改进的高通量DNA提取板加载方法，降低污染的可能性

Summary

目前装载 96 孔板进行 DNA 提取的方法容易受到污染。我们详细介绍了一种装载96孔板的新方法，该方法可降低井中交叉污染的风险。我们的方法将帮助其他研究人员利用高通量DNA提取技术的效率，并最大限度地降低污染风险。

Abstract

高通量DNA测序技术极大地促进了我们对微生物群落之间的关系、宿主特性和更广泛的生态系统功能的理解。随着测序能力的广度和深度的迅速提高，人们以最高效率成功提取、放大、分析和解释环境DNA的方法。不幸的是，快速进行DNA提取可能会增加样品污染风险。特别是，与单管萃取相比，基于 96 井板中所含样品的高通量萃取提供了相对快速的方法，但也增加了井中交叉污染的机会。为了最大限度地降低样品交叉污染的风险，同时保留高通量萃取技术的好处，我们开发了一种将环境样品装入 96 孔板的新方法。我们使用可穿透的PCR密封膜覆盖每个板，同时加载样品，并首先将样品添加到PCR管，然后再将它们移动到井中;这些做法共同降低了样品漂移和意外双载井的风险。本文概述的方法为研究人员提供了一种方法，以最大限度地提高可用的高通量提取技术，同时降低96孔板固有的交叉污染风险。我们提供了如何从样品收集到DNA提取的详细分步概述，同时最大限度地降低不必要的交叉污染风险。

Introduction

微生物群落高通量测序的最新进展提供了无与伦比的测序深度，因此，对地球微生物群1的功能和多样性有着前所未有的^一瞥。随着将越来越多的样品多能复用到单个测序通道上的能力增加，单管DNA提取有可能成为生成生态数据中速率限制的步骤。然而，高通量DNA提取中的新方法有望以比之前更高的效率处理^{大量环境样品}。这些方法通常涉及使用96孔板而不是单管，从而增加可能同时发生的萃取量。因此，高通量萃取方法的实用性和效率明显，已用于处理^{从土壤3、4,}和植物组织^,3、5到^人类粪便²等环境样品。⁴

虽然这些方法可以显著加快样品处理和DNA提取的速度，但将土壤和其他生态样品装入96孔板的初始步骤容易受到交叉样品污染。这种类型的井井污染可能发生在DNA提取^{6，7，8，,8}和井特别脆弱，在这第一步样品悬浮在缓冲溶液之前。^6,McPherson等人

Protocol

1. 用于装载 96 井板的实验室台和工具准备

1. 用 70% 乙醇雾化工作，清除台面。在用 10% 漂白剂喷洒工作台顶之前，请擦拭并让空气干燥。擦干工作台顶。
2. 通过浸入95%乙醇，然后暴露在火焰中，对微铲、铲子和手术剪刀（弯曲）进行灭菌。将每个浸在 10% 漂白剂中，并在使用前晾干。
   注:每个样品之间应对工具进行灭菌。

2. 子取样和样品制备

1. 在亚采样前使用乙醇消毒手套。
2. 在亚采样之前，将土壤样品完全均质化。
3. 使用灭菌工具，将标有 2 mL 的离心管与样品一起装载，直到大约半满。
4. 重复步骤 2.2，直到所有 95 个样品都已分采样到标签的 2 mL 离心管中。第 96^井 应用作提取空白。
   注:步骤 2.3 和 2.4 用于最小化所需的存储空间，并防止过度采样或双采样。
5. 将 2 mL 亚样品管存放在冰上，直到装入板。
6. 标签 96 无菌 200 μL 平盖 PCR 管 A1\u2012A12， B1\u2012B12，......H1\u2012H12.将这些管子放入 96 井机架中。
7. 分配具有井位置（A1\u2012H12）的样品 ID 并记录它。

3. 板准备

1. 从 96....

Results

这种新方法成功地用于装载96孔DNA提取板。对板载荷方法的比较表明，该方法在空白井中DNA浓度最低。空白井中的DNA浓度明显低于我提出的^McPherson 等人9（p<0.05）的方法，尽管我们方法中的DNA浓度与Qiagen默认方法（图2）没有统计学上的不同。所有三种方法产生的DNA均在2纳克/μL以下，尽管只有我们新方法生产出没有可测量DNA浓度的井。

图1:逐步将样品装入96孔板进行DNA提取的方法，同时最大限度地减少井中交叉污染的可能性。深灰色盖（在步骤 A、B、N 和 O 中显示）表示提取套件附带的硅盖。浅灰色盖（在步骤 D 中应用，在步骤 L 之后拆下）表示用于在装载时盖住板的可穿透 PCR .......

Discussion

这种方法减少了在装载高通量样品提取板时实现井对井交叉污染的机会，并提供了一种更可控的方法，可以装载超过现有板装量^{策略9、10的96,}孔^板。在96孔板提取中，井间污染比单管萃取更普遍，尤其是在^{自动6、7,7}时，尽管没有在任何方法中进行过专门测试，但当提取板的油井在板装过程中保持打开状态时，交叉污染的风险可能最高。与单管萃取相比，在基于板的萃取中，交叉污染的机会增加，使用无菌盖保护油井应被视为将样品装入 96 孔板的关键第一步。尽管有这种需要，高通量萃取套件中提供的说明只是说要装载板并"避免样品井之间的交叉污染"，但没有提供任何额外的信息，说明如何做到这^一点10。为了减少污染，同时将样品添加到96井的提取板^{中，McPherson等人建议用PCR}密封胶带的切割条盖住该板，剥皮，然后进入每口井。此方法减少了所有油井打开.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 盎司 WhirlPak	Nasco	B01065
2 mL 离心管	Fisherbrand	05-408-129
200 µL 微量 PCR 管	Thermo Scientific	AB 2000
96 孔 PowerSoil DNA 提取试剂盒	Qiagen	12955-4	我们使用了土壤提取试剂盒，但任何 96 孔规格的试剂盒都可以使用。
用于 2 mL 离心管的冰块	任何	任何	用于 2 mL 离心管的冰块都可以工作
用于 200 µ 的冰块;L 微量 PCR 管	Any		Any Any 200 µ 制冰块;L 管将工作
Micro scoopula	任何
预切可刺穿密封膜	Excel Scientific	XPS25
刮刀	任何
手术剪刀	任何	任何