基于细胞基和细胞外矩阵的Murine睾丸器官生成

Summary

在这里，介绍了从原发性新生儿穆林睾丸细胞生成睾丸器官的四种方法，即细胞外基质 （ECM） 和无 ECM 的 2D 和 3D 培养环境。这些技术具有多种研究应用，特别适用于研究睾丸发育和体外生理学。

Abstract

睾丸器官为研究体外睾丸发育、精子生成和内分泌学提供了工具。为了制造睾丸器官，已经开发出几种方法。许多这些方法依靠细胞外基质（ECM）来促进新组织组装，然而，在仿生形态和组织功能方面，方法之间存在差异。此外，对已发布的方法几乎没有直接的比较。在这里，通过研究器官生成协议的差异，提供结果，进行直接比较。介绍了四种原型生成方法:（1） 2D 无 ECM、（2） 2D ECM、（3） 3D ECM 无和 （4） 3D ECM 培养。三个主要基准用于评估睾丸器官生成。这些是细胞自组装，包括主要细胞类型（Sertoli，Leydig，细菌和围膜细胞），以及适当的分立组织结构。在测试的四个环境中，2D ECM 和 3D ECM 培养物生成具有与原生睾丸最相似的内部形态的有机体，包括管状细胞与间质细胞类型的去新隔离、类似管状结构的发展以及已建立的长期内分泌功能。研究的所有方法都利用了未排序的原发性睾丸细胞悬浮液，并使用了常用的培养资源。这些睾丸器官生成技术为睾丸器官生成和体外生理学的研究举措提供了高度可访问和可重复的工具包。

Introduction

睾丸器官是研究睾丸发育、精子生成和体^,外^{1、2、3、4,2的生理学}的^{开创性技术}。已探索了几种方法，用于组织生成;其中包括各种细胞外基质 （ECM） 和无 ECM 培养系统，包括二维 （2D） 和三维 （3D） 方向。不同的生成方法可以促进不同的细胞组装策略;这导致已发表的器官模型之间的形态和功能变异程度很高。本文的目的是讨论体外睾丸模型的当前状态，并在设计睾丸器官实验时作为未来研究者的模型。本研究确定了四种不同的培养系统原型，并在实验过程和生物结果中进行了描述和描述。这些包括:2D ECM 无 ECM、2D ECM、3D ECM 无和 3D ECM 培养方法。本文介绍的策略旨在在不同的实验室和研究组之间简单、易于访问和高度可重复。

从历史上看，睾丸的指定"体外"，已被用于睾丸组织和细胞的几种不同的培养方法。这些包括有机组织/器官培养方法（即外植培养^）5、分离的半纤维培养^6、睾丸细胞培养^7，以及新组织形态生成方法（即生物构造和器官）^1。第一次对体外精子发生的调查是在大约100年前进行的，1920^年8月，兔子睾丸的培养，后来于1937年与小鼠外植^9。在这些最初的实验中，观察到精子在培养的第一周大体退化，尽管发现了一些具有美色区分的细胞。回想这些历史报告，睾丸外培养在2011年恢复和优化，成为一个可行的技术，研究睾^丸10。自2011年以来，在11、12、13的^多个报告中^{，植外培养已经产生了生育能力强的精子}。然而，由于植物外培养对预先存在的原生睾丸的依赖，这些最近的进步被更准确地描述为"外活"睾丸功能和精子生成的例子，组织功能从生物体的身体中去除后保持或恢复。尽管它在文献中流行，但长期的生殖细胞维持和睾丸外植分化是具有挑战性的^复制14，15，16，17，18，特别是在足够长的时间充分观察体外精子发生（+35^,15,16,17,18天在小鼠¹⁹和74在^{人类20）。}有趣的是，许多相同的挑战经历了100年前，仍然经历在外体精子发生今天。

