，但可能因ANAP残基局部微环境的不同而有所变化）内荧光强度的平均值，确定每次曝光的ANAP荧光强度。
    注意： 图3D 显示了从表达ANAP标记通道的去屋顶膜片段连续采集的10秒曝光光谱，共6条。插图显示了每条光谱峰值的平均强度。软件将自动识别首次采集的光谱中的峰值波长，并在后续分析中沿用该值。强度将由软件自动计算。
  10. 通过将每次实验的 ANAP 强度归一化，即用特定曝光条件下的 ANAP 强度除以参考值，来实现归一化F通过时间序列中第一步4.10所获取的首次曝光的ANAP强度进行归一化 (F最大）。同样，软件会自动执行这些计算。
  11. 执行以下步骤以获取数据。
    1. 为校正ANAP光漂白，首先拟合单指数衰减，(F/F最大值) = A*exp(-t/τ)+(1-A)，其中 t 是累积暴露时间， τ 是时间常数，A 是振幅）拟合到 TNP-ATP 应用之间的中间洗涤步骤，或拟合到洗涤前多次初始暴露于 TNP-ATP 的数据图 3D（插图）。
      注意：软件将显示该拟合结果，并提示接受或拒绝。如果拒绝该拟合，将再次提供机会选择文件进行漂白校正。
    2. 将步骤 5.10 中归一化的 ANAP 光谱除以步骤 5.11.1 中指数拟合的预测值 在每个时间点（图3E).
      注意：以图示示例为例，在 50 秒时观察到的归一化峰值荧光为 0.65，而根据指数拟合预测的荧光值为 0.64。为校正漂白效应，将观察值（0.65）除以 图3E 插图，空心圆）与预测值（0.64， 图3E 插图，虚线）以获得校正值（约1, 图3E 插图，彩色圆圈）。如果漂白校正充分，则在无核苷酸条件下获取的所有曝光图像中，ANAP 的荧光强度应大致相等（图3E）。这些计算由软件自动完成。
    3. 获取输出结果，包括绘制数据的图像，以及包含原始光谱、相减光谱、经光漂白校正的光谱和各文件峰值数据的分页电子表格，以便进行后续分析。

6. 膜片钳荧光测定实验

  1. 使用厚壁硼硅酸盐玻璃毛细管拉制记录电极，当充灌电极液后，其电阻应为1.5 MΩ至2.5 MΩ。电极液的成分根据所研究的蛋白质不同而有所变化。
  2. 将载有转染细胞的盖玻片转移至含有2 mL浴液的35 mm玻璃底培养皿中，并置于配备高数值孔径60倍水浸物镜的倒置显微镜上。使用蠕动泵以0.5–1 mL/min的流速向浴槽中灌注浴液。浴液的成分根据所研究的蛋白质不同而有所调整，与灌流电极内液类似。
  3. 通过观察细胞膜上的荧光来识别表达ANAP标记通道的细胞。
  4. 用移液管溶液填充膜片电极。对电极施加轻微正压后放入浴槽室中。将电极轻压至细胞膜表面，并施加轻柔负压以形成吉欧姆（GΩ）封接。图4A).
  5. 通过快速将移液管 holder 移离来切除膜片 细胞图4A).
    注意：以这种方式切除斑块应 形成胞质面朝外的膜片，使蛋白质的胞质结构域暴露于灌流系统中。如果所研究的核苷酸结合位点不位于胞质侧，则需采用胞外侧朝外的膜片或全细胞记录模式来进行PCF实验。
  6. 将膜片电极尖端靠近灌流系统的尖端，并检查膜片是否位于光谱仪掩模的狭缝内（图4A).
  7. 应用TNP-ATP并按照步骤4.10–4.12进行光谱成像，同时记录核苷酸施加引起的离子电流反应。
    注意：移液管玻璃可能会在所获取的图像中引入空间像差和反射。然而，这些像差不会影响所获取光谱的形状，且通过光谱仪或长通发射滤光片可轻松将反射的激发光与荧光信号分离。
  8. 分析光谱。从切除的膜片获得的光谱可能由于TNP-ATP被玻璃制膜片电极排斥，导致未结合的TNP-ATP荧光被过度扣除图4C-E）。这种过度减扣不会影响ANAP发射光谱，因此可以忽略。
    注意：由于剥离膜片中的荧光信号将低于去顶膜中的信号，因此重要的是使用一个能够提供足够高信噪比同时不会过快漂白ANAP的曝光时间。

