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方法文章

利用原代培养的海马神经元研究轴突起始段的组装

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DOI：

10.3791/61411

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2021年2月12日

 , 
1School of Basic Medical Sciences, Xi'an Jiaotong University, 2Department of Cell Biology, Duke University, 3Department of Biochemistry, Duke University

本文内容

摘要

本文描述了一种定量研究海马神经元轴突起始段（AIS）组装与结构的实验方案，这些神经元由于缺乏巨型锚蛋白-G而不存在预先组装的AIS。

摘要

神经元轴突初始段（AIS）是动作电位的起始部位，其分子结构、组装机制以及依赖于神经活动的可塑性已被广泛研究。巨型锚蛋白G（giant ankyrin-G）是AIS的主要组织者，可直接结合跨膜电压门控钠通道（VSVG）和钾通道（KCNQ2/3），以及186 kDa的神经束蛋白（neurofascin），后者属于L1CAM细胞黏附分子家族。巨型锚蛋白G还能结合并招募细胞质内的AIS相关分子，包括β-4-血影蛋白（beta-4-spectrin）以及微管结合蛋白EB1/EB3和Ndel1。在锚蛋白G缺失的神经元中，巨型锚蛋白G足以恢复AIS的形成。锚蛋白G还存在一种较小的190 kDa亚型，定位于树突棘而非AIS，该亚型无法靶向定位至AIS，也不能在锚蛋白G缺失的神经元中恢复AIS结构。本文描述了一种利用培养的海马神经元进行实验的方案 ANK3-E22/23-flox小鼠在转染Cre-BFP后会丧失所有ankyrin-G异构体，并损害轴突起始段（AIS）的形成。结合改良的Banker胶质细胞/神经元共培养系统，我们建立了一种方法，可将480 kDa ankyrin-G-GFP质粒转染至ankyrin-G缺失的神经元中，足以恢复AIS的形成。我们进一步采用Salzer及其同事开发的定量方法，以应对海马神经元培养中AIS与神经元胞体之间距离存在的变异。该方案支持对AIS的定量研究 从头合成 轴突起始段的组装与动态行为

引言

在大多数脊椎动物神经元中，轴突起始段位于轴突的近端。从功能上讲，由于该区域富含电压门控钠通道，动作电位在此处产生。某些兴奋性神经元的轴突起始段还会通过形成GABA能突触，受到抑制性中间神经元的投射1,2,3。因此，轴突起始段是整合细胞信号传导并调节神经元兴奋性的关键位点。轴突起始段通常长度为20–60 μm，位于距胞体20 μm范围之内。其长度和位置在不同脑区的神经元中存在差异，也随着同一神经元在不同发育阶段而变化4,5。越来越多的证据表明，轴突起始段的组成和位置会动态响应神经元活动的变化4,5,6,7。

480 kDa 的锚蛋白-G（ankyrin-G）是轴突起始段（AIS）的主要组织者。480 kDa 锚蛋白-G是一种膜相关衔接蛋白，可直接结合电压门控钠通道以及其他主要的AIS蛋白，包括β4-血影蛋白（beta4-spectrin）、调节钠通道活性的KCNQ2/3通道8,9，以及186 kDa 的神经束蛋白（neurofascin）。后者是一种L1CAM家族蛋白，可引导GABA能突触定位于AIS2,10。480 kDa 锚蛋白-G含有在较短的190 kDa 锚蛋白-G亚型（ANK重复序列、血影蛋白结合结构域、调控结构域）中也存在的典型锚蛋白结构域，但其区别在于含有一段仅存在于脊椎动物中且特异性表达于神经元中的巨大外显子（图1A）11,12。480 kDa 锚蛋白-G的神经元特异性结构域（NSD）对于AIS的形成至关重要12。190 kDa 锚蛋白-G不能在锚蛋白-G缺失的神经元中促进AIS组装或靶向定位至AIS12。然而，190 kDa 锚蛋白-G可富集于含有480 kDa 锚蛋白-G的AIS区域12。190 kDa 锚蛋白-G能够靶向定位于野生型神经元中已预先组装的AIS，这一特性在文献中曾引起混淆，导致人们长期低估了480 kDa 锚蛋白-G在AIS组装过程中所发挥的关键特化功能。因此，在缺乏预先组装AIS的锚蛋白-G缺失神经元中研究AIS的组装过程至关重要。

