本文描述了一种定量研究海马神经元轴突起始段（AIS）组装与结构的实验方案，这些神经元由于缺乏巨型锚蛋白-G而不存在预先组装的AIS。
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本文内容
摘要
摘要
神经元轴突初始段（AIS）是动作电位的起始部位，其分子结构、组装机制以及依赖于神经活动的可塑性已被广泛研究。巨型锚蛋白G（giant ankyrin-G）是AIS的主要组织者，可直接结合跨膜电压门控钠通道（VSVG）和钾通道（KCNQ2/3），以及186 kDa的神经束蛋白（neurofascin），后者属于L1CAM细胞黏附分子家族。巨型锚蛋白G还能结合并招募细胞质内的AIS相关分子，包括β-4-血影蛋白（beta-4-spectrin）以及微管结合蛋白EB1/EB3和Ndel1。在锚蛋白G缺失的神经元中，巨型锚蛋白G足以恢复AIS的形成。锚蛋白G还存在一种较小的190 kDa亚型，定位于树突棘而非AIS，该亚型无法靶向定位至AIS，也不能在锚蛋白G缺失的神经元中恢复AIS结构。本文描述了一种利用培养的海马神经元进行实验的方案 ANK3-E22/23-flox小鼠在转染Cre-BFP后会丧失所有ankyrin-G异构体，并损害轴突起始段（AIS）的形成。结合改良的Banker胶质细胞/神经元共培养系统，我们建立了一种方法，可将480 kDa ankyrin-G-GFP质粒转染至ankyrin-G缺失的神经元中，足以恢复AIS的形成。我们进一步采用Salzer及其同事开发的定量方法，以应对海马神经元培养中AIS与神经元胞体之间距离存在的变异。该方案支持对AIS的定量研究 从头合成 轴突起始段的组装与动态行为
引言
在大多数脊椎动物神经元中，轴突起始段位于轴突的近端。从功能上讲，由于该区域富含电压门控钠通道，动作电位在此处产生。某些兴奋性神经元的轴突起始段还会通过形成GABA能突触，受到抑制性中间神经元的投射1,2,3。因此，轴突起始段是整合细胞信号传导并调节神经元兴奋性的关键位点。轴突起始段通常长度为20–60 μm，位于距胞体20 μm范围之内。其长度和位置在不同脑区的神经元中存在差异，也随着同一神经元在不同发育阶段而变化4,5。越来越多的证据表明，轴突起始段的组成和位置会动态响应神经元活动的变化4,5,6,7。
480 kDa 的锚蛋白-G（ankyrin-G）是轴突起始段（AIS）的主要组织者。480 kDa 锚蛋白-G是一种膜相关衔接蛋白，可直接结合电压门控钠通道以及其他主要的AIS蛋白，包括β4-血影蛋白（beta4-sp....
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方案
注意：本实验采用加里·班克（Gary Banker）的胶质细胞/神经元共培养体系，对出生后第0天的ANK3-E22/23f/f小鼠海马神经元进行培养。因此，解剖后的所有操作步骤必须在洁净的超净台中使用灭菌工具进行。本方案耗时最长可达1个月。工作流程见图3。本方案遵循杜克大学的动物实验指南。
1. 盖玻片和神经元铺板培养皿的准备
- 在培养前至少一周，将盖玻片装入盖玻片架中，并在70%（W/W）硝酸中浸泡过夜（可延长至数天）。
- 在玻璃瓶中，用低速摇床以蒸馏水清洗经硝酸处理的盖玻片，每次1小时，共清洗2次。
- 将盖玻片在含饱和KOH的100%乙醇溶液中过夜孵育。向乙醇中加入KOH直至不再溶解为止。
- 再次用蒸馏水重复清洗步骤，随后用100%乙醇冲洗盖玻片一次，持续10分钟。
- 将盖玻片从架上转移至玻璃烧杯中，并用铝箔覆盖烧杯。在225 °C烘箱中烘烤过夜以灭菌（盖玻片可在烧杯中存放数周）。
- 将盖玻片放入培养皿中，然后在盖玻片上施加3–4个石蜡小点作为支脚。使用巴斯德吸管蘸取玻璃瓶中煮沸的石蜡，迅速轻触盖玻片形成小点。一个60 mm培养皿可容纳4个盖玻片，一个100 mm培养皿可容纳约10个盖玻片。
- 在培养前2天，用经滤膜过滤除菌的1 mg/mL多聚-....
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结果
完整的实验应包括仅转染 Cre-BFP 作为阴性对照，Cre-BFP 与 480 kDa 锚蛋白-G 共转染作为阳性对照，以及未转染组作为技术对照。在仅转染 Cre-BFP 的对照组中，转染的神经元缺乏轴突起始段（AIS）标志物的聚集，这些标志物包括锚蛋白-G（ankG）、β4-血影蛋白（β4）、神经束蛋白（Nf）和电压门控钠通道（VSVG）（图 4A）16。相反，在 Cre 与 480 kDa 锚蛋白-G 共转染的神经元中，AIS 标志物的存在表明轴突起始段已完全组装（图 4B）。通过与未转染的培养皿进行比较，以确认培养质量至关重要。不健康的神经元往往表现出异常的 AIS 结构，例如不连续或异位的 AIS（图 4C）。
接着，我们展示了评估ankyrin-G人类神经发育障碍突变（ankG-K2864N）如何影响轴突起始段（AIS）组装的一个示例（
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讨论
AIS 的组装由 480 kDa 的锚蛋白-G（ankyrin-G）介导。然而，锚蛋白-G 存在较短的同工型，这些同工型能够靶向定位于野生型神经元的 AIS，可能导致 AIS 组装结构-功能分析的解释困难。本文介绍了一种利用来自 ANK3-E22/23-flox 小鼠，可用于研究 从头合成 通过在3天体外培养（div）时转染Cre-BFP，可消除ankyrin-G的所有内源性异构体。我们还可共转染480 kDa的ankyrin-G以恢复AIS的形成，从而在无背景干扰的体系中研究AIS的组装。进一步采用Banker培养系统，可在避免胶质细胞过度生长的前提下提高神经元存活率，实现高转染效率，从而获得足够数量的神经元用于AIS尺寸的定量测量。
本实验方案中有几个关键步骤。第一个关键步骤是确定最佳的转染时间窗口，该时间应足够早以防止轴突起始段（AIS）的组装，又应足够晚以实现最高的转染效率。我们曾尝试在0天体外培养（div）时进行电穿孔转染，仅转染Cre-BFP时转染效率约为10%，但在0 div时始终无法成功转染480 kDa的Ankyrin-G。我们.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Gary Banker 博士对神经元培养方案提出的建议。本工作由霍华德·休斯医学研究所、美国国立卫生研究院（NIH）资助项目以及 George Barth Geller 荣誉教授基金（V.B.）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18 mm 盖玻片（1.5D） | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190 kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 不含酚红的 2.5% 胰蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480 kDa ankyrin-G-GFP | 实验室自制 | 按要求提供 | |
| ANK3-E22/23f/f 小鼠 | JAX | 货号：029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J； |
| B27 无血清添加剂 | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| 硼酸 | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| 带 70 µm 网格的细胞筛 | BD Biosciences | 352350 | |
| 陶瓷盖玻片染色架 | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I 添加剂 | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| 含 Earle’s 盐和 L-谷氨酰胺的 MEM | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| 70% 硝酸 | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I 低血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 盐酸聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| 氢氧化钾 | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
参考文献
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V.
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重印与许可