结果

图2 展示了通过超声处理获得的去顶膜片段中，测量核苷酸与荧光蛋白结合的基本实验装置（图2A，B）。为获得去顶膜，采用了两种不同方法：直接将细胞培养在聚-L-赖氨酸L-赖氨酸包被的盖玻片，或在未处理的玻璃上培养细胞，随后短暂暴露于聚-L-赖氨酸（0.1% 溶于水）处理，然后进行去顶。 图2C 展示了一个表达K的HEK-293T细胞的典型去屋顶膜片片段ATP 用橙色荧光蛋白（OFP）标记的通道。在明场图像中，去除了上膜的膜结构几乎不可见，需通过标记的膜蛋白荧光或使用十八烷基罗丹明B等膜染料进行复染来识别。13除了裸露的膜结构外，对HEK-293T细胞进行超声处理还产生了部分去顶的细胞碎片（图 2D)10,17这些碎片在明场下可见，可能是由于质膜皱褶且与盖玻片贴附不良所致。或者，这些碎片可能含有来自细胞内细胞器的囊泡和膜结构。因此，最好仅从标记的“真正”去顶膜区域获取图像，因为与细胞内膜结构相关的靶蛋白信号可能反映的是翻译后加工和组装的中间阶段。将细胞培养在多聚-L建议使用-赖氨酸包被的玻璃，因为这在超声处理后能获得更高产量的“真实”去顶膜。

采用微体积灌流系统对荧光核苷酸进行灌注，以尽量减少典型实验所需的试剂用量（图2B）。在我们的灌流装置中，将原配的聚酰亚胺涂层玻璃尖端替换为手工拉制的硼硅酸盐玻璃尖端，从而降低了荧光背景信号。为了尽量减少成像过程中去顶膜周围核苷酸的积聚，整个浴槽腔室被缓冲液缓慢灌流。因此，我们希望测量微体积灌流系统的溶液更换速率，并验证是否能够在目标区域（即去顶膜所在区域）达到预期的配体浓度，也就是说，灌流系统中的配体在到达去顶膜之前不会被直接稀释到浴液中。为排除这些可能性，我们测量了微体积灌流系统将50 μM四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺（TMRM）溶液定向灌注至载玻片底部培养皿表面（该培养皿中预先灌注了水）时的流入和洗脱过程（图2E）。溶液交换动力学具有良好的可重复性，且可用单指数衰减模型拟合，流入和洗脱的时间常数均小于1 s。此类溶液交换时间限制了我们在当前装置下测量配体结合与解离动力学的能力。为验证我们是否能在盖玻片表面实现目标配体浓度，我们将微体积灌流系统输送至盖玻片的50 μM TMRM的荧光强度与静止浴液中的50 μM TMRM荧光强度进行了比较（图2F）。两者之间未观察到强度差异，证实即使在持续灌流的浴液条件下，使用微体积灌流系统仍可在盖玻片表面实现准确的配体浓度。

图3A 显示了从暴露于 5 μM TNP-ATP 的 HEK-239T 细胞去顶膜中获得的 ANAP 标记的 KATP 通道的光谱图像。为了获得此类图像，来自去顶膜的发射光被引导通过与 CCD 相机串联的光谱仪。发射的荧光经光栅衍射后投射到相机芯片上，形成光谱。所得图像在 y 维度上保留了空间信息，而 x 维度则被波长取代。感兴趣区域（ROI），即对应于去顶膜的区域，以橙色标出。图像中可见两个高强度区域，分别对应 ANAP 和 TNP-ATP 的发射峰。这一点在 图3B 所示的（在整个 ROI 上平均的）逐波长平均光谱中表现得最为清晰。约 470 nm 处的峰对应于整合到 KATP 中的 ANAP；约 535 nm 处的峰对应于 TNP-ATP。为了校正背景荧光以及溶液中 TNP-ATP 的直接激发，从每幅图像中选择了一个背景区域（图3A，灰色）。平均背景光谱如 图3B 所示。最终光谱是通过从平均 ROI 光谱中减去平均背景光谱获得的（图3C）。