与外体方法不同，睾丸器官是完全从细胞源（即原发性睾丸细胞）在体外产生的。睾丸器官提供了一个创造性的策略，以规避该领域对预先存在的原生组织的历史依赖，并完全在体外重述睾丸生物学。大多数器官组织模型有多种共同要求;其中包括（1）体内膜状组织形态或结构，（2）代表组织的多种主要细胞类型，（3）自组装或自组织在它们的生成，和（4）模拟一定水平的表示组织的功能和生理^的能力21，22，23，24。^,22,23,24对于睾丸，这可以在四个主要特征中捕获:（1） 包含主要睾丸细胞类型， 细菌、Sertoli、Leydig、围膜和其他间膜细胞，（2）细胞定向组织组装，（3）适当分离细胞类型，分为单独的管状隔间（细菌和Sertoli）和间膜区域（所有其他细胞类型），以及（4）某种程度的组织功能（如生殖激素分泌或组织反应，以及生殖细胞维持和分化）。考虑到在维持生殖细胞分化外体和体外方面的历史挑战，在体内-哑膜睾丸结构（即类似半膜状管状结构）的回顾，以及暗示睾丸生理学模拟（例如内分泌功能）的其他标记，是生成有朝一日可能维持体外精子生成器官的优先里程碑。

大多数已发表的睾酮类药物都利用了市售的 ECM（例如胶原蛋白或专有 ECM 配方^{）25、26、27,26,27}或定制来源的 ECM（即去细胞化睾丸 ECM 衍生水凝胶）28、29、30。^28,29,30外源 ECM 通过提供用于组织生成组装支持的支架来促进非新组织的形成。ECM方法提供了令人印象深刻的组织形成水平，包括一些生殖细胞的存在和组织-模仿形态^{25，28。25,}但是，它们利用的 ECM 并不总是通用的（即去细胞化 ECM 衍生水凝胶），并且某些方法需要复杂的凝胶和细胞播种方向（例如，ECM 的 3 层梯度和 3D 打印^{）25、31,31、32}。^,无脚手架方法（如吊滴和非坚固培养板）33、34、35也产生了坚固且高度可重复的有机体，无需ECM凝胶或脚手架。^33,34,35然而，这些无支架器官的组织形态往往与体内睾丸不同，这些报告中大多数都含有生化ECM添加剂，以促进组织^{形成33、34、36，,34,36}或者依靠离心进行强制细胞聚集和压^实34，使得它们不太适合研究细胞定向迁移和自组织。

本手稿中介绍的四种器官生成方法包括 ECM 依赖和独立策略，每种策略都使用简单的细胞播种，从而能够观察细胞驱动的器官自组装。所有四种技术都可以从相同的细胞悬浮液中执行，也可以利用自定义和细胞类型的富集种群。这些方法的强项是能够实时观察器官自组装，并直接比较睾丸结构在不同文化微环境之间如何自我组装。这四种文化方法之间的表型差异，对于研究者的研究问题或课题的影响，应考虑它们。每种方法在24小时或更小范围内产生生物构造或器官。总之，本文介绍的方法为研究睾丸器官组装、组织发育和体外睾丸生理学提供了器官组装技术工具包。

Protocol

所有小鼠实验都得到西北大学动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，所有程序都根据国际动物保护委员会批准的议定书进行。

1. 酶组织分离解决方案的制备

1. 使用两种不同的酶解决方案（解决方案 1 和解决方案 2），这两种解决方案都是使用基底培养基介质解决方案 （BM） 制造的。
2. 要准备BM，将血清和青霉素-链霉素添加到最低基本介质到最终浓度的10%和1%（ 参见特定试剂 材料表）。然后通过 0.22 μm 过滤器对 BM 进行无菌过滤。与细胞一起使用之前，通过配入培养皿并将5%CO₂ 培养箱置于37°C下，至少1小时，将无菌BM预平衡至中性pH。
   注:BM 可储存在 4 °C 长达 1 周，之后应制作新鲜 BM。
3. 要制备胶原酶 I 库存溶液，首先将 100 毫克胶原酶 I 溶解成 1 mL 的无菌胚胎 H₂O（最终浓度 10% m/v），反转或涡流溶解，并在 -20 °C 下储存 20 μL 等分，供以后使用。阿里语只能解冻一次。
4. 为了制备脱氧核糖核酸酶一（DNase I）库存溶液，将20毫克DNase I加入1 mL的无菌胚胎H₂O（最终浓度2%m/v），反转或涡流溶解（不要涡流），并在-20°C下储存20μL等分，供以后使用。阿里语只能解冻一次。
5. 对于 hyaluronidase 库存溶液，将 30 mg 加入 1 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS;最终浓度 3% m/v hyaluronidase 在含有 Ca⁺/Mg^{+） 的}PBS 中，反转或涡流溶解，并在 -20°C 下储存 100 μL 等物，供以后使用。可多次解冻和重新冷冻，而不会损失酶活性。
6. 为了制备分离溶液 1，加入10μL胶原酶 I 和 10 μL DNase I 到 1 mL 的无菌，预平衡 BM（最终浓度:1 mg/mL 胶原酶 I 和 5 μg/mL DNase I）。用移液器轻轻搅拌，混合溶液，预热至37°C，然后与组织一起使用。
   注:溶液2是通过将溶液1的1 mL添加33μL的海卢罗尼达酶（预后至37°C）（最终浓度为1mg/mL）制备的。这发生在中途通过酶分离睾丸组织在步骤2.5下。

