使用定制递送系统进行磁性纳米颗粒热疗的体外与体内递送

摘要

本方案介绍了利用先进的递送与监测系统，精确实施磁性纳米颗粒热疗所需的技术与方法。

摘要

高温疗法长期以来一直用于癌症治疗。技术手段从肿瘤内插入热铁棒，发展到全身递送靶向肿瘤抗体的磁性纳米颗粒，温度范围从39 ˚C（发热水平）到1000 ˚C（电灼术），治疗时间从数秒至数小时不等。温度与时间的关系（热剂量）决定了治疗效果：高热剂量可导致组织消融，而较低热剂量则产生亚致死效应，如血流增加、药物蓄积和免疫刺激。目前最有前景的医学疗法之一是磁性纳米颗粒高温疗法 （mNPH）。该技术通过无创、无毒的交变磁场激活磁性纳米颗粒，这些颗粒可通过全身或瘤内途径递送。磁性纳米颗粒的尺寸、结构及其聚集状态，以及磁场的频率和场强，是影响加热效果的主要因素。我们已开发出先进的仪器和方法，可在大小动物模型及培养细胞中实现可重复的磁性纳米颗粒高温治疗。该方法通过在多个位置进行连续、实时的温度监测，能够在限制非靶组织加热的同时，向靶组织（肿瘤）或细胞递送明确定义的热剂量。通过在多个位点精确控制和监测温度，并采用行业标准算法（43 ˚C下的累积等效分钟数/CEM43），可准确测定和量化热剂量。我们的系统支持多种温度、热剂量及生物学效应，是通过商业采购与自主研发的工程及生物学技术相结合而构建的。该系统经过优化，可快速在离体、体外和体内实验技术之间转换。本实验方案的目标是展示如何设计、开发并实施一种有效且可重复、精确的磁性纳米颗粒（mNP）高温治疗技术与系统。

引言

热疗在癌症治疗中已有悠久历史，可单独使用或与其他疗法联合应用。尽管其应用历史悠久，但最有效的治疗递送方式仍在探讨之中，且取决于疾病部位和位置。热疗的递送方法包括微波、射频、聚焦超声、激光以及金属纳米颗粒（如金或氧化铁）^1,2,3,4。这些递送方法可实现从发热水平到数百摄氏度不等的治疗温度范围。热疗的生物学效应主要取决于所使用的温度及治疗持续时间⁵。在本论文及研究目的中，我们聚焦于磁性纳米颗粒热疗（mNPH）。该方法利用无毒、经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的氧化铁纳米颗粒，实现精准、局部化、可监测且可控的温度变化。

其他热疗方式的一个缺陷是缺乏精确的细胞靶向性；由于热疗本身并不具备较高的治疗指数，因此必须进行精确的测温和靶向控制⁶。磁性纳米颗粒介导的热疗（mNPH）可通过系统性或瘤内注射磁性纳米颗粒（mNPs），仅在mNPs所在位置产生热量，从而实现对肿瘤的直接靶向治疗。无论磁性纳米颗粒位于细胞内还是细胞外，mNPH均可有效发挥作用。在癌症治疗中，mNPH的基本原理是：将磁性纳米颗粒注射至肿瘤内或通过静脉注射，随后施加交变磁场（AMF），使纳米颗粒的磁极持续重新排列，从而导致与纳米颗粒相关的细胞和组织局部升温^7,8。通过调节纳米颗粒的用量以及交变磁场的频率和强度，可精确控制组织内产生的温度。

这种治疗方法对靠近体表的肿瘤效果较好，因为较深的肿瘤需要更强的交变磁场（AMF），从而增加了涡电流加热的风险⁹。已有临床证据表明，热疗可作为单一疗法使用，但更多情况下，热疗会与放射治疗或化学治疗联合应用，以实现更精准的抗肿瘤效果^10,11,12。热疗与放射治疗联合应用的临床证据已在先前的文献中综述¹³。我们实验室已成功利用磁性纳米粒子介导的非侵入性热疗（mNPH）方法治疗了多种动物，包括小鼠、猪以及自发性犬类癌症^12,14,15。本实验方案适用于希望研究局部热疗单独或联合其他疗法治疗效果的研究人员。