本文介绍了一种利用ANK3-E22/23-flox小鼠的培养海马神经元研究轴突起始段（AIS）组装与结构的方法，该模型可完全消除所有亚型的锚蛋白-G（ankyrin-G）13（图1B）。通过在AIS组装前将Cre-BFP质粒转染至神经元，我们获得了完全缺失AIS的锚蛋白-G缺陷型神经元（图1B，图2）。当将480 kDa锚蛋白-G-GFP质粒与Cre-BFP质粒共转染后，AIS的组装可被完全恢复。该方法提供了一种在无预组装AIS环境中研究AIS形成过程的途径。此外，我们对Gary Banker建立的胶质细胞-神经元共培养体系进行了改良，去除了抗生素的使用，并将原本适用于胚胎第18天神经元的该体系拓展应用于出生后小鼠神经元；同时优化了AIS定量分析方法，通过对多个神经元的AIS测量值取平均值，以校正AIS的个体差异14,15。

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方案

注意：本实验采用加里·班克（Gary Banker）的胶质细胞/神经元共培养体系，对出生后第0天的ANK3-E22/23f/f小鼠海马神经元进行培养。因此，解剖后的所有操作步骤必须在洁净的超净台中使用灭菌工具进行。本方案耗时最长可达1个月。工作流程见图3。本方案遵循杜克大学的动物实验指南。

1. 盖玻片和神经元铺板培养皿的准备

  1. 在培养前至少一周，将盖玻片装入盖玻片架中，并在70%（W/W）硝酸中浸泡过夜（可延长至数天）。
  2. 在玻璃瓶中，用低速摇床以蒸馏水清洗经硝酸处理的盖玻片，每次1小时，共清洗2次。
  3. 将盖玻片在含饱和KOH的100%乙醇溶液中过夜孵育。向乙醇中加入KOH直至不再溶解为止。
  4. 再次用蒸馏水重复清洗步骤，随后用100%乙醇冲洗盖玻片一次，持续10分钟。
  5. 将盖玻片从架上转移至玻璃烧杯中，并用铝箔覆盖烧杯。在225 °C烘箱中烘烤过夜以灭菌（盖玻片可在烧杯中存放数周）。
  6. 将盖玻片放入培养皿中，然后在盖玻片上施加3–4个石蜡小点作为支脚。使用巴斯德吸管蘸取玻璃瓶中煮沸的石蜡，迅速轻触盖玻片形成小点。一个60 mm培养皿可容纳4个盖玻片，一个100 mm培养皿可容纳约10个盖玻片。
  7. 在培养前2天，用经滤膜过滤除菌的1 mg/mL多聚-L-赖氨酸（溶于0.1 M硼酸缓冲液，pH 8.5）对盖玻片（带石蜡点的一面）进行包被，时间不少于6小时，随后用蒸馏水冲洗2次，每次1小时。盖玻片保留在同一培养皿中。
  8. 缓慢向培养皿中加入铺板培养基（MEM添加0.6%（wt/vol）葡萄糖和10%（vol/vol）马血清），避免扰动盖玻片。将培养皿置于培养箱中，直至神经元接种日。

2. 准备胶质细胞饲养层培养皿（培养日前两周）

  1. 从出生后1天的小鼠脑组织中解剖出皮层，并剥离软脑膜。
  2. 在洁净台中的干净培养皿内，用干净的剪刀将皮层组织尽可能剪碎。
  3. 将剪碎的组织转移至12 mL HBSS中，加入1.5 mL 2.5%胰蛋白酶和1% (wt/vol) DNase。在37 °C水浴中孵育15分钟，每5分钟轻轻摇动一次。消化充分的组织会变得黏稠并形成大团块。用10 mL移液管吹打10–15次，以破碎组织并促进进一步消化。
  4. 用5 mL移液管将消化充分的组织吹打10–15次，直至大部分组织块消失，液体变为浑浊。通过细胞筛网过滤，去除残留组织块，并加入15 mL胶质细胞培养基（含葡萄糖（0.6% wt/vol）、10% (vol/vol) 马血清和青霉素-链霉素（1x）的最低必需培养基（MEM）），以终止消化反应。
  5. 以120 × g 离心5分钟，吸除上清液。用新鲜胶质细胞培养基重悬细胞沉淀，并接种于细胞培养皿中（约105 个细胞/cm2）。
  6. 次日更换为新鲜胶质细胞培养基，以去除未贴壁的细胞。
  7. 每3–4天用新鲜胶质细胞培养基更换培养液。换液前用手轻拍培养瓶5–10次，以去除松散贴壁的细胞。
  8. 培养10天后，胶质细胞应接近完全汇合。用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化胶质细胞，将约105 个细胞接种至新的60 mm细胞培养皿中。剩余细胞可冻存以备后续使用。
  9. 在计划接种神经元的3天前，将胶质细胞培养基更换为神经元培养基（Neurobasal-A培养基，添加1x GlutaMAX-I和1x B27补充剂）。