ANAP 容易产生光漂白伪影。图 3D 显示了多次曝光后 ANAP 荧光峰值的降低。在无 TNP-ATP 时（或在不同浓度 TNP-ATP 之间洗涤时）多次曝光所获得的荧光峰值数据通过单指数衰减进行拟合，并以此校正光漂白伪影（图 3E）。建议从低到高以及从高到低两个方向进行核苷酸浓度-反应实验。如果漂白校正未引入额外的伪影，则实验结果应具可比性11。

图5A 显示了从表达ANAP标记的KATP通道的细胞中获得的去屋顶膜在无TNP-ATP和有TNP-ATP条件下的代表性光谱图像。图5B 显示了校正后的光谱。通过观察发射光谱，可明显区分供体与受体的荧光发射峰。由于在未转染的HEK-293T细胞的天然质膜上观察到TNP-ATP存在一定的非特异性结合，因此建议将FRET量化为供体（ANAP）荧光强度的降低10,11。该峰信号特异性地来源于标记的受体。

对于能够诱导其受体发生构象变化的配体，单独进行的结合研究无法提供关于配体结合过程的直接且具有机制意义的信息18。配体结合的浓度-反应关系不仅取决于其内在结合亲和力，还取决于配体结合所诱导的构象变化，以及受体在无配体情况下自发发生构象变化的倾向性。为了更深入地理解配体-受体相互作用背后的机制，可将结合测量与能够报告蛋白质功能的实验相结合。在这方面，离子通道是一个理想的模型系统，因为利用电压钳技术，可以在亚毫秒时间分辨率下，直至单分子水平检测其电流。历史上，电流与荧光的联合测量为研究电压门控和配体门控离子通道的开放与关闭（门控行为）提供了重要见解19,20,21。已有实验实现了对离子电流和荧光标记的环核苷酸与多种环核苷酸调控通道结合过程的同步测量22,23,24。这些研究采用了一种在结合后量子产率升高的配体。通过共聚焦显微镜对膜片成像，可以扣除膜片附近溶液体积中未结合配体产生的荧光背景22,23。在我们的研究中，配体结合是通过ANAP荧光的降低来检测的。由于该信号特异性地来源于通道本身，且ANAP与TNP-ATP之间的FRET效应具有强烈的距离依赖性（半最大效应距离约为~43 Å），因此可避免非特异性结合或游离核苷酸对信号的干扰。

图4A展示了一个典型的膜片钳荧光测定（PCF）实验。将充满生理盐水的硼硅酸盐玻璃移液管（连接至电压钳放大器）与表达ANAP标记的KATP的细胞之间形成高阻封接（吉欧姆级）。封接形成后，将移液管从细胞上拉开，从而暴露细胞内核苷酸结合位点。随后将移液管置于显微镜物镜上方，并对准光谱仪狭缝，同时将微型灌流系统（经硼硅酸盐玻璃尖端改装）的流出端靠近移液管（图4D）。通过电压控制并记录膜片中通道的电流。图中图4B展示了来自ANAP标记的KATP通道的代表性电流和光谱，颜色编码以使光谱与相应电流匹配。发射光谱的背景和漂白校正方法与去顶膜实验相同。

TNP-ATP 和 ANAP 的化学结构、发射-吸收光谱；示意图；发射分析。
图 1：ANAP 与 TNP-ATP 构成合适的 FRET 配对。（A）ANAP 与 TNP-ATP 的结构。荧光部分已标出。（B）ANAP 与 TNP-ATP 的吸收光谱和荧光发射光谱。FRET 的发生需要 ANAP 的发射光谱与 TNP-ATP 的吸收光谱之间存在重叠。改编自 Puljung 等（发表于 Creative Commons 署名许可协议下，https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）10。请点击此处查看此图的放大版本。