在热疗中，最重要的因素之一是能够实时测量并理解递送至靶区/肿瘤组织的热剂量。计算和比较剂量的标准方法是通过在43 °C下的等效累积分钟数来实现；该算法允许在不同递送系统、最高与最低温度（在特定范围内）以及升温和降温参数之间独立比较剂量^5,16。CEM计算在39–57 °C温度范围内效果最佳⁵。例如，在我们开展的一些研究中，我们选择了CEM43 30的热剂量（即在43 °C下持续30分钟）。选择该剂量使我们能够在体外单独或联合单次放射治疗时，评估安全且有效的免疫遗传学效应¹⁷。

在构建适当的磁性纳米颗粒热疗递送系统时，需要考虑多个因素。仪器设计包含重要的安全因素，例如使用冷却器以确保磁场递送设备在高功率运行时仍能保持低温，以及设置安全联锁程序，防止在温度、功率评估和控制系统未完全启动时开启系统。此外，在体外和体内实验中均需考虑重要的生物学因素。使用培养细胞时，必须在生长培养基中进行处理，并维持恒定的适宜温度，以避免可能影响实验结果的生理变化。对于特定类型的纳米颗粒，在计算交变磁场（AMF）加热参数时，必须了解其比吸收率（SAR）。同样，了解细胞和组织中实现预期加热效果所需的磁性纳米颗粒/铁（mNP/Fe）浓度也至关重要。体内实验需要更加细致的操作，因为动物在治疗过程中必须处于麻醉状态，且其核心体温需在整个治疗期间维持在正常水平。若允许动物体温下降（麻醉状态下易发生），将会影响治疗组织的热剂量，从而影响整体实验结果。

在本文中，我们讨论了设计和构建一种多功能磁性纳米颗粒热疗系统所采用的方法，以及需要考虑的重要使用因素。所描述的系统能够实现对磁性纳米颗粒热疗的稳定、一致、符合生物学要求、安全且高度可控的递送。最后需要指出的是，我们开展的磁性纳米颗粒热疗（mNPH）研究通常涉及其他治疗方式，如放射治疗、化学治疗和免疫治疗。为了使这些研究结果具有意义，必须明确所施加的热量如何影响其他治疗方式的疗效和/或安全性-毒性（反之亦然），以及对动物整体健康的影响。基于这一原因，以及前述的剂量学和治疗情境，严格关注磁性纳米颗粒热疗的剂量准确性以及对核心温度和靶区温度的连续监测至关重要。本实验方案的目标是提供一种简明、一致的方法和操作描述，以实现安全且有效的磁性纳米颗粒热疗递送。

方案

达特茅斯学院动物护理与使用项目已获得美国实验动物护理评估与认证协会（AAALAC）认证，并遵守所有美国农业部（USDA）和美国国立卫生研究院（NIH）实验动物福利办公室的指南与法规。所有体内研究均经达特茅斯学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。安乐死操作遵循2020年美国兽医医学协会（AVMA）标准。 动物安乐死指南

