甲基化特异性多路复用液滴PCR，使用聚合物液滴发生器设备进行血液诊断

摘要

表观遗传标记用于白细胞（WBC）通过DNA甲基化模式的定量亚化。该协议提出了一种多路滴聚合酶链反应（mdPCR）方法，使用基于热塑性弹性体（TPE）的微流体器件进行液滴生成，从而实现WBC差分计数的精确和多路复用甲基化特异性目标定量。

摘要

介绍了多路复用液滴PCR （mdPCR） 工作流程和用于确定基于表观遗传的白血球 （WBC） 差分计数的详细协议，以及热塑性弹性体 （TPE） 微流体液滴生成装置。表观遗传标记用于WBC亚标，在不同疾病中具有重要的预后价值。这是通过量化基因组中特定CG富产区的DNA甲基化模式（CpG位） 实现的。本文将外周血单核细胞（PBMC）的二硫酮处理DNA封装在液滴中，包括与WBC亚群相关的PPC根酸基点特异性的底土剂和水解荧光探针等mdPCR试剂。多路复用方法允许对许多CpG位点进行检测，而无需单独的mdPCR反应，从而利用甲基化位点表观遗传分析，更准确地对WBC子种群进行参数测定。这种精确的定量可以扩展到不同的应用，并突出临床诊断和后续预后的好处。

引言

白血球（WBC）成分分析是血液诊断中要求最多的实验室测试之一。差异白细胞计数是一系列疾病的指标，包括感染、炎症、贫血和白血病，并且作为其他几种疾病的早期预后生物标志物正在接受调查。WBC 子类型的黄金标准涉及免疫污染和/或流式细胞学，这两种均需要昂贵且易不稳定的荧光抗体，而且往往高度依赖于操作者对样品制备的熟练程度。此外，这种方法仅适用于新鲜血液样本，因此不能冷冻样品进行装运或以后分析。

表观遗传标记最近已成为研究表型变异的有力分析工具。随后，人类白细胞群被证明具有细胞系DNA甲基化模式，允许对WBC子集进行精确表征。基于表观遗传标记的亚标提供了一个有希望的替代方案，不依赖于新鲜血液样本收集或昂贵的抗体，并可被利用为疾病发病和易感性^{,,1，2，3，4，52}的生物标志^4,物。¹³

已对白细胞亚型基因组（CpG岛）中甲基化特定CG富产区进行广泛的基因组图谱研究，以确定白细胞亚型特有的候选表观遗传标记。由于甲基化基因区域（如CD3Z和FOXP3，分别对应于CD3^+T细胞和CD4 +CD25⁺调节T细胞）的甲基化基因区域，PCR⁺协议已经开发出来。Wiencke等人已经证明了双面液滴PCR在T细胞表观遗传亚蒂的效用，结果与流动活性细胞分选（FACS）分析^{6高度相关}。这种定量基因分析方法依靠使用微流体^7、8,启用的油水中乳液，将模板核酸分子和PCR试剂分割成数千个离散的、体积定义的亚纳米光基液滴，这些液滴含有零、一个或多个目标核酸^拷贝。PCR 扩增在每个单独的液滴内进行，并测量每个液滴的端点荧光强度，从而可以绝对量化样品中存在的目标。与标准 qPCR 更精确、更准确、技术更简单的液滴 PCR 已建立，因此是 T 细胞临床评估的更有利的 DNA 甲基化方法。虽然是一种迅速出现的亚分法，但缺乏多路复用表观遗传分析，以同时探测各种甲基化CpG区域。这是常规白细胞差分计数所必需的。

本文提出了一种热塑性弹性体（TPE）液滴微流体装置，用于甲基化特异性多路复用液滴PCR（mdPCR）。该技术已用于基于细胞系DNA甲基化模式，即CD3Z^和FOXP3CpG区域的表观遗传变异，分别描述特定的⁺白细胞亚型、CD3+T细胞和CD4+CD25+T-Regs。⁺与TPE液滴生成装置的制造方法一起描述了DNA提取、双硫化转化和mdPCR的详细方案。该方法的代表性结果与免疫荧光染色结果相比，突出了该方法的效用。

方案

本研究中涉及人体样本的所有实验都经过 NRC 道德委员会的批准，并且是按照 NRC 关于遵循适用研究准则并符合加拿大魁北克州法律的人类主题的政策进行的。

1. 细胞制备

1. 立即将冷冻的低温在37°C的水浴中放置5分钟，解冻冷冻的人类外周血单核细胞（PBMC）。
2. 反转冷冻两次，轻轻重新悬浮细胞，并使用1 mL移液器将细胞悬浮液转移到15 mL锥形管中。
3. 将 10 mL 预热 （37 °C） 生长介质与 10% 胎儿牛血清 （RPMI-1640 + 10% FBS） 添加到含有 PBMC 的 15 mL 管中。
4. 在室温下以 330 x g 的速度将电池 悬浮液 在室温下离心 10 分钟，快速加速，制动高度。
5. 旋转完成后，小心地将上一点液去。通过敲击管的一侧，将细胞颗粒重新吸收在3 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.2中，含有2mM乙酰乙酸（EDTA）。
6. 通过将管子倒置，将盖子紧紧闭合，混合细胞。
7. 准备两个1.5 mL微管，并使用移液器等分液1.5 mL的细胞悬浮液在每个管，其中一个用于随后的免疫荧光染色，一个用于DNA提取。

