方法文章

改进的高通量DNA提取板加样方法可降低污染风险

DOI：

10.3791/61405

⸱

2020年6月3日

 , 
1Department of Ecosystem Science and Management, University of Wyoming, 2Program in Ecology, University of Wyoming, 3EPSCoR-IDEA, University of Wyoming, 4Department of Botany, University of Wyoming

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

目前用于DNA提取的96孔板加样方法容易受到污染。我们详细介绍了一种新的96孔板加样方法，可降低孔间交叉污染的风险。该方法将有助于其他研究人员充分利用高通量DNA提取技术的高效性，并最大限度地降低污染风险。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

高通量DNA测序技术极大地推动了我们对微生物群落、宿主特征以及更广泛生态系统功能之间关系的理解。随着测序能力在广度和深度上的迅速提升，一系列方法得以发展，以最高效率成功提取、扩增、分析和解读环境DNA。然而，快速进行DNA提取的同时，也可能增加样本间污染的风险。特别是基于96孔板中样本的高通量提取方法，虽然相较于单管提取更为快速，但也增加了孔间交叉污染的可能性。为了在保留高通量提取技术优势的同时，最大限度地降低样本间的交叉污染风险，我们开发了一种新的将环境样本装入96孔板的方法。在加样过程中，我们使用可穿刺的PCR密封膜覆盖每个孔板，并先将样本加入PCR管中，再转移至各孔位；这两种操作结合使用，可有效降低样本漂移和意外重复加样的风险。本文所述方法为研究人员提供了一种在充分利用现有高通量提取技术的同时，降低96孔板固有交叉污染风险的可行方案。我们提供了从样本采集到DNA提取的详细逐步操作流程，以最大程度减少非预期交叉污染的发生。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微生物群落高通量测序技术的最新进展提供了前所未有的测序深度，从而以前所未有的视角揭示了地球微生物组的功能与多样性1。随着在单个测序通道中多重化越来越多样本的能力不断增强，单管DNA提取可能成为生态数据生成过程中的限速步骤。然而，新兴的高通量DNA提取方法有望以比以往更高的效率处理大量环境样本2。这些方法通常采用96孔板替代单管，从而显著提高可同时进行的提取反应数量。因此，高通量提取方法的实用性与效率显而易见，已被广泛应用于处理多种环境样本，包括土壤3,4、植物组织3,5以及人类粪便2。

尽管这些方法可以显著加快样品处理和DNA提取的速度，但在将土壤及其他生态样品装入96孔板的初始步骤中，容易发生样品间的交叉污染。这种孔间污染可能在DNA提取过程中出现6,7,8，而在样品尚未悬浮于缓冲液中的第一步，各孔尤其容易受到污染。McPherson等9提出了一种使用漏斗和8联PCR管盖将根际土壤装入96孔板的方法，虽然该方法在加样过程中更为可控，但在逐个加样时仍存在邻近孔被污染的较大风险。此外，开放式的孔板也增加了研究人员因分心而将样品加入错误孔位，或将样品加入已加载孔中的可能性。同时，多种类型的样品并不适合采用该方法进行加样；湿样品常会黏附在漏斗上，而干样品则由于静电作用在孔之间“跳跃”。

为了在高通量DNA提取的第一步中减少不同孔之间发生污染的机会，我们开发了一种将土壤样品加载到96孔板中的新方法。我们的方法既能保护各孔免受环境暴露，又能防止意外将多个样品加入同一孔中（即重复加样）。我们认为，下文所述的方法有望降低污染风险，从而为后续DNA提取提供一种更为可控的96孔板加样方式。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 加载96孔板前的实验台和工具准备

  1. 用70%乙醇喷雾清洁实验台面，擦拭后静置晾干，再喷洒10%次氯酸钠溶液，随后将台面擦干。
  2. 将微型刮勺、药匙和弯头手术剪浸入95%乙醇中进行消毒，然后过火灼烧；再将其浸入10%次氯酸钠溶液中，取出后静置晾干，方可使用。
    注意：每处理一个样品之间均应重新对工具进行消毒。