3. 培养海马神经元

注意：所有步骤均在室温下进行。

  1. 从出生后1天的幼鼠中解剖6-8个海马组织 ANK3-E22/23f/f 在培养皿中用HBSS培养基于室温下处理小鼠海马组织。用解剖剪将海马剪成更小的片段。将海马组织从培养皿转移至15 mL离心管中。
  2. 用5 mL HBSS在离心管中洗涤海马体2次。洗涤后，将海马体留于4.5 mL 1×HBSS中。
  3. 将0.5 mL的2.5%胰蛋白酶加入4.5 mL HBSS中，于37 °C水浴孵育15分钟，每5分钟颠倒混匀一次。消化充分的海马组织应变得黏稠并聚集成团。如有需要，可延长消化时间5分钟。
  4. 用HBSS洗涤海马3次，每次5分钟。 不 使用真空装置吸除HBSS。海马体非常容易取出。
  5. 洗涤后加入 2 mL HBSS，用巴氏吸管将海马组织上下吹打 15 次。
  6. 用火焰抛光的巴斯德移液管（开口直径缩小一半）吹打组织10次。 不 即使仍有组织块残留，也不要超过10次，过度剪切会杀死神经元。
  7. 静置试管5分钟，直至所有组织块沉降至管底。用1 mL移液枪头轻轻将含有解离神经元的上清液转移至铺板培养皿中（105 细胞/60 mm 培养皿）。将其直接加入预孵育的铺板培养基中，并轻轻摇动培养板。
  8. 重复步骤 3.6–3.7，直至大部分组织块消失。
  9. 接种后2-4小时，使用光学显微镜检查培养皿。大多数神经元应已贴附于盖玻片上。已贴附的细胞呈圆形且透亮。用精细尖头镊子将盖玻片翻转，转移至含有预处理神经元培养基的胶质细胞饲养层培养皿中，蜡点面朝下。
  10. 神经元可在胶质细胞饲养层培养皿中生长长达1个月。每隔7天用1 mL新鲜神经元培养基为神经元换液。
  11. 可选步骤：接种后1周，加入阿糖胞苷（1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶）至终浓度5 μM，以抑制胶质细胞增殖。

4. 在神经元发育早期阶段敲除锚定蛋白-G以破坏轴突起始段

  1. 第3天 体外将带有蜡点的一面朝上翻转盖玻片，放入含有神经元条件培养基的胶质细胞饲养层培养皿中。
  2. 将0.25 μg Cre-BFP DNA与0.5 μg锚蛋白G-GFP（野生型/突变型）DNA混合于1.7 mL离心管中，用于转染4个盖玻片（DNA拷贝数比例约为2:1）。加入100 μL培养基（如Opti-MEM），混匀后置于试管架上静置。若仅转染Cre-BFP，则加入GFP质粒骨架以补足总DNA量。
  3. 在新的1.7 mL离心管中，将3 μL转染试剂（例如Lipofectamine 2000）（约为DNA体积的3倍）与100 μL培养基混合，室温孵育5分钟。
  4. 将步骤4.2中的100 μL DNA溶液与步骤4.3中的100 μL转染试剂混合，置于试管架上静置5–10分钟。
  5. 在每张盖玻片上方，将步骤4.4中的50 μL DNA混合液直接加入，移液枪头插入培养基液面下方但不接触盖玻片。缓慢移液，避免DNA混合液扩散。
  6. 将培养皿缓慢移回培养箱，孵育30-45分钟。
  7. 将盖玻片翻转，蜡点面朝下放回原胶质细胞饲养皿中，并将培养板放回培养箱。

5. 轴突起始段的定量分析

  1. 在7-10天体外培养后固定神经元，并根据目标蛋白的标准免疫细胞化学染色方案对轴突起始段（AIS）标记物进行染色。
  2. 使用所需的显微镜采集荧光图像。
    1. 采集Z轴序列光学切片，以获取整个AIS的信号。所有图像应保持相同的Z轴深度。
    2. 调节激光强度，以获得最佳的像素强度动态范围。
    3. 确保所有AIS图像均在相同的显微镜设置下采集。
    4. 始终检查Cre-BFP的信号。
  3. AIS定量分析
    1. 使用Fiji软件（https://fiji.sc）打开图像。
    2. 对Z轴序列图像生成最大强度投影。
    3. 从图像中减去空白盖玻片的背景信号。
    4. 沿AIS绘制一条直线，线宽应完全覆盖AIS区域。起始点应在AIS信号尚未高于背景处，终点应在信号回落至背景水平之后。
    5. 测量沿该直线的平均像素强度，并导出至电子表格（每组约需10-15个AIS数据）。
    6. 使用根据Berger等15改编的MATLAB脚本生成AIS的平均强度曲线。
    7. 每次实验均应包括仅转染Cre以及共转染Cre与野生型480 kDa锚蛋白G（ankyrin-G）的神经元，作为阴性对照和阳性对照，以确保AIS敲除效率及功能回补成功。