2. 睾丸组织分离

注:所有小鼠都存放在聚丙烯笼子里，并配有食物和水。动物被喂去辐照的周，其中不含植物雌激素。少年CD-1小鼠，产后5天（dpp），用于安乐死和组织收集之前的所有实验和麻醉，在麻醉室内连接到异氟烷蒸发器（2.5 L/min在_{O 2）。}小鼠因对头趾刺没有反应而被确认为全身麻醉，之后小鼠通过斩首被安乐死。

1. 麻醉小鼠在异氟体室，确保麻醉通过一个头角，然后用锋利的剪刀斩首小鼠。将安乐死小鼠在解剖垫上，用70%乙醇对腹部进行消毒。用钳子将下腹部的皮肤帐篷，用剪刀打开腹部。
2. 在腹部的左下、右下部区域找到睾丸。切断它们与血管和任何锚定结缔组织的连接，然后从动物中抬起整个睾丸（仍然附着表皮）。将睾丸放在预平衡 BM 的培养皿中。
3. 在解剖显微镜下和在无菌场内，用一个小的微解剪刀或使用两个细钳轻轻撕裂，在每个睾丸的一端的图尼卡阿尔布吉纳做一个小切口。
   1. 然后，当从切口的另一端握住睾丸时，用细钳轻轻挤压睾丸，然后轻轻的扫地运动向图尼卡的孔推进;这将释放睾丸组织作为一个内聚的一块。
4. 将睾丸切成更小的≤（2 mm^3），并放入1 mL预热（37°C）分离溶液1。
   1. 在37°C下孵育10分钟。
   2. 对于超过 10 个睾丸，将总分离溶液体积增加 1 mL，确保每 10 个睾丸至少 1 mL 分离溶液（例如，20 个睾丸 2 mL，30 个睾丸 3 mL 等）。
   3. 使用 P1000 移液器在溶液 1 中轻轻三角 50 倍（50 倍）的睾丸。确保此时的管状分开，从间状组织分离。如果团块仍然存在，再孵育5分钟，再三酸酯（50倍）。
5. 每1 mL溶液1分离混合物（含有部分分离的睾丸组织和管子）加入33μL的海卢罗尼达塞库存溶液（在37°C下预热，从步骤1.5开始）。添加 hyaluronidase 后，这称为解决方案 2。
   1. 使用 P1000 进行三酸酯 （50 倍），在 37 °C 下孵育 5 分钟。
   2. 使用 P200 移液器进行三酸酯 （50 倍）。
   3. 确保此时不存在可见的团或细胞团。如果团块持续，孵育时间长达5分钟，使用P200移液器（50倍）进一步三分。
6. 通过将胎儿牛血清（FBS）添加到溶液总体积的10%2，将分离酶淬火。使用 P200 移液器多次三次三酸化，以确保没有团块，并通过 40 μm 细胞滤株过滤以产生单细胞悬浮液。
7. 在100 x g下离心 细胞7分钟，丢弃上一代，并在新鲜BM中重新产生细胞。
8. 使用血细胞计上的 trypan 蓝色排除数值总和可行的细胞浓度。加入10μL的1:1稀释，细胞悬浮液:尝试蓝色溶液，放入血细胞计细胞计数室（ 见材料表）。
   1. 以 100 x g 重新离心机 7 分钟，并在新鲜 BM 中重新发送。
      注:仅使用可行细胞计算细胞浓度和数量。仅使用细胞悬浮液≥ 80% 的生存能力生成有机体。
   2. 将单细胞悬浮液准备到所述细胞浓度中，以便根据以下第 3 节中协议特定步骤中使用的体积等分 280，000 个细胞:2D ECM-无 - 0.56 x 10^{6 6} 细胞/mL， 2D ECM = 0.56 x 10^{6 6} 细胞/mL，3D ECM-无 - 4.66 x 10^{6 6} 细胞/mL，3D ECM = 2.8 x 10⁶ 细胞/mL。
      注:这里介绍的所有培养实验都从每个培养的280，000个细胞开始。这些数字与图1、图 2、图 3和图 4 中的代表性数据相匹配。