2. 子采样与样品制备

  1. 使用乙醇对手套进行消毒后再进行取样。
  2. 在取亚样品前，需将土壤样品充分均质化。
  3. 使用无菌工具，将样本装入已标记的2 mL离心管中，直至大约 半满
  4. 重复步骤 2.2，直至所有 95 个样品均被分装至已标记的 2 mL 离心管中。第 96 个th 应使用空白孔作为提取空白对照。
    注意：步骤 2.3 和 2.4 旨在最小化所需的存储空间，并防止过度采样或重复采样。
  5. 将2 mL子样品管置于冰上保存，直至上板。
  6. 标记96个无菌的200 µL平盖PCR管，编号为A1‒A12、B1‒B12、…. H1‒H12。将这些PCR管按顺序放入一个96孔板架中。
  7. 分配一个带有孔位（A1‒H12）的样本编号并记录。

3. 培养板制备

  1. 从96孔板上取下橡胶盖（图1A–1C），将其放入无菌塑料袋中（见材料表）。密封塑料袋以防止污染。
  2. 用封板膜覆盖96孔板（图1D–1E）；例如，使用预切割可穿刺封板膜（见材料表）。用橡胶滚轮滚压以确保密封。
    注意：穿刺型硅胶垫在适当清洁的前提下可能具备重复使用性，但我们测试的硅胶垫容易沿穿刺处开裂，无法为后续的板子提供同等保护。
  3. 将板放入冰箱（4 °C）中保持低温。

4. 转移亚样品

注意：当土样量非常少时，参见步骤 4.13 中的修改方法。

  1. 将24个2 mL的子样品放入冰块中进行冷藏。
  2. 根据样本名称和孔位位置表，选择正确的200 µL平盖PCR管。
  3. 取一支2 mL的分样管，涡旋混匀约5秒，以确保样品均匀。
  4. 使用火焰和漂白剂灭菌的工具，将约 200 µL 的第一个样本加入相应的平盖 PCR 管中（图1F).
  5. 重复步骤 4.2–4.4，直至所有 24 个样本均已完成上样，然后进入步骤 4.6。
  6. 使用蘸有漂白剂的纸巾擦拭200 µL平盖PCR管的外表面。
  7. 将离心管倒置，轻敲实验台使样品移至管顶部。使用漂白并火焰灭菌的剪刀，剪去PCR管底部，以形成开口，使样品落入96孔板中（图1G).
  8. 在96孔板上找到正确的孔位，将管子沿板面移动，切口端朝上，直至到达目标孔。轻轻倾斜孔板，以利于刺穿预先切割的可穿刺密封膜，只有当管子正对准正确孔位时，再小心地将其倒置，使切口端插入孔中。使用灭菌工具轻敲PCR管顶部，直至所有土壤从管中落入孔内。将管子留在孔中，管盖保持关闭状态（图1H–1J).
  9. 每次取一个平盖的 200 μL PCR 管，向该孔中加入 750 μL 磁珠溶液 (图1K将200 μL平盖PCR管完全推入孔中，并用记号笔在顶部做标记，以表明该孔已加样。每个样本均重复此操作。
  10. 将全部24个样品加载并加入珠溶液后，取下2 mL的子样品管，替换为24个未采样的试管。 
  11. 重复步骤 4.1 至 4.10，直至所有 95 个孔均加入样品或空白以及磁珠溶液。 移除试管时，不得将其从敞口井孔上方经过（图1L).
  12. 小心移除可穿刺薄膜，并重新盖上橡胶盖以保护微孔板，直至开始提取步骤（图1M–1O).
  13. 对于量少且为细粒状的土壤样品，向样本管中加入 750 µL 珠溶液，并使用宽口吸头将全部内容物转移至相应的孔中。将 PCR 管放入开口中，以防止重复加样。
    注意：进行此修改时需谨慎，因为颗粒有机物或大于移液器吸头孔径的小岩石碎片可能会堵塞移液器，导致样品浆液转移困难。
  14. 根据需要，将已加入样本和磁珠溶液的板在 -20 °C 冻存，直至进行后续提取。

5. 平板加样方法的比较

注意：为了验证我们提出的96孔DNA提取板加样新方法，我们将一个96孔板分为三个区域。采用三种不同的加样方法，以比较意外土壤污染和交叉污染的可能性。这三种方法分别为McPherson等人9所述方法、Qiagen公司的默认加样方案10，以及本文所描述的方案。

