使用定制递送系统进行磁性纳米颗粒热疗的体外与体内递送

摘要

本方案介绍了利用先进的递送与监测系统，精确实施磁性纳米颗粒热疗所需的技术与方法。

摘要

高温疗法长期以来一直用于癌症治疗。技术手段从肿瘤内插入热铁棒，发展到全身递送靶向肿瘤抗体的磁性纳米颗粒，温度范围从39 ˚C（发热水平）到1000 ˚C（电灼术），治疗时间从数秒至数小时不等。温度与时间的关系（热剂量）决定了治疗效果：高热剂量可导致组织消融，而较低热剂量则产生亚致死效应，如血流增加、药物蓄积和免疫刺激。目前最有前景的医学疗法之一是磁性纳米颗粒高温疗法 （mNPH）。该技术通过无创、无毒的交变磁场激活磁性纳米颗粒，这些颗粒可通过全身或瘤内途径递送。磁性纳米颗粒的尺寸、结构及其聚集状态，以及磁场的频率和场强，是影响加热效果的主要因素。我们已开发出先进的仪器和方法，可在大小动物模型及培养细胞中实现可重复的磁性纳米颗粒高温治疗。该方法通过在多个位置进行连续、实时的温度监测，能够在限制非靶组织加热的同时，向靶组织（肿瘤）或细胞递送明确定义的热剂量。通过在多个位点精确控制和监测温度，并采用行业标准算法（43 ˚C下的累积等效分钟数/CEM43），可准确测定和量化热剂量。我们的系统支持多种温度、热剂量及生物学效应，是通过商业采购与自主研发的工程及生物学技术相结合而构建的。该系统经过优化，可快速在离体、体外和体内实验技术之间转换。本实验方案的目标是展示如何设计、开发并实施一种有效且可重复、精确的磁性纳米颗粒（mNP）高温治疗技术与系统。

引言

热疗在癌症治疗中已有悠久历史，可单独使用或与其他疗法联合应用。尽管其应用历史悠久，但最有效的治疗递送方式仍在探讨之中，且取决于疾病部位和位置。热疗的递送方法包括微波、射频、聚焦超声、激光以及金属纳米颗粒（如金或氧化铁）^1,2,3,4。这些递送方法可实现从发热水平到数百摄氏度不等的治疗温度范围。热疗的生物学效应主要取决于所使用的温度及治疗持续时间⁵。在本论文及研究目的中，我们聚焦于磁性纳米颗粒热疗（mNPH）。该方法利用无毒、经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的氧化铁纳米颗粒，实现精准、局部化、可监测且可控的温度变化。

其他热疗方式的一个缺陷是缺乏精确的细胞靶向性；由于热疗本身并不具备较高的治疗指数，因此必须进行精确的测温和靶向控制⁶。磁性纳米颗粒介导的热疗（mNPH）可通过系统性或瘤内注射磁性纳米颗粒（mNPs），仅在mNPs所在位置产生热量，从而实现对肿瘤的直接靶向治疗。无论磁性纳米颗粒位于细胞内还是细胞外，mNPH均可有效发挥作用。在癌症治疗中，mNPH的基本原理是：将磁性纳米颗粒注射至肿瘤内或通过静脉注射，随后施加交变....

方案

达特茅斯学院动物护理与使用项目已获得美国实验动物护理评估与认证协会（AAALAC）认证，并遵守所有美国农业部（USDA）和美国国立卫生研究院（NIH）实验动物福利办公室的指南与法规。所有体内研究均经达特茅斯学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。安乐死操作遵循2020年美国兽医医学协会（AVMA）标准。 动物安乐死指南