1. 仪器/系统设计

1. 设计定制的交变磁场（AMF）天线（线圈），使其构成闭合回路，并选择合适的形状以产生所需的磁场。根据所选电源发生器的电感公式和特性，设计相匹配的线圈以生成目标磁场。体外实验与体内实验应采用不同的设计。
2. 确保AMF天线的电感值处于电源发生器可接受的范围内。通过增加或减少电容器来匹配（调谐）天线与电源发生器。
3. 对于体外实验，设计一个14匝螺旋线圈，内径为2 cm，长度为14 cm，能够容纳1.5 mL的试管，以便同时处理多个样品。使用乙烯基聚合物对线圈进行绝缘，并采用聚苯乙烯间隔物将线圈与试管分离。设计规格和相关考虑的详细信息见补充文件1。
4. 对于体内实验，从制造商处获取定制的整体式螺旋线圈，其设计信息为专有。使用8 mm方形管材（因其可在线圈孔腔内产生更均匀的磁场），并在目标治疗区域设置聚磁器。聚磁器长度为5.0 cm，共5匝，内径为3.6 cm，外径为5.2 cm，并将其置于目标治疗区域。用聚碳酸酯外壳包裹线圈。
5. 使用功率和频率可调、额定功率为10 kW或更高的交变磁场发生器作为电源。将电源与天线/线圈的电感匹配至0.62至1.18 µ亨（µH）范围内，以支持30–300 kHz之间的频率。通过离心增压泵循环水对发生器进行冷却，压力调节至50 psi。
6. 使用制冷能力为5.6吨的冷水机对线圈进行冷却，冷水机将25%乙二醇基导热流体与水稀释后泵入交变磁场天线。设定冷水机温度，使天线不会对样品产生加热或冷却效应。
7. 对于动物固定，构建一个管状固定装置，可悬置于线圈中心，固定装置与线圈表面之间保持0.5 cm的空气间隙。连接一个可调节的控温气泵，使空气在线圈周围的外壳中循环，并设定为维持动物正常的体温核心温度。将麻醉机连接至管状动物固定装置的动物头部附近，以确保麻醉气体的准确输送。
8. 对于细胞固定，构建一个装置，使水浴中的水循环流经放置试管的间隔区域。调节水浴温度，使试管周围水温维持在37 °C。
9. 使用光纤探针监测肿瘤内部、动物核心温度及动物周围环境的温度；对于体外实验，则监测细胞沉淀物及试管周围水的温度。
10. 所有实验均使用粒径为100 nm的磁性氧化铁纳米颗粒。
    注意：浓度和比吸收率（SAR）是在选择纳米颗粒时必须考虑的两个特性，因其直接影响可能的加热效果和热剂量¹⁸。

2. 体外热疗

1. 在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（Pen/strep）的RPMI培养基中培养B16F10小鼠黑色素瘤细胞。每孔加入2 mL完全培养基，以每孔150,000个细胞接种于6孔板中。
2. 确定每个孔的相应处理方式，即：不加磁性纳米颗粒（mNPs）且不施加交变磁场（AMF）的细胞、加mNPs但不施加AMF的细胞、不加mNPs但施加AMF的细胞、同时加mNPs并施加AMF的细胞。
   注意：若将热疗与其他治疗方法联合使用，还需设置适当的对照组。AMF实验在经过改装以具备所需电源和冷却能力的标准科研实验台上进行。
3. 接种24小时后，根据上一步确定的方案向相应孔中加入mNPs，使铁浓度达到3 mg/mL。可通过配制含mNPs的培养基储备液（弃去旧培养基后加入该溶液），或直接将mNPs加入孔中并轻轻摇晃培养板，以确保mNPs在孔内均匀分布。
4. 在加入mNPs后48小时（此时细胞汇合度约为80%）开始处理，先弃去培养基，并用新鲜培养基洗涤各孔，随后再次弃去培养基。
5. 向每个待处理孔中加入0.5 mL胰蛋白酶溶液，并轻轻摇晃。使用显微镜观察，确认细胞已完全脱落。
6. 向每个孔中加入1 mL培养基以收集细胞，转移至1.5 mL离心管中。收集每个孔中的全部细胞（约1 × 10⁶个细胞），每个孔使用单独标记清晰的离心管。
7. 以60 × g 离心2–3分钟，使细胞沉淀。保留沉淀及管中的培养基。
8. 将离心管置于装满水的支架中，并放入线圈内。调节水浴温度，使培养基和细胞沉淀维持在37 °C。使用独立的光纤温度探针分别监测离心管内和水浴中的温度。
9. 开启冷却器，检查冷却液是否正常流经线圈。打开电源，调节输出功率至所需磁场强度。使用10 kW发生器供电的14匝螺线管线圈，工作参数为165 kHz和23.87 kA/m（300 Oe）。
10. 将另一根光纤温度探针插入其中一个离心管中，持续处理细胞直至达到预先设定的热剂量。例如，在43 °C下处理30分钟（CEM43值为30）。
11. 将细胞重新悬浮于离心管中的培养基中，并重新接种至新的6孔板中，新板需明确标记。目标是将所收集的全部细胞（约1 × 10⁶个细胞）重新接种。
    注意：应使用新的6孔板，以确保所培养的细胞均经过处理。若重复使用旧板，可能存在未被完全消化的残留细胞。
12. 如有需要，在后续实验步骤中裂解细胞，用于RNA或蛋白质表达分析。