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结果

完整的实验应包括仅转染 Cre-BFP 作为阴性对照，Cre-BFP 与 480 kDa 锚蛋白-G 共转染作为阳性对照，以及未转染组作为技术对照。在仅转染 Cre-BFP 的对照组中，转染的神经元缺乏轴突起始段（AIS）标志物的聚集，这些标志物包括锚蛋白-G（ankG）、β4-血影蛋白（β4）、神经束蛋白（Nf）和电压门控钠通道（VSVG）（图 4A）16。相反，在 Cre 与 480 kDa 锚蛋白-G 共转染的神经元中，AIS 标志物的存在表明轴突起始段已完全组装（图 4B）。通过与未转染的培养皿进行比较，以确认培养质量至关重要。不健康的神经元往往表现出异常的 AIS 结构，例如不连续或异位的 AIS（图 4C）。

接着，我们展示了评估ankyrin-G人类神经发育障碍突变（ankG-K2864N）如何影响轴突起始段（AIS）组装的一个示例（

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讨论

AIS 的组装由 480 kDa 的锚蛋白-G（ankyrin-G）介导。然而，锚蛋白-G 存在较短的同工型，这些同工型能够靶向定位于野生型神经元的 AIS，可能导致 AIS 组装结构-功能分析的解释困难。本文介绍了一种利用来自 ANK3-E22/23-flox 小鼠，可用于研究 从头合成 通过在3天体外培养（div）时转染Cre-BFP，可消除ankyrin-G的所有内源性异构体。我们还可共转染480 kDa的ankyrin-G以恢复AIS的形成，从而在无背景干扰的体系中研究AIS的组装。进一步采用Banker培养系统，可在避免胶质细胞过度生长的前提下提高神经元存活率，实现高转染效率，从而获得足够数量的神经元用于AIS尺寸的定量测量。

本实验方案中有几个关键步骤。第一个关键步骤是确定最佳的转染时间窗口，该时间应足够早以防止轴突起始段（AIS）的组装，又应足够晚以实现最高的转染效率。我们曾尝试在0天体外培养（div）时进行电穿孔转染，仅转染Cre-BFP时转染效率约为10%，但在0 div时始终无法成功转染480 kDa的Ankyrin-G。我们...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Gary Banker 博士对神经元培养方案提出的建议。本工作由霍华德·休斯医学研究所、美国国立卫生研究院（NIH）资助项目以及 George Barth Geller 荣誉教授基金（V.B.）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10xHBSSThermo Fisher Scientific14065-056
18 mm 盖玻片（1.5D）Fisher Scientific12-545-84-1D
190 kDa ankyrin-G-GFPAddgene#31059
不含酚红的 2.5% 胰蛋白酶Thermo Fisher Scientific14065-056
480 kDa ankyrin-G-GFP实验室自制按要求提供
ANK3-E22/23f/f 小鼠JAX货号：029797B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J；
B27 无血清添加剂Thermo Fisher ScientificA3582801
硼酸Sigma-AldrichB6768
带 70 µm 网格的细胞筛BD Biosciences352350
陶瓷盖玻片染色架Thomas Scientific8542E40
Cre-BFPAddgene#128174
D-葡萄糖Sigma-AldrichG7021
DMEMThermo Fisher Scientific11995073
GlutaMAX-I 添加剂Thermo Fisher ScientificA1286001
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668030
含 Earle’s 盐和 L-谷氨酰胺的 MEMThermo Fisher Scientific11095-080
Neurobasal 培养基Thermo Fisher Scientific21103-049
70% 硝酸Sigma-Aldrich225711
Opti-MEM I 低血清培养基Thermo Fisher Scientific31985062
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148
青霉素-链霉素Thermo Fisher Scientific15140122
盐酸聚-L-赖氨酸Sigma-Aldrich26124-78-7
氢氧化钾Sigma-Aldrich1310-58-3

参考文献

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