3. 组织培养皿的准备和细胞的播种

注:为确保 ECM 均匀，在试验前一夜预解冻 ECM 的冻结等等。ECM 等分应浸入 4°C 冰箱或冷藏室内的一桶冰中，以保证温度缓慢、逐渐升高。所有 ECM 在 BM 中的 1:1 最终稀释时用于培养。将解冻的 ECM 和 1:1 稀释的 ECM 留在冰上，直到使用前，否则 ECM 可能会过早聚合。

1. 对于无 2D ECM 培养，无需特殊制备，将板单单元悬浮液（500 μL 的 0.56 x 10^{6 6} 细胞/mL 在 BM 中）直接放到 4 井腔腔间滑梯上，并放入 35°C 培养箱进行培养。
   注意:细胞应在培养的24小时内粘附在培养皿的底部，并可能同时表现出一些小型的3D细胞簇。
2. 对于 2D ECM 培养，将 100 μL 的冷 1:1 稀释的细胞外基底基质介质分配到 4 井室滑盘中，确保凝胶覆盖整个菜底。
   1. 将腔室滑轨放入 35°C 培养箱中至少 30 分钟，使 ECM 能够聚合到凝胶中。
   2. 聚合后，将细胞悬浮液（500 μL的0.56 x^{10 6 6} 6细胞/mL在BM中）直接添加到2D凝胶的顶部。
      注意:细胞应聚集在一起，在培养的 24 小时内形成小型 3D 群集。
3. 对于 3D ECM 培养，在开始细胞培养之前，请准备 agarose 3D 培养皿插入件。
   1. 首先，在100 mL烧杯中下1.5克阿加糖粉，然后加入75 mL无菌、蒸馏水和微波，为3D Petri盘铸造产生熔融的2%阿加糖。
   2. 在无菌工作空间内，将熔融的糖分入 3D Petri 盘模中，直到半月板与模具的两侧平。
   3. 让加糖冷却和凝固。当固体时，将模具倒置，轻轻弯曲，直到阿加罗斯 3D Petri 盘从模具中脱落。
      注意:在这一点上，你可以准备许多阿加罗斯3D培养皿，并把它们储存在无菌的H₂O或DPBS在4°C超过一个月。
   4. 在栽培之前，将阿加罗斯3D培养皿放入24个井文化菜肴中，用1 mL的BM覆盖它们。让 3D 培养皿在 BM 中平衡至少 30 分钟，在 37 °C 培养箱内。丢弃 BM，再用 1 mL 新鲜 BM 重复平衡。在 BM 中平衡 3D 培养皿后，它们将显示与 BM 相同的颜色（即粉红色）。
   5. 为了准备细胞播种，从井中去除所有BM，并分配200μL的新鲜BM周围，但不是在3D培养皿的中心凹槽内。此外，从微井插入的中心细胞种子凹槽内收集任何剩余的BM。
   6. 将单细胞悬浮液（4.66细胞/mL，60μL的BM）分配到阿加罗斯3D培养皿的中心凹槽中。轻轻上下三角混合细胞，保证培养开始时的单个细胞悬浮液。
   7. 放入加湿的 35°C 培养箱中，用于培养。第二天，从微井刀片周围取出 200 μL 的 BM，然后更换为 1 mL 的新鲜 BM。这将把液位高于插入物的平面，淹没整个区域性。
   8. 慢慢地小心地从阿加罗斯 3D 培养皿外取出/添加介质。器官应该在一夜之间压实，允许它们在底部休息，使介质变化使器官不受干扰。
4. 对于 3D ECM 培养，通过将 BM 中的电池悬浮液与冷、预解冻 ECM（最终浓度 = 2.8 x 10^{6 6 电池} /mL）在相同部分中组合，准备单个单元悬浮液。
   1. 立即将电池-ECM 混合物分配到 4 井室滑轨中，确保混合物覆盖整个板底。
   2. 将腔室在 35°C 下滑入培养箱中，让其内装物聚合。这至少需要 30 分钟。聚合后，在培养基顶部加入500μL的BM。
      注意:细胞应该聚集在一起，在培养的 24 小时内形成小型的 3D 聚合。

