通过机械测试量化可注射性

摘要

本文介绍了一种利用标准力学测试装置，通过注射器-针头系统定量评估材料可注射性的实验方案。

摘要

可注射生物材料在药物和细胞的微创递送中正变得越来越受欢迎。这些材料通常比传统的水性注射液更粘稠，可能呈半固态，因此其可注射性不能想当然。本方案描述了一种利用标准力学测试仪客观评估这些材料可注射性的方法。通过测试仪的横梁以设定速率压缩注射器活塞，并测量所需的作用力。随后可使用测得的最大力值或平台力值进行样品间的比较，或与绝对力值限值进行对比。该方案适用于任何材料，以及任意规格和几何形状的注射器与针头。所得结果可用于转化研究早期阶段对配方、注射器和针头尺寸的选择决策。此外，可量化配方改变对可注射性的影响，并确定随时间变化的材料的最佳注射时机。该方法也可作为可重复的手段，用于研究注射过程对材料本身的影响，例如自愈现象或滤饼效应，或研究注射对细胞的影响。与旋转流变学相比，该方法更快且更直接适用于可注射性评估，且仅需极少的数据后处理即可获得用于直接比较的关键参数。

引言

生物材料通常被研究并用作基于细胞的组织再生支架，以及用于治疗药物的靶向、持续递送的储库¹。在这一领域中，可注射生物材料因其微创特性而日益受到关注，可降低与植入相关的感染、疼痛和瘢痕风险²。此外，由于它们通常以液体形式施用，能够完美贴合组织缺损，并可在使用前立即混入药物和细胞^3,4,5。因此，尽管可注射生物材料可制成预装注射器，但通常由临床医生在使用前即时配制。例如，骨水泥在粉剂与液剂混合后即开始固化，因此无法在使用前长期储存⁶。这些材料的表征因而具有时间依赖性，并与其制备过程密不可分。

常见的可注射生物材料包括磷酸钙水泥、聚甲基丙烯酸甲酯、生物玻璃以及多种聚合物水凝胶^3,7。与具有类似水的流变特性的传统药物注射不同，这些可注射生物材料通常具有更高的黏度、非牛顿流体特性，可能表现出一定的弹性，并且其性质可能随时间发生变化。因此，这些材料的可注射性不能假设，而必须通过实验进行评估。通过量化注射所需的作用力，并将其与注射的难易程度相关联，可在研发早期阶段对需进一步研究的生物材料配方、注射器及针头尺寸作出初步决策⁸。此类实验还可量化配方改变对可注射性的影响⁹。

评估可注射材料性能的方法有多种。旋转流变学常用于评估这些材料的黏度、非牛顿行为、剪切后恢复性、凝固时间以及其他性能^10,11,12。尽管此类测试对于确定材料的基本性能具有重要意义，但这些性能并不能直接反映材料的可注射性。对于牛顿流体以及圆柱形注射器和针头，注射力可通过哈根-泊肃叶方程的一种形式进行估算¹³：

其中，F 为注射所需的作用力（N），R_s 为注射器内径（m），R_n 为针头内径（m），L 为针头长度（m），Q 为流体流速（m³ s^-1），η 为动力黏度（Pa·s），F_f 为推杆与筒壁之间的摩擦力（N）。因此，若通过旋转流变仪测得黏度，且已知注射器和针头的尺寸，并可估算流速，则可估算注射力。然而，该方程未考虑注射器的锥形末端或其他几何结构（如偏心出液口），且 F_f 需通过机械测试进行估算或实验测定。此外，生物材料通常并非牛顿流体，而是表现出复杂的流变特性。对于简单的剪切变稀流体，方程变为¹⁴：

其中 n 为幂律指数（-），K 为稠度系数（Pa·sⁿ），源自 Ostwald de Waele 表达式：，其中 为剪切速率（s^-1）。对于无法通过两个参数表征流变特性的材料，其复杂性显著增加，尤其是对于水泥凝固等具有时间依赖性的材料。此外，若材料性质依赖于剪切作用，则必须在针管中预期的剪切速率下进行测试，该速率可能远超旋转流变仪的测量范围¹⁵。

另一种测量可注射性的定量方法是在进行注射时（手动或使用注射泵）将压力和位移传感器连接到注射器上。该设备相对便宜，但需要用户自行编写脚本并生成校准曲线，以转换为力数据¹⁶。此外，如果需要较大的力来挤出黏性或半固体材料，注射泵可能不具备足够的扭矩以精确速率推动活塞。相比之下，在手动注射时使用这些传感器可能更有意义，因为其可应用于真实的临床场景和临床操作过程中¹⁷。然而，这种方法耗时更长，且可能引入操作者偏差，因此需要更多不同操作者的重复实验才能获得可靠结果。因此，该方法可能更适用于已处于转化研究后期阶段的材料，或已在临床中使用的产品。