3. 体内热疗

1. 细胞培养与接种
   1. 在含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI培养基中培养B16F10小鼠黑色素瘤细胞。使用能够提供足够细胞以接种所需数量动物的培养板/培养皿。例如，将100,000个细胞接种于10个100 mm培养皿中，48小时内可达到汇合，获得足够用于20只小鼠注射的细胞量。
   2. 用胰蛋白酶消化细胞，并使用不含FBS及青霉素-链霉素的RPMI培养基收集细胞。
   3. 计数细胞，并根据接种体积和小鼠数量配制所需细胞浓度的溶液。
   4. 使用异氟烷气体和氧气麻醉6周龄雌性C57Bl/6小鼠。将动物置于含5%异氟烷和95%氧气的有机玻璃箱中，直至麻醉诱导完成。诱导完成后，取出动物，改用面罩输送2%异氟烷，以完成步骤3.1.5–3.1.7和3.3.3–3.3.6。
      注意：治疗期间麻醉时，使用内置的麻醉气体 containment 装置。遵循机构规定的标准小鼠麻醉操作规程。在开展动物实验前，须获得相应的 IACUC 批准。麻醉结束后，将动物放回笼中，并监测其恢复情况，以确保无任何并发症。
   5. 检查翻正反射是否消失。
   6. 使用电动剃须刀剃除右侧 flank（ flank 指动物体侧，通常为腰肋部）区域的毛发。
   7. 用酒精棉片清洁注射部位。注射 1-2 x 10⁶ 使用100 µL玻璃注射器配28 G针头，将细胞在麻醉小鼠剃毛的右侧 flank 区域皮内注射50 µL培养基分散液。
2. 肿瘤生长/纳米颗粒注射
   1. 使用游标卡尺在三个维度上测量肿瘤（长、宽、深），并通过（长 × 宽 × 深 × π)/6.
   2. 当肿瘤体积达到 120 mm³ （± 20 毫米）³），将动物投入实验。设计实验方案，确保设置适当的对照组和处理组，包括联合治疗队列（即对照组、mNPH组、放疗组和联合治疗组）。
   3. 按照3.1.4节所述方法对将接受mNPs的小鼠进行麻醉。
   4. 用酒精棉片清洁区域。在交变磁场治疗前3小时将磁性纳米颗粒注入肿瘤。注射体积应使剂量达到每立方厘米肿瘤7.5 mg铁。³ 肿瘤。
      注意：实验室未发表数据表明，mNP 的最大摄取量出现在 3–6 小时。
3. AMF 处理
   1. 麻醉小鼠并置于加热垫上以维持核心体温。
   2. 检查小鼠是否丧失翻正反射。取下小鼠的耳标或其他金属物品。
   3. 将涂有润滑剂的光纤温度探头轻轻插入小鼠直肠内。
   4. 将导管插入肿瘤内，取出针芯。剪裁导管，使其不致过度突出于肿瘤外。
      注意：光纤温度导管在小鼠处于全身麻醉状态下放置和取出，即导管仅在肿瘤加热过程中留置。在操作过程中，小鼠皮下注射一次非甾体抗炎镇痛药酮洛芬（5 mg/kg）。我们未观察到导管放置后出现短期或长期不适或病态反应。
   5. 将一个三传感器光纤温度探头插入导管中。导管可保护光纤温度探头的传感器。
   6. 用胶带将直肠和瘤内探针固定在动物尾部，以确保其位置保持不变。
   7. 将小鼠放入50 mL离心管中，头部朝向管底。离心管靠近头部的位置应有一个小孔，用于连接并输送麻醉气体。
   8. 将试管放入线圈装置中，并重新连接麻醉系统。
   9. 将光纤温度探头松散地放入管中，以测量环境温度。
   10. 打开冷水机，并确保冷却液正在循环。
   11. 检查并确保计算机软件显示各项温度，开始记录以实时显示CEM43计算结果。所需的CEM43剂量为先前确定的剂量。
       注意：在开启磁铁之前，确保动物身上未附着任何金属物品，因为这些物品会迅速发热。此外，确保房间内的每个人都没有心脏起搏器，并确认他们处于安全环境中。
   12. 以较低的功率百分比开启磁体。
   13. 确保光纤温度探针记录温度变化。一旦交变磁场（AMF）启动且磁场增强，温度将开始上升。保持动物的核心体温维持在38 °C，通过调节控温气套来控制核心体温。
   14. 通过调节发生器上的内置控制旋钮来改变磁场强度，进而控制肿瘤区域的温度水平。
   15. 当肿瘤内达到用户先前确定的所需剂量（例如 CEM43 40）时，关闭 AMF。
   16. AMF 关闭后，将管道从线圈中取出。
   17. 将小鼠从管中取出，拔出各个探头 & 导管。如有必要，为动物更换新的金属耳标。
   18. 处理完成后，关闭冷水机。
   19. 从麻醉中恢复动物，确保无并发症发生。监测其行为，以确认恢复正常状态。