细胞荧光实验示意图；显微镜设置；荧光图谱分析；光谱学结果。
图2：在去顶质膜中测量核苷酸结合 (A) 表达荧光膜蛋白的贴壁细胞去顶质膜的制备示意图。提供了针对在多聚-L-赖氨酸L-赖氨酸包被或未处理的盖玻片。B用于测量去顶膜中核苷酸结合的实验装置。C) 表达橙色荧光蛋白（OFP）标记的K通道的细胞所来源的完全去屋顶质膜的明场与荧光图像ATP 通道。星号标记了膜的位置，该位置在明场图像中几乎不可见。OFP通过531/40 nm带通滤光片和562 nm边缘二向色镜，由565 nm宽谱LED激发，发射光通过593/40 nm带通滤光片收集。(D部分剥离的膜片段的明场和荧光图像，该膜片段来源于表达橙色荧光蛋白（OFP）标记的K的细胞ATP 通道。 (E使用B中所述装置获得的溶液交换时间进程。展示了五次技术重复。微体积灌流系统中加载了 50 μM 四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺（TMRM）。灌流液以约0.5 mL/min的流速持续灌注。对洗入（荧光增强）和洗出（荧光减弱）过程的时间曲线数据拟合为单指数衰减形式 F = A*exp(-x/τ) + y0. 时间常数（τ洗入的时间常数约为 0.6 s，洗出的时间常数约为 1.0 s。TMRM 通过 540/25 nm 带通滤光片和 565 nm 边缘二向色镜，由宽谱 565 nm LED 激发，并通过 605/55 nm 带通滤光片收集发射光。F) 荧光强度的比较 50 μM 使用微型灌流系统施加TMRM溶液，如B所示，以及含有静止浴液的环境 50 μM TMRM 请点击此处以查看此图的放大版本。

荧光分析；示意图、光谱测量、ROI 研究、光学装置、数据拟合图。
图 3：背景扣除与漂白校正。（A）表达 ANAP 标记的 KATP 通道细胞的去包膜质膜的光谱图像（y 维度为空间信息，x 维度为波长）。使用 图 2B 中描述的装置施加 5 μM TNP-ATP。橙色框表示感兴趣区域（ROI），对应去包膜的膜区域。灰色框表示用于校正光谱的背景区域。（B）由 A 中 ROI 和背景区域逐波长平均得到的发射光谱。（C）通过将 B 中平均 ROI 光谱减去平均背景光谱得到的光谱。用于确定平均强度的 ANAP 峰值周围 5 nm 窗口以灰色阴影区域显示。（D）从表达 ANAP 标记的 KATP 通道细胞的去包膜质膜连续六次 10 秒曝光中获取的光谱。注意由于光漂白导致的荧光强度下降。插图显示了用单指数衰减函数 F/Fmax = A*exp(-t/τ) + (1-A) 拟合的归一化峰值荧光。插图中的符号按颜色编码以匹配相应的光谱。（E）对 D 中相同光谱进行光漂白校正后的结果。插图中空心圆圈表示 D 中的归一化峰值荧光，实心圆圈表示校正后的峰值荧光。请点击此处查看该图的放大版本。

膜片钳方法示意图；荧光光谱；ATP浓度效应；显微镜图像。
图4：使用膜片钳荧光法（PCF）同时测量核苷酸结合与通道电流。（A）用于测量核苷酸结合和离子电流的实验装置示意图。（B）从表达ANAP标记的KATP通道的细胞中分离出的膜片所获得的示例电流（左）和光谱（右）。电流记录时钳制电位为-60 mV，采样频率为20 kHz，滤波频率为5 kHz。灰色阴影区域对应于用于量化ANAP荧光强度的波长范围。改编自Usher等（发表于Creative Commons署名许可协议下，https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）11。（C）从表达ANAP标记的KATP通道并暴露于1 mM TNP-ATP的细胞中分离出的膜片所获得的光谱。注意对应于TNP-ATP荧光观测波长范围的负峰。灰色阴影区域表示如B图中用于量化ANAP荧光的波长范围。改编自Usher等（发表于Creative Commons署名许可协议下，https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）11。（D）暴露于1 mM TNP-ATP的膜片移液管的明场与荧光图像。星号标记移液管尖端位置。（E）同一根在1 mM TNP-ATP中的膜片移液管的光谱图像。星号标记移液管的位置。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光光谱；TNP-ATP浓度效应；发射分析；图；nm与强度关系。
图 5：TNP-ATP 与标记 ANAP 的 KATP 通道的结合。（A）表达标记 ANAP 的 KATP 通道的细胞去顶质膜在无 TNP-ATP 或含有 50 μM 或 1 mM TNP-ATP 条件下的光谱图像。强度以热图形式显示。（B）来自 A 图像的逐波长平均光谱，显示 TNP-ATP 对 ANAP 荧光的淬灭效应。阴影区域代表两种不同的带通滤光片，可在无光谱仪时用于测量 ANAP 的淬灭。请点击此处查看此图的放大版本。