在本方案中，使用力学测试仪以设定速率压缩活塞，并测量实现该压缩所需的力。此类力学测试仪在材料实验室中较为常见，已被用于量化多种生物材料的可注射性^{18,19,20,21,22,23,24}。该测试适用于装载任何材料、任意尺寸和几何形状的注射器与针头。此外，对于在使用前立即制备的生物材料，可在测试前严格按照临床或手术中所用的配方制备流程进行操作。该方法的另一优势在于其相对快速；一旦力学测试仪设置完成，每小时可完成数十个样品的测试，具体数量取决于挤出速度和注射器体积。相比之下，旋转流变学测试通常每次至少需要5–10分钟，此外还需加载、平衡和清洗时间。使用力学测试仪可确保活塞上挤出速率的均匀性和可靠性，这对于高粘度制剂或具有时间依赖性特性的材料尤为有利。测试完成后，仅需极少的数据后处理即可提取用于客观比较的关键参数值。

方案

1. 样品制备

1. 准备样品并将其装入注射器中。
   1. 为模拟预装注射器，需预先制备样品，将其装入注射器，并安装针头。根据需要储存，直至进行测试。此方法适用于随时间性质不变的水凝胶及其他材料。
      注：例如，制备2%海藻酸钠溶液时，将2 g海藻酸钠溶于100 mL去离子水中，在室温下搅拌溶解。将溶液吸入5 mL注射器中，在室温下储存24小时。
   2. 或者，为模拟在临床应用前即时配制的注射剂，应按照临床实际配制方式准备样品，并留出必要的凝固时间。随后装入注射器并安装针头。此方法适用于随时间性质发生变化的骨水泥及其他材料。
      注：例如，制备硫酸钙骨水泥时，用刮刀将4 g半水硫酸钙手动加入5 mL去离子水中，混合1分钟。将注射器活塞取出，用刮刀将骨水泥装入注射器筒内。混合后4分钟开始进行力学测试。
      警告：针头存在安全风险，应尽可能使用钝头针。若材料含有细胞或其他生物成分，应格外小心以防止锐器损伤。

2. 设置机械测试仪

1. 将平面压头（用于压缩测试）安装到力学试验机上。
2. 手动为力学试验机配备量程为 200 N 的力传感器。
   注意：也可使用更大量程的力传感器，前提是其在 1 – 200 N 范围内具有足够的精度。对于黏性更高且不拟手动注射的样品，可能需要更大量程的力传感器。
3. 使用手动控制按钮将压头分开，留出足够的空间以容纳针头、注射器和推杆（约 30 cm 即可）。
4. 创建测试程序。
   1. 打开测试向导，将测试类型设置为单轴压缩。
   2. 设置预加载力，即测试开始时的测定力值，0.5 N 即可。
   3. 将到达预加载力的速度设为 5 mm/min。这是横梁向下移动直至达到预加载力的速度。
   4. 将加载模式设为位移控制，并选择合适的测试速度。对于标准 5 mL 注射器，1 mm/s 是合适的速度。
   5. 设置一个力值上限以停止测试，例如 200 N。这主要是出于安全考虑。测试也可在设定的位移值时自动停止，例如注射器的长度。

3. 设置夹紧系统

1. 将两组夹具安装到两个支架上，夹具的夹头应足够大，以牢固固定所选的注射器。
2. 将夹头置于横梁与底板之间，夹头下方需留有足够的空间容纳注射器和针头。
3. 对准两个夹头的中心，并将它们与横梁的中心对齐。
   注意：夹具夹头之间的相互对齐以及与横梁中心的对齐可能需要一定时间和多次调整才能实现，但这是获得高质量数据的重要步骤。
4. 确保夹具牢固固定，当施加向下的力时夹具不会发生移动。
5. 在底板上放置一个容器，用于收集挤出的材料。

4. 运行可注射性实验方案

1. 将注射器插入夹具夹头并闭合夹头。夹头应固定注射器位置，同时允许其上下无阻力移动。
2. 确保注射器和活塞与横梁垂直，以保证仅测量材料的单轴压缩。
   注意：应使用空注射器检查各步骤 4.1 和 4.2.
3. 使用手动移动按钮，将上板降至略高于柱塞的位置。
   注意：可能可以选择一个‘起始位置在机械测试仪的测试程序中设置“返回原位”，以使测试过程中探头自动回到初始位置，并确保各次测试位置的一致性。
4. 通过点击“归零”来校准测得的力零力’.
5. 按下“运行测试程序”运行’.
   警告：实验人员应始终在场观察每次试验，并随时准备在发生意外时启动紧急停止装置。
6. 使用手动移动按钮将板升至足够高度，以便取出注射器。
7. 对每个样本重复步骤4。
   注意：如果无需进一步分析，此时可丢弃注射器和挤出的样品，但也可保留以备后续使用 以检测滤膜加压、自我修复、对细胞的影响等。

5. 数据收集

1. 将每次试验的数据保存为可生成力与位移值表格的格式（如 .txt、.xls、.xlsx）。
2. 绘制每次试验的结果图，以位移为横轴，力为纵轴。
3. 从图中读取最大力（如果存在）和平台期力。