4. 有机体维护

1. 培养所有有机体模型类型在35°C。 对于所有文化类型，每 2 天使用一次新鲜 BM 交换一半的媒体。为确保在交换介质时不会意外收集有机体，请始终从室内幻灯片盘的一角，以及从 agarose 3D Petri 盘外的外部点缓慢收集介质。所有介质都可以储存在-20°C，用于免疫分析或其他分析以后（即分泌生殖激素或细胞因子的定量）。
2. 在培养7天后，使用BM含有卵泡刺激激素（最终浓度20 mIU/mL）和人类胆碱性腺激素（最终浓度4.5 IU/mL）。这适用于所有器官培养类型。
3. 定期成像所有器官培养物（即延时成像），以描述器官形成特征，并量化自组装、发育和一段时间增长的指标。

5. 有机体收集

注:所有器官都可以在PBS中用4%的半形式醛固定，用于下游免疫标记和组织学分析。在室温下旋转2小时，或在4°C下过夜。

1. 对于无 2D ECM 培养物，首先使用新鲜的 PBS 冲洗样品，然后直接在粘附结构上添加固定剂。
2. 对于 ECM（2D 和 3D）培养方法，使用 PBS 冲洗一次，然后直接在 ECM-器官样品的顶部添加固定剂（将 ECM 凝胶和有机体固定在一起），或者轻轻地上下移液管，将其从周围的 ECM 中释放出来，然后转移到单独的管上进行固定。
3. 对于无 3D ECM 培养，在 agarose 3D 培养皿的中心凹槽内轻轻移液管风琴;这将冲洗出器官， 方便他们很容易收集与移液器。然后将器官转移到单独的管子中进行固定。
4. 在加工成石蜡之前，将许多有机物（≥20）嵌入组织加工凝胶的小体积（±30μL）中;这有助于将器官定向和浓缩到石蜡块内的一小块区域中，便于在石蜡块内进行剖切和更容易的视觉识别。
   注:在石蜡嵌入和切块在微原子上之后，器官可能具有挑战性。

Results

如果睾丸细胞在培养的72小时内没有自组装，则有机细胞生成被认为是不成功的，然而，在使用幼细胞（5 dpp）时，这里提供的所有方法在24小时内组装。生物构造生成的失败呈现为自由悬浮细胞的延续（图1中的0 h列）， 即使在扩展培养（72小时）之后。在没有组织自组装的情况下，任何明显的细胞簇在轻轻操作（即移液）后也很容易分散到单个细胞中。成功生成的组织最初被观测为3D细胞"集群"（图1的6小时列中的 黄色箭头）。在无 ECM 环境（2D 和 3D）中，这些构造在培养的 24 小时环境中明显"紧凑"，尤其是在 3D 阿加罗斯培养皿中（图1A，C） 。在 ECM 环境中（2D 和 3D）单元群集在群集与其周围环境之间具有清晰的边距（图 1B，D）。还观察到细胞簇在 ECM 之间迁移并熔合在一起形成更大的聚类（图