剂量-反应曲线，F/Fmax 与 [TNP-ATP] 的关系图，显示配体结合研究的数据分析。
图 6：TNP-ATP 在去顶膜和PCF中对ANAP标记的KATP通道的荧光淬灭效应。数据来自 Usher 等人（根据知识共享署名许可协议发布，https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）11。数据拟合至Hill方程：F / Fmax = Emax + (1 – Emax) / (1+10(EC50 – [TNP-ATP])*h)。F 为测得的荧光强度，Fmax 为无核苷酸时的最大荧光强度，Emax 为核苷酸饱和浓度下的最大淬灭程度，h 为Hill斜率。EC50（淬灭达到最大一半时的核苷酸浓度）和 [TNP-ATP] 均为对数值。去顶膜：EC50 = -4.59（25.7 μM），h = 0.82，Emax = 0.93；PCF：EC50 = -4.11（77.6 μM），h = 0.87，Emax = 1.00。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

我们开发了一种实时测量腺苷酸核苷酸与完整膜蛋白结合的方法。该方法结合了多种已建立的技术，包括利用琥珀终止密码子抑制技术通过ANAP对蛋白质进行标记12、细胞去顶（cell unroofing）14，以及电压钳荧光测定法/PCF19,20,21,22,23,24,25。这些技术的整合使得我们能够以高空间和时间分辨率测量核苷酸的结合。事实上，在我们之前的研究中，已利用该方法成功区分同一蛋白复合物上的不同结合位点10,11。重要的是，该技术可直接应用于细胞环境中少量的蛋白质，并在保持蛋白质功能的条件下进行。将我们的结合检测方法与离子通道电流的直接电生理读数相结合，使我们能够深入理解通道门控的分子机制11。

由于光谱仪并非标准的实验设备，因此也可以使用带通滤光片相对独立地监测ANAP的荧光强度。图5B展示了两种此类滤光片的光谱特性。470/10 nm带通滤光片能有效屏蔽TNP-ATP的荧光信号，并且与ANAP荧光的峰值区域有良好的重叠。然而，该滤光片的最大透射率仅为约50%，这可能导致在荧光较弱的膜（或在电压钳制下的游离膜片）上难以获得良好的信号。另一种选择是460/60 nm带通滤光片。与470/10 nm滤光片相比，460/60 nm滤光片与TNP-ATP发射峰的基部有稍多一些的重叠。然而，460/60 nm带通滤光片在ANAP荧光峰值的较宽范围内具有90–95%的透射率，因此有望显著增强荧光发射信号。

ANAP 是一种对环境敏感的荧光团12,26,27。其发射峰和量子产率会因在目标蛋白中插入位点的不同而变化，并可能随着蛋白构象的改变而发生改变。此类变化在发射光谱中可立即显现，但若使用滤光片测量 ANAP 荧光强度，则可能不够明显。无论何种情况，均需设置适当的对照实验，以证明荧光信号的变化并非由核苷酸结合后 ANAP 周围局部环境改变所致。使用未标记核苷酸进行对照实验，有助于验证 ANAP 荧光强度的任何变化是否确实源于 ANAP 与 TNP-核苷酸之间的荧光共振能量转移（FRET）。TNP-核苷酸可能非特异性地结合于未转染细胞来源的膜结构（包括质膜或内源膜蛋白）10。我们将供体荧光的减少量作为结合的量化指标，因为该信号特异性地来源于标记通道。然而，我们建议针对每一对激动剂/受体进行额外的对照实验，例如在已知情况下对核苷酸结合位点进行突变，以确认供体荧光的变化确实是由激动剂直接结合至标记受体所引起11。最后，建议使用除 ANAP 标记外还带有荧光蛋白标签的构建体。这有助于将标记受体的荧光与背景荧光/自发荧光区分开来。背景荧光可通过发射光谱的峰值和形状与 ANAP 区分10，但若仅使用滤光片组，则此类判断可能极为困难。此外，可通过荧光蛋白标签来识别表达荧光受体的细胞和去包被膜结构，而无需激发 ANAP，从而避免过度光漂白的风险。