1. 仪器/系统设计

1. 设计定制的交变磁场（AMF）天线（线圈），使其构成闭合回路，并选择合适的形状以产生所需的磁场。根据所选电源发生器的电感公式和特性，设计相匹配的线圈以生成目标磁场。体外实验与体内实验应采用不同的设计。
2. 确保AMF天线的电感值处于电源发生器可接受的范围内。通过增加或减少电容器来匹配（调谐）天线与电源发生器。
3. 对于体外实验，设计一个14匝螺旋线圈，内径为2 cm，长度为14 cm，能够容纳1.5 mL的试管，以便同时处理多个样品。使用乙烯基聚合物对线圈进行绝缘，并采用聚苯乙烯间隔物将线圈与试管分离。设计规格和相关考虑的详细信息见补充文件1。
4. 对于体内实验，从制造商处获取定制的整体式螺旋线圈，其设计信息为专有。使用8 mm方形管材（因其可在线圈孔腔内产生更均匀的磁场），并在目标治疗区域设置聚磁器。聚磁器长度为5.0 cm，共5匝，内径为3.6 cm，外径为5.2 cm，并将其置于目标治疗区域。用聚碳酸酯外....

结果

体外研究
只有当磁性纳米颗粒/铁的用量和浓度与交变磁场（AMF）参数适当匹配时，细胞才能达到并维持所需的温度和热剂量。在体外（以及体内）使用磁性纳米颗粒对细胞进行加热时，应注意：要使摄取了磁性纳米颗粒的细胞达到高温治疗效果，必须具备一定水平的细胞内磁性纳米颗粒/铁（mNP/Fe）含量，同时细胞之间的数量和相对距离也至关重要。如果靶细胞/组织中的 mNP/Fe 水平足以产生加热效应，则可通过调节磁场频率和强度来达到所需的温度和治疗效果。若实验分组设计得当，便可进一步开展针对不同剂量和处理时间下基因及分子水平差异的研究¹⁷。图1 展示了体外实验方法的示意图。

这些体外方法可用于研究细胞中mRNA和蛋白质表达的变化。我们实验室最近的一项研究确定了在CEM43 30 mNPH处理、8 Gy辐射处理以及两者联合处理后出现的免疫遗传学差异。我们能够识别免疫通路和细胞毒性通路中表达的相似性和差异性，从而更深入地理解这些效应背后的机制及其协同作用方式.......

讨论

该系统的设计与实施能够开展准确且可重复的体外和体内磁性纳米颗粒热疗实验。系统设计的关键在于，交变磁场（AMF）的频率和场强必须与所用磁性纳米颗粒的类型、浓度以及目标组织位置和所需温度充分匹配。此外，实时准确地监测温度对于安全性和精确计算热剂量（43 °C下的累积等效分钟数，CEM）至关重要。如图1所示的探针放置方式，可实现对热剂量和核心体温的实时监测，如图2所示。

准确实施磁性纳米颗粒热疗的第一步是为动物和操作人员建立一个安全的系统。从操作和递送的角度来看，该系统的各个组成部分也应被充分理解。在此情况下，这意味着需要了解交变磁场涡流的潜在影响，并明确磁性颗粒的位置。天线（或线圈）是决定磁场形状和强度的关键因素，而所采用的冷却系统对于防止线圈过热至关重要²⁰。导体外部的磁场强度与流经导体的电流强度成正比。导体周围空间中任意一点的磁场强度，是该区域周围各导体所产生的磁场的矢量和。磁场方向垂直于电流方向，其强度随距离导体的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶	Corning	45000-664	可从多家公司获得
1.5 mL 离心管	Eppendorf	Eppendorf 22363204	可从多家公司获得
B16F10 小鼠黑色素瘤细胞	美国模式培养物集存库	CRL-6475
C57/Bl6 小鼠	Charles River	027C57BL/6	6 周龄雌性小鼠
冷却器	Thermal Care	NQ 5 系列	用于冷却线圈的冷却装置
冷却液	陶氏化学公司	Dowtherm SR-1	天线冷却液
胎牛血清	Hyclone	SH30071	可从多家公司获得
光纤探针、软件和机箱	FISO		使用 FISO Evolution 软件读取温度
红外相机	Flir		用于监测非预期加热的红外相机
氧化铁纳米颗粒	micromod Partikeltechnologie GmbH	Bionized NanoFerrite	葡聚糖包被的氧化铁纳米颗粒
小鼠线圈，螺线管线圈	Fluxtrol	定制
青霉素/链霉素	Corning	45000-652	可从多家公司获得
射频发生器	Huttinger	TIG 10/300	电源
RPMI 培养基	Corning	45000-396	可从多家公司获得