Discussion

随着此器官生成协议的完成，用户将有四种不同的培养技术可供他们组装睾丸构造和无 ECM 环境中的器官。重要的是，这四种方法都允许研究人员通过延时成像或录像，在一段时间内对器官自我组装进行非侵入性观察，并且能够无创地收集条件介质来分析分泌的激素和细胞因子，而不会在培养过程中干扰组织。在所有方法中，在24小时过程中，实验者可以生成多达数百个器官/睾丸构造，如细胞数允许。这些方法促进组织自组装成具有不同大小和形态的构造;器官大小取决于培养物中使用的细胞数量和浓度，如其他器官报告^34中所见。减少器官大小或直径可能有助于减少坏死的内部区域的发展，而坏死有时呈现在较大的器官中。2D ECM 和 3D ECM 无协议方法的一个特别强度是它们能够生成形态性模仿睾丸器官，包含管状细胞与间质细胞类型的去新分型。此外，3D ECM 无组装的器官为半纤维TLS的去新管生成提供了模型，具有适当分型和定向的Sertoli和围膜细胞。这是研究睾丸器官的重要表型，在不同睾丸器官报告中仍然是一个可变的结果;多个其他报告缺乏浴缸与间型分块，有的甚至发展出"从内到外的浴缸"表型32，33，34，38。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 um 介质无菌过滤器	Millipore Sigma	scgpu05re	用于无菌过滤介质
3βHSD 一抗	Cosmo Bio Co	K0607	睾丸间质细胞标志物，1：500 稀释
AlexaFluor 568 α-小鼠	Thermo Fisher Scientific	A-21202	荧光标记二抗
AlexaFluor 568 α-兔	Thermo Fisher Scientific	A10042	荧光标记二抗
Alpha 最低必需培养基	Thermo Fisher Scientific	11-095-080	培养基基础
胶原酶 I	Worthington 生物	LS004197	用于解离溶液 1
康宁基质胶膜基质，不含 LDEV	的康宁	354234	用于灌注 2D 和 3D ECM 培养凝胶的细胞外基质
Countess 细胞计数仪	Thermo Fisher Scientific	C10227	自动细胞计数仪（血细胞计数器机）
Countess 细胞计数室载玻片	Thermo Fisher Scientific	C10228	血细胞计数器载玻片，用于 Countess 自动计数
DDX4 一抗	Abcam	138540	精原细胞标记物，1：500 稀释度
脱氧核糖核酸酶 I （2,280 u/mgDW）	Worthington Bio	LS002140	用于解离溶液 1
DPBS 1X，+ CaCl + MgCl	Thermo Fisher Scientific	14040182	用于重构透明质酸酶
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 +Ca/+Mg	Thermo Fisher Scientific	14040117	PBS
胚胎级 H2O	MIllipore Sigma	W1503	用于重构胶原酶 I 和 Dnase I
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	16000044	用于淬灭酶解离溶液
卵泡刺激激素	Abcam	ab51888	用于长期类器官培养
人绒毛膜促性腺激素	Millipore Sigma	C1063	用于长期类器官培养
透明质酸酶，来自牛睾丸	Millipore Sigma	H4272	用于解离溶液 2
抑制素 B 酶联免疫吸附测定	Ansh Labs	AL-107	抑制素 B ELISA 试剂盒
KnockOut 血清替代物	Thermo Fisher Scientific	10828-028	用于基础培养基的血清来源
微组织 3D 培养皿 微塑球（24-35,5x7 阵列）	Millipore Sigma	Z764051	用于 3D 无 ECM 制造
Nunc、Lab Tek II 腔室载玻片系统、4 孔	Thermo Fisher Scientific	12-565-7	用于无 2D ECM 和 2D、3D ECM 培养
青霉素/链霉素	Thermo Fisher Scientific	15-140-122	培养基用抗生素
Richard-Allan Scientific;组织凝胶，标本处理凝胶	Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012	用于辅助石蜡包埋
SOX9 一抗	Millipore Sigma	AB5535	支持式标记物，1：500 稀释
Tedklad Global 小鼠食物（种鸡）	Teklad Global	2920	不含植物雌激素的小鼠食物
Tedklad Global 小鼠食物（维护）	Teklad Global	2916	不含植物雌激素的小鼠食物
睾酮酶联免疫吸附测定	Calbiotech	TE373S	睾酮 ELISA 试剂盒
台盼蓝溶液，0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	用于细胞计数
&α;SMA 一抗	Millipore Sigma	A2547	肾小管周围标志物，1：500 稀释
&β;连环蛋白一抗	BD Biosciences 610154		支持细胞质标志物，1：100