在许多PCF记录中，我们观察到在高浓度TNP-ATP条件下，光谱中出现明显的负峰（图4C）。该负峰是我们背景扣除流程产生的人工假象。图4D展示了暴露于1 mM TNP-ATP的膜片电极的明场和荧光图像。在电极尖端可见阴影，这是由于TNP-ATP被排除在电极管壁所占体积之外所致，该现象在焦平面内尤为明显。图4E中的光谱图像显示了一条暗带，对应于该阴影区域。当使用该暗带上方或下方的区域进行背景扣除时，便会生成负峰。重要的是，该峰出现在与TNP-ATP发射光谱相对应的波长范围内，并未影响我们对ANAP淬灭的测量结果。

我们实验的主要局限在于获得足够的ANAP标记构建体的质膜表达以进行荧光检测。由于无胞膜细胞膜样本尺寸较大，且可快速扫描整皿样本，因此通常比膜片钳荧光法（PCF）更容易获得高质量光谱，而在PCF中只能逐个获取膜片。在我们的实验中，无胞膜细胞膜与PCF实验的数据相似但并不完全相同（图6）11。然而，并无先验理由认为这一现象具有普适性，因为移液管膜片中的蛋白质可能处于与无胞膜细胞膜中不同的功能状态。

本研究中，我们尝试通过多种方法最大化ANAP标记构建体的表达，特别是将细胞培养温度降低至33 °C10,11,16。根据我们的经验，试图在蛋白中选择对ANAP为保守性替换的位点，并不能始终获得表达良好的构建体。相比之下，我们更成功的方法是系统性地扫描整个蛋白区域以寻找ANAP插入位点，并对候选位点进行表面表达的筛选10。ANAP标记系统也可在Xenopus laevis卵母细胞中使用，这使得可分离出更大的膜片，从而提高信噪比26,27,28。

尽管预期较高的表达水平会产生更强的荧光信号，但检测荧光所需的最少通道数量取决于多个因素，包括荧光染料的亮度、光漂白程度、激发光强度以及焦平面位置。理论上，可通过关联荧光强度与通道电流来进行估算，此前已有相关报道28,29。然而，此类估算的可靠性需要了解单通道电导以及通道开放概率。除上述因素外，与囊泡或粘附在移液管玻璃上的质膜片段相关的通道也会影响荧光信号，而这些通道并未处于电压钳制状态。