结果

体外研究
只有当磁性纳米颗粒/铁的用量和浓度与交变磁场（AMF）参数适当匹配时，细胞才能达到并维持所需的温度和热剂量。在体外（以及体内）使用磁性纳米颗粒对细胞进行加热时，应注意：要使摄取了磁性纳米颗粒的细胞达到高温治疗效果，必须具备一定水平的细胞内磁性纳米颗粒/铁（mNP/Fe）含量，同时细胞之间的数量和相对距离也至关重要。如果靶细胞/组织中的 mNP/Fe 水平足以产生加热效应，则可通过调节磁场频率和强度来达到所需的温度和治疗效果。若实验分组设计得当，便可进一步开展针对不同剂量和处理时间下基因及分子水平差异的研究¹⁷。图1 展示了体外实验方法的示意图。

这些体外方法可用于研究细胞中mRNA和蛋白质表达的变化。我们实验室最近的一项研究确定了在CEM43 30 mNPH处理、8 Gy辐射处理以及两者联合处理后出现的免疫遗传学差异。我们能够识别免疫通路和细胞毒性通路中表达的相似性和差异性，从而更深入地理解这些效应背后的机制及其协同作用方式...

讨论

该系统的设计与实施能够开展准确且可重复的体外和体内磁性纳米颗粒热疗实验。系统设计的关键在于，交变磁场（AMF）的频率和场强必须与所用磁性纳米颗粒的类型、浓度以及目标组织位置和所需温度充分匹配。此外，实时准确地监测温度对于安全性和精确计算热剂量（43 °C下的累积等效分钟数，CEM）至关重要。如图1所示的探针放置方式，可实现对热剂量和核心体温的实时监测，如图2所示。

准确实施磁性纳米颗粒热疗的第一步是为动物和操作人员建立一个安全的系统。从操作和递送的角度来看，该系统的各个组成部分也应被充分理解。在此情况下，这意味着需要了解交变磁场涡流的潜在影响，并明确磁性颗粒的位置。天线（或线圈）是决定磁场形状和强度的关键因素，而所采用的冷却系统对于防止线圈过热至关重要²⁰。导体外部的磁场强度与流经导体的电流强度成正比。导体周围空间中任意一点的磁场强度，是该区域周围各导体所产生的磁场的矢量和。磁场方向垂直于电流方向，其强度随距离导体的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶	Corning	45000-664	可从多家公司获得
1.5 mL 离心管	Eppendorf	Eppendorf 22363204	可从多家公司获得
B16F10 小鼠黑色素瘤细胞	美国模式培养物集存库	CRL-6475
C57/Bl6 小鼠	Charles River	027C57BL/6	6 周龄雌性小鼠
冷却器	Thermal Care	NQ 5 系列	用于冷却线圈的冷却装置
冷却液	陶氏化学公司	Dowtherm SR-1	天线冷却液
胎牛血清	Hyclone	SH30071	可从多家公司获得
光纤探针、软件和机箱	FISO		使用 FISO Evolution 软件读取温度
红外相机	Flir		用于监测非预期加热的红外相机
氧化铁纳米颗粒	micromod Partikeltechnologie GmbH	Bionized NanoFerrite	葡聚糖包被的氧化铁纳米颗粒
小鼠线圈，螺线管线圈	Fluxtrol	定制
青霉素/链霉素	Corning	45000-652	可从多家公司获得
射频发生器	Huttinger	TIG 10/300	电源
RPMI 培养基	Corning	45000-396	可从多家公司获得