  1. 将土壤装入孔板
    1. 将一个96孔板分为三个四列区域。使用上述三种方法之一为每个区域装样。
    2. 将土壤装入每隔一个的孔中，使样品孔与空白孔交错排列。这种排列方式可最大程度地暴露潜在的样品误加和交叉污染风险。
    3. 将96孔板在-20 °C下冷冻，直至进行DNA提取。
  2. DNA提取
    1. 根据制造商提供的96孔板提取方案进行DNA提取10。
    2. 将提取的DNA在-20 °C下保存，以备后续分析。
  3. 空白孔中DNA的定量
    1. 在室温下解冻DNA提取物，涡旋混匀后使用板式离心机离心。
    2. 使用分光光度计测定并记录空白孔中的DNA浓度。
    3. 采用ANOVA分析及Tukey事后检验分析空白孔中平均DNA浓度的差异。
      注意：显著性水平设定为 α = 0.05。

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结果

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该新方法已成功用于加载96孔DNA提取板。不同板加载方法的比较结果显示，我们的方法在空白孔中的DNA浓度最低。空白孔中的DNA浓度显著低于McPherson等人提出的方案9（p < 0.05），尽管我们方法的DNA浓度与Qiagen默认方法相比无统计学差异（图2）。三种方法产生的平均DNA浓度均低于2 ng/µL，但只有我们的新方法产生了无可测DNA浓度的孔。

细胞微阵列流程；示意图显示了用于高通量分析的细胞接种、标记和成像。
图1：将样本加载至96孔板以进行DNA提取的逐步操作方法，同时最大限度减少孔间交叉污染的风险。深灰色...

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讨论

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该方法在加载高通量样本提取板时可减少孔与孔之间的交叉污染机会，并提供了一种比现有板加载策略更可控的96孔板加样方式9,10。与单管提取相比，96孔板提取过程中孔间的污染可能更为普遍，尤其是在自动化操作中6,7；尽管在任何方法学中均未进行专门测试，但可以合理推测，当提取板的孔在整块板加样过程中始终保持开放状态时，发生交叉污染的风险最高。鉴于基于板的提取相比单管提取具有更高的交叉污染风险，在将样本加载至96孔板时，使用无菌盖保护各孔应被视为关键的第一步。尽管如此，高通量提取试剂盒所提供的说明仅简单指出应“避免样本孔之间的交叉污染”，但并未提供任何关于如何实现这一点的进一步指导10。为减少向96孔提取板中添加样本时的污染，McPherson 等人9建议使用裁剪成条状的PCR封板膜覆盖整块板，仅在需要接触某一孔时将其局...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突，无可披露内容。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由微生物生态合作项目资助，资金来自美国国家科学基金会（NSF）奖项 #EPS-1655726。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
18 盎司 WhirlPakNascoB01065
2 mL 离心管Fisherbrand05-408-129
200 µL 微量 PCR 管Thermo ScientificAB 2000
96 孔 PowerSoil DNA 提取试剂盒Qiagen12955-4我们使用了土壤 DNA 提取试剂盒，但任何 96 孔板格式的试剂盒均可使用。
适用于 2 mL 离心管的冰盒任意品牌任意型号任何适用于 2 mL 管的冰盒均可使用
适用于 200 µL 微量 PCR 管的冰盒任意品牌任意型号任何适用于 200 µL 管的冰盒均可使用
微型刮勺任意品牌任意型号
预切割穿刺密封膜Excel ScientificXPS25
刮刀任意品牌任意型号
手术剪刀任意品牌任意型号

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).
  2. Davis, A., et al. Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass. BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).
  3. Marotz, C., et al. Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary. BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).
  4. Romdhane, S., et al. Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems. Frontiers in Microbiology. 10, 1618(2019).
  5. Rochefort, A., et al. Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota. Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).
  6. Minich, J. J., et al. Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research. mSystems. 4 (4), 00186(2019).
  7. Walker, A. W. A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses. mSystems. 4 (4), 00362(2019).
  8. Eisenhofer, R., et al. Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations. Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).
  9. McPherson, M. R., et al. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), e57932(2018).
  10. Qiagen, D. N., et al. easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , Hilden, Germany. (2019).

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标签

96 PCR DNA

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