该方法可轻松适用于其他核苷酸敏感性离子通道的研究。CFTR在结构上与KATP通道的辅助亚基磺酰脲受体相似30,31。与KATP类似，CFTR的门控行为受核苷酸结合调控，因此成为本方法显而易见的未来研究靶点7。嘌呤能P2X受体是一类由细胞外ATP激活的离子通道9。TNP-ATP可作为P2X受体的拮抗剂32,33，因此不适合用于研究P2X的激活过程，但可用于与P2X激动剂的竞争性结合实验。或者，也可使用其他具有足够光谱重叠ANAP发射光的荧光ATP衍生物来研究其激活机制。Alexa-647-ATP是一种荧光标记的P2X激动剂34。Alexa-647与ANAP之间的计算R0值约为85 Å，这意味着若Alexa-647-ATP直接结合至P2X受体，应会导致通道中整合的ANAP发生显著的荧光淬灭。然而，如此长的R0值也可能导致结合于相邻亚基的Alexa-647-ATP产生淬灭效应，并增加非特异性核苷酸结合引发FRET的可能性。由于P2X受体的配体结合位点位于细胞外，结合测量可在完整细胞、全细胞电压钳或外向膜片上进行。本方法还可拓展用于研究依赖ATP反应循环的生电性与非生电性转运蛋白和泵，以及G蛋白偶联的P2Y受体的结合与激活过程。最后，尽管本方法最初是为检测腺嘌呤核苷酸结合（如TNP-ATP、TNP-ADP、TNP-AMP）而开发，但只要已鉴定出合适的荧光配体，该策略原则上可应用于几乎任何受体的配体结合研究。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢 Raul Terron Exposito 提供出色的技术支持。本工作由生物技术和生物科学研究理事会（BB/R002517/1；MCP 和 FMA）和惠康信托基金会（203731/Z/16/A；SGU）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
T75 组织培养处理烧瓶StarLabCC7682-4875
0.1% w/v 聚-L-赖氨酸Sigma-AldrichP8920
30 mm 硼硅酸盐盖玻片VWR631-0174
35 mm 未处理无菌培养皿CytoOneCC7672-3340
35 mm 玻璃底培养皿WPIFD35-PDL-100
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基 (DMEM)Gibco31966021
胎牛血清 (FBS)Gibco10500-064
青霉素/链霉素Gibco15140-122
TrypLE select (胰蛋白酶)Gibco12563-011胰蛋白酶/EDTA 试剂
磷酸盐缓冲液 (PBS)Gibco14040-091
UltraPure 去离子水Invitrogen10977-035
HEK293T 细胞ATTCCRL-3216传代 5–30 次之间使用
ANAP-TFAAsisChemASIS-0014用 30 mM NaOH 重悬至终浓度 1 mM
pANAP 表达质粒AddgenePlasmid #48696编码用于表达 ANAP 标记蛋白的 tRNA/tRNA 合成酶配对系统
peRF1-E55DChin 实验室 (英国剑桥 MRC 分子生物学实验室)Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728编码显性负性真核核糖体释放因子
TransIT-LT1Mirus BioMIR 2300脂质-多聚复合物转染试剂
厚壁硼硅酸盐玻璃毛细管Harvard ApparatusGC150F-15
四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺Sigma-Aldrich94506
TNP-ATPJena BioscienceNU-221L以水配制为 10 mM 溶液使用
Nikon Eclipse TE2000-U 倒置显微镜Nikon
60 倍水浸物镜 (1.4 NA)NikonMRD07602
四波长高功率 LED 光源头ThorLabsLED4D245含 385/490/565/625 nm LED
四通道 LED 驱动器ThorLabsDC4100
390/18 nm 带通激发滤光片ThorLabsMF390-18用于 ANAP 激发
400 nm 长通发射滤光片ThorLabsFEL0400用于成像 ANAP 光谱
416 nm 边缘二向色镜ThorLabsMD416用于成像 ANAP 光谱
460/60 nm 带通发射滤光片ThorLabsMF460-60建议用于 ANAP 荧光成像的宽带通滤光片（图 4B）
470/10 nm 带通发射滤光片ThorLabsFB470-10建议用于 ANAP 荧光成像的窄带通滤光片（图 4B）
531/40 nm 带通激发滤光片BrightlineFF01-531/40-25用于橙色荧光蛋白 (OFP) 激发
540/25 nm 带通激发滤光片ChromaD540/25X用于四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺 (TMRM) 激发
562 nm 边缘二向色镜SemrockFF562-Di03用于 OFP 荧光成像
565 nm 边缘二向色镜Chroma565DC用于 TMRM 荧光成像
593/40 nm 带通激发滤光片BrightlineFF01-387/11-25用于 OFP 荧光成像
605/55 nm 带通发射滤光片ChromaD605/55M用于 TMRM 荧光成像
IsoPlane-160 成像光谱仪Princeton InstrumentsIsoPlane-160
PIXIS 400BR_eXcelon 相机Princeton InstrumentsPIXIS: 400BR_eXcelon
Axopatch 200B 放大器Molecular DevicesAxopatch 200B-2
Digidata 1440A 数模转换器Molecular DevicesDigidata 1440A
探头式超声仪Sonics & MaterialsVC-50用于细胞去顶
REGLO 数字蠕动泵IsmatecISM 832用于浴式灌流
微体积灌流系统ALA Scientific InstrumentsALA μFlow-8用于 TNP-ATP 灌流
pClamp 10.6.2Molecular Devices用于记录和分析电流
Lightfield 5.20.1507Princeton Instruments图像和光谱采集软件
MatlabMathworks用于数据分析
Python 3.8.1Python Software Foundation用于数据分析