结果

机械测试仪和夹持系统的设置如图1A所示。本方案为每个测试样品生成力-位移数据表和曲线图。典型的力-位移曲线包含三个阶段（图1B）：初始斜率阶段，此时压头克服筒壁摩擦力并使材料开始加速；力达到最大值阶段；以及平台阶段，此时材料进入稳态挤出状态。

然而，只有当平台力低于推动柱塞所需的作用力时，才会出现明显的最大值。因此，仅在通过较宽针头的无黏性样品中才能观察到峰值。对于通过较窄孔口的黏性样品，以恒定速度注射样品所需的力大于克服筒壁摩擦力和加速材料所需的力，因此不会出现明显的峰值（图 1C）。对于高黏性样品或极细针头，挤出材料所需的力可能非常大，导致注射器发生屈曲而失效，且材料挤出量通常极少（图 1D）。如果被注射的材料含有颗粒或正在发生凝固（如水泥），则可能发生滤饼效应（液相优先被排出）或整体固化，从而导致注射不完全（图 1E）。

图1：本实验方案生成的示例曲线。（A）本实验方案所用力学测试仪的装置示意图。（B）典型的力-挤出曲线。（C）无明显最大峰值的力-挤出曲线。（D）注射器失效时的力-挤出曲线。（E）固化水泥的力-挤出曲线。该图改编自 Robinson 等人⁸。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

机械测试可能是量化可注射性的最简单且最可靠的方法。该方案的一个关键优势在于，除了在材料实验室中常见的机械测试仪外，不需要任何特殊设备。该方案具有高度通用性；只要注射器能够被夹具容纳，任何材料、针头规格和注射器尺寸均可使用。本方案已验证可适用于最大10 mL的注射器。此外，材料的制备方式可与实际应用完全一致²⁵。最后，该操作过程非常快速，每个样品仅需几分钟即可完成，每小时可处理数十个样品。

对于呈现典型曲线的样品，可提取两个数值：最大力和平台力曲线。最大力相对更客观，可通过计算从每个样品的数据表中提取。相反，平台力可能更具代表性，因为它是在最长时间内所经历的力，且作为平均值，受曲线大幅波动的影响较小。这些波动可能由材料中的气泡或颗粒在挤出过程中引起间歇性变化所致，也可能源于仪器在测量微小力时精度较低。然而值得注意的是，对于许多样品而言，并不存在最大力峰值，因此最大力值与平台力值相同。只要采用一致的数值，即可对注射力进行客观比较。

所获得的数据可用于多种用途。可通过比较注射力数值与注射难易程度，确定哪些配方、注射器和针头尺寸适用于临床转化⁸。或者，通过样品间的比较，可量化配方变化对可注射性的影响。例如，在骨水泥中，改变液相的黏度、颗粒粒径分布，或添加柠檬酸盐等添加剂以调节胶体特性，均可能显著影响其可注射性⁹。这些测试还可为骨水泥的配方操作流程提供依据，例如混合时间、载荷前时间和应用前时间，以实现最佳的注射及注射后性能。此外，该方法也可用于评估新型生物墨水用于3D打印的初步可行性。

该方案可通过多种方式进行修改。夹具系统可替换为定制的3D打印结构来固定注射器，这可能更易于确保注射器和推杆与横梁垂直，并牢固固定注射器。针头可替换为套管或任何通过推杆压缩来挤出材料的装置，其尺寸和几何形状可任意选择。为了提高实验结果的准确性，可将针头插入组织或水凝胶中，以更真实地模拟临床注射过程。然而，这会增加方案的复杂性，因为必须保持组织/凝胶的组成和针头插入深度的一致性。此外，本方案采用位移控制的挤出方式，以测量在指定速度下注射所需的力。 alternatively，也可设定注射力，测量随时间变化的挤出量。这对于具有时间依赖性特性的材料（如骨水泥）可能尤为有用。例如，通过注射力与可注射性之间的相关性来选定一个注射力⁸，本方案可用于判断在材料凝固前是否能够以该速度完成全部体积的注射。最后，本方案可轻松与其他实验结合，以测试注射对材料性能的影响，并研究诸如滤压效应、自愈现象，或注射对细胞的影响等。

本方案的主要局限在于需要使用通用力学测试仪。尽管这类设备在材料测试实验室中较为常见，但如果用户无法获取，则购置成本较高。此外，力学测试仪仅能以设定的力或位移速率进行单轴压缩，而手动注射过程中施加的力和注射速度可能存在变化。该方案也不适用于模拟某些实际的注射操作，例如在手术环境中对复杂组织的注射，或以不同角度进行的注射。在临床条件下量化注射力时，使用力与位移传感器可能是更优的方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
海藻酸钠	Sigma	A2033-100G
钝头针	Needlez	NB19G1.5	可根据应用选择任意尺寸
半水合硫酸钙	Acros Organics	22441.296
铁架台	Eisco	MTST5	需要两个
夹子	R&L Enterprises	41	需要两个，应具有平坦顶部
注射器	BD	307731	可根据应用选择任意尺寸
通用力学试验机	Zwick Roell	Z030