2. 免疫荧光染色和成像方案

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结果

基于TPE的微流体液滴发生器装置是使用所述协议制造的，如图1所示。在光刻学中使用了透明面膜来获取硅 （Si） 母版。进行软光刻以获得 Si 大师的反向 PDMS 副本，该副本随后用于制造环氧模具。环氧树脂前体被倒入PDMS并固化成交联和硬化。这种模具代表 Si master 的精确复制品，对于使用热压花的热塑性塑料的后续热成型更具弹性。获得环氧树脂模具后，热塑性弹性体被浮雕。压花后，TPE 被脱皮，设备被切断。使用扁平 TPE 基板密封设备。在顶盖上打孔，两个基板粘合。最后，插入了世界到芯片连接所需的管道，设备已准备就绪。图2中显示了制造主模具、TPE材料和压花装置的样本图像。带管互连的组装装置与一对独立的可编程注射器泵一起操作，为 mdPCR 生成乳液。使用从冷冻PBMC中提取的二硫酮处理DNA进行甲基化特异性mdPCR，将CD3Z、FOXP3和C-Less基因的适当底剂和水解探针添加到PCR混合物中进行乳化。在产生适当尺寸（直径约 72 μm）的液滴后，乳液遵循热循环协议。最后，将液滴引入一个宽1毫米、高度为50μ...

讨论

所提出的实验协议和方法允许内部mdPCR使用制造的TPE液滴发生器、热循环器和荧光显微镜。使用软 TPE 到 TPE 粘结的制造设备提供在所有通道壁上均匀的疏水表面特性，因此最终设备不需要任何表面处理，以便后续用作液滴发生器。这种材料经常被用于护理点平台，需要与高吞吐量^,制造^{9、10、11、12、1310,11,129兼容}。此外，它还具有光学清晰性，在可见光谱中呈现低荧光背景，对于将来使用 mdPCR 集成完整的采样到应答工作流程来说，这是一个有吸引力的功能。PCR 试剂配方也以自制格式提供，允许简单的多路复用基因定量，同时在整个热循环协议中保持稳定性。因此，所呈现的设备和协议的优点之一是灵活定制用于特定应用的设备设计和试剂，而商业产品和专有配方很难实现。此外，它消除了昂贵的仪器执行实验的必要性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bio-Rad，安大略省密西沙加	TFI0201	PCR 管
RAN Biotechnologies，马萨诸塞州贝弗利	008-氟表面活性剂	表面活性剂
Silicon Quest International，加利福尼亚州圣克拉拉
仪器，英国		EMCCD 相机
Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆	MA5-16728
Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆	22-8425-71
CellProfiler		用于荧光图像分析
日本尼康		10 倍物镜
美国典型培养物保藏中心 （ATCC），弗吉尼亚州马纳萨斯	PCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co. （Netcong， NJ）	p/n 200-U1
费舍尔，加拿大
Vitrocom，新泽西州，美国	5015 和 5010	硼硅酸盐圆管
（http://definetherain.org.uk/）
日本滨松	LC-L1V5	DEL 紫外线光源
白云石	3200063	一次性流体管
白云石	3200302	一次性流体管
IDT，克拉尔维尔，爱荷华州
尼康，梅尔维尔，纽约		立式光学显微镜
Cytec Industries，伍德兰公园，新泽西州
EV Group，Schärding， 奥地利
Zymo Research， 尔湾， CA	D5030
Photron， 圣地亚哥， CA
IDT， 克拉尔维尔， 爱荷华州
Gersteltec， Pully， 瑞士		SU-8 光刻胶
Fineline Imaging， 科罗拉多斯普林斯， 科
Qiagen， 希尔登， 德国
图像 J		用于评估液滴直径
无病症，蒙特利尔，魁北克
Excelitas，MA，美国		谱 LED 荧光灯
Galenvs Sciences Inc.，蒙特利尔，QC	DE1010
Hexpol TPE 和 Aring;mål， 瑞典		热塑性弹性体 （TPE）
Thermo Fisher Scientific， Waltham， MA	13-400-518
Nikon， Japan		用于图像采集
3M， St Paul， MN		载体油
Thermo Fisher Scientific， Waltham， MA	R37605	蓝色荧光活细胞染色剂 （DAPI）
IDEX 健康 &科学，奥克港，华盛顿	P-881	PEEK 配件
Sigma-Aldrich，奥克维尔，安大	略806552
道康宁，米德兰，密歇根
Thinky美国，加利福尼亚州，美国	ARV 310
Ihc 世界，马里兰州，美国	IW-125-0
Zinsser NA，北岭，加利福尼亚州	2607808
Cetoni GmbH， 科尔布森， 德国
Sigma-Aldrich， 奥克维尔， 安大略省	484431
Bio-Rad， 密西沙加， 安大略省	1861096
立高科技， 米西沙加， 安大
尼康， 梅尔维尔， 纽约		显微镜
尼康， 日本
乐泰	AA 352