参考文献

  1. Garcia, M. L., Kaczorowski, G. J. Ion channels find a pathway for therapeutic success. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5472-5474 (2016).
  2. Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
  3. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
  4. Higgins, C. F., Linton, K. J. The ATP switch model for ABC transporters. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (10), 918-926 (2004).
  5. Toyoshima, C., Cornelius, F. New crystal structures of PII-type ATPases: excitement continues. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 507-514 (2013).
  6. Craven, K. B., Zagotta, W. N. CNG and HCN channels: two peas, one pod. Annual Review of Physiology. 68, 375-401 (2006).
  7. Csanady, L., Vergani, P., Gadsby, D. C. Strict coupling between CFTR's catalytic cycle and gating of its Cl- ion pore revealed by distributions of open channel burst durations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (3), 1241-1246 (2010).
  8. Vedovato, N., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. The Nucleotide-Binding Sites of SUR1: A Mechanistic Model. Biophysical Journal. 109 (12), 2452-2460 (2015).
  9. Burnstock, G. Introduction to the Special Issue on Purinergic Receptors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1051, 1-6 (2017).
  10. Puljung, M., Vedovato, N., Usher, S., Ashcroft, F. Activation mechanism of ATP-sensitive K(+) channels explored with real-time nucleotide binding. Elife. 8, 41103(2019).
  11. Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. Nucleotide inhibition of the pancreatic ATP-sensitive K+ channel explored with patch-clamp fluorometry. Elife. 9, 52775(2020).
  12. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  13. Gordon, S. E., Senning, E. N., Aman, T. K., Zagotta, W. N. Transition metal ion FRET to measure short-range distances at the intracellular surface of the plasma membrane. Journal of General Physiology. 147 (2), 189-200 (2016).
  14. Heuser, J. The production of 'cell cortices' for light and electron microscopy. Traffic. 1 (7), 545-552 (2000).
  15. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  16. Lin, C. Y., et al. Enhancing Protein Expression in HEK-293 Cells by Lowering Culture Temperature. PloS One. 10 (4), 0123562(2015).
  17. Usukura, J., et al. Use of the unroofing technique for atomic force microscopic imaging of the intra-cellular cytoskeleton under aqueous conditions. Journal of Electron Microscopy. 61 (5), 321-326 (2012).
  18. Colquhoun, D. Binding, gating, affinity and efficacy: the interpretation of structure-activity relationships for agonists and of the effects of mutating receptors. British Journal of Pharmacology. 125 (5), 924-947 (1998).
  19. Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
  20. Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
  21. Zheng, J., Zagotta, W. N. Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels. Science's STKE. 2003 (176), 7(2003).
  22. Biskup, C., et al. Relating ligand binding to activation gating in CNGA2 channels. Nature. 446 (7134), 440-443 (2007).
  23. Kusch, J., et al. Interdependence of receptor activation and ligand binding in HCN2 pacemaker channels. Neuron. 67 (1), 75-85 (2010).
  24. Wu, S., et al. State-dependent cAMP binding to functioning HCN channels studied by patch-clamp fluorometry. Biophysical Journal. 100 (5), 1226-1232 (2011).
  25. Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
  26. Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8272-8277 (2013).
  27. Kalstrup, T., Blunck, R. S4-S5 linker movement during activation and inactivation in voltage-gated K(+) channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), 6751-6759 (2018).
  28. Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 686-694 (2019).
  29. Liu, C., et al. Patch-clamp fluorometry-based channel counting to determine HCN channel conductance. Journal of General Physiology. 148 (1), 65-76 (2016).
  30. Hwang, T. C., et al. Structural mechanisms of CFTR function and dysfunction. Journal of General Physiology. 150 (4), 539-570 (2018).
  31. Puljung, M. C. Cryo-electron microscopy structures and progress toward a dynamic understanding of KATP channels. Journal of General Physiology. 150 (5), 653-669 (2018).
  32. Kasuya, G., et al. Structural insights into the competitive inhibition of the ATP-gated P2X receptor channel. Nature Communications. 8 (1), 876(2017).
  33. Virginio, C., Robertson, G., Surprenant, A., North, R. A. Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors. Molecular Pharmacology. 53 (6), 969-973 (1998).
  34. Bhargava, Y., Nicke, A., Rettinger, J. Validation of Alexa-647-ATP as a powerful tool to study P2X receptor ligand binding and desensitization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 438 (2), 295-300 (2013).

重印与许可

标签

FRET分析ANAP标记TNP ATP去顶膜片膜片钳荧光法KATP通道光谱成像实时结合
实时测量完整功能性膜蛋白的核苷酸结合
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。