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方法文章

使用聚合物微滴生成装置进行甲基化特异性多重微滴PCR用于血液学诊断

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DOI：

10.3791/61421

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2020年6月29日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Life Sciences Division, National Research Council of Canada, 2Galenvs Sciences, Inc.

本文内容

摘要

通过定量DNA甲基化模式，表观遗传标记可用于白细胞（WBC）亚型分型。本方案介绍了一种基于热塑性弹性体（TPE）微流控装置的多重液滴聚合酶链式反应（mdPCR）方法，用于生成液滴，从而实现对白细胞分类计数中甲基化特异性靶标的精确定量和多重检测。

摘要

本文介绍了一种用于确定基于表观遗传学的白细胞（WBC）分类计数的多重液滴PCR（mdPCR）工作流程及详细实验方案，并描述了一种基于热塑性弹性体（TPE）的微流控液滴生成装置。利用表观遗传标记对WBC 进行亚型分型，该方法在多种疾病的预后评估中具有重要价值。该技术通过定量分析基因组中特定富含CG区域（CpG位点）的DNA甲基化模式来实现。在本研究中，将外周血单个核细胞（PBMCs）经亚硫酸氢盐处理后的DNA与mdPCR试剂共同包裹于液滴中，试剂包含针对与WBC亚群相关的CpG位点的特异性引物和水解型荧光探针。该多重检测方法可在单次反应中同时分析多个CpG位点，无需进行多个独立的mdPCR反应，从而通过甲基化位点的表观遗传分析更准确地实现对WBC亚群的参数化定量。这种精确的定量方法可拓展应用于多种场景，凸显了其在临床诊断及后续预后判断中的优势。

引言

白细胞（WBC）分类分析是血液学诊断中最常进行的实验室检测项目之一。白细胞分类计数可作为多种疾病（包括感染、炎症、贫血和白血病）的指标，并正在被研究作为其他多种疾病的早期预后生物标志物。白细胞亚型分析的金标准包括免疫染色和/或流式细胞术，这两种方法均需要使用昂贵且稳定性差的荧光标记抗体，且通常高度依赖操作人员在样本制备方面的熟练程度。此外，该方法仅适用于新鲜血液样本，样本无法冷冻保存以用于运输或后续分析。

表观遗传标记最近已成为研究表型变异的有力分析工具。随后的研究表明，人类白细胞群体具有细胞谱系特异性的DNA甲基化模式，可用于精确鉴定白细胞亚群。基于表观遗传标记的分型提供了一种有前景的替代方法，该方法不依赖新鲜血液样本的采集或昂贵的抗体，且可作为疾病发生和易感性的生物标志物1,2,3,4,5。

已开展全基因组范围的研究，以广泛绘制白细胞亚型基因组中甲基化的富含CG的特定区域（CpG岛），从而鉴定出针对白细胞亚型的候选表观遗传标记。基于此目的，已开发出针对甲基化基因区域（如对应于CD3+ T细胞和CD4+ CD25+调节性T细胞（T-Regs）的CD3Z和FOXP3基因区域）的PCR方案。Wiencke等人已证明双重液滴PCR在T细胞表观遗传分型中的实用性，其结果与流式激活细胞分选（FACS）分析具有高度相关性6。这种定量遗传分析方法依赖于将模板核酸分子和PCR试剂分配至数千个离散的、体积确定的亚纳升级液滴中，每个液滴含有零个、一个或多个目标核酸拷贝，该过程通过微流控技术实现的水包油乳液完成7,8。PCR扩增在各个独立液滴中进行，并测量每个液滴的终点荧光强度，从而实现对样本中目标分子的绝对定量。研究表明，与标准qPCR相比，液滴PCR具有更高的精确性、准确性以及更简便的技术操作，使其成为T细胞临床评估中更具优势的基于DNA甲基化的检测方法。尽管多靶标分型技术正在迅速发展，但目前仍缺乏可同时检测多个甲基化CpG区域的多重表观遗传分析方法，而此类方法对于常规白细胞分类计数至关重要。

本文介绍并应用了一种热塑性弹性体（TPE）液滴微流控装置，用于甲基化特异性的多重液滴PCR（mdPCR）。该技术已用于根据细胞谱系DNA甲基化模式，即CD3Z和FOXP3 CpG区域的表观遗传变异，区分特定的白细胞亚型——CD3+ T细胞和CD4+ CD25+ T调节细胞（T-Regs）。文中详细描述了DNA提取、亚硫酸氢盐转化和mdPCR的操作流程，并结合介绍了TPE液滴生成装置的制备方法。同时，将该方法的代表性结果与免疫荧光染色结果进行了比较，突显了所提出方法的应用价值。

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方案

本研究中涉及人类样本的所有实验均获得加拿大国家研究委员会（NRC）伦理委员会的批准，并依据NRC关于人类受试者的研究政策进行，遵循适用的研究指南，并符合加拿大魁北克省的法律法规。

1. 细胞准备

  1. 将冻存的人外周血单个核细胞（PBMCs）迅速放入37 °C水浴中解冻5分钟。
  2. 轻轻倒置冻存管两次以重悬细胞，用1 mL移液器将细胞悬液转移至15 mL离心管中。
  3. 向含有PBMCs的15 mL离心管中加入10 mL预热至37 °C、添加10%胎牛血清的培养基（RPMI-1640 + 10% FBS）。
  4. 在室温下，将细胞悬液放入摆动桶离心机中，以330 × g 的速度离心10分钟，加速度设为快速，刹车设为高。
  5. 离心结束后，小心倾去上清液。通过轻敲管壁，用3 mL含2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的磷酸盐缓冲液（PBS）pH 7.2重悬细胞沉淀。
  6. 盖紧管盖，倒置混匀细胞。
  7. 准备两支1.5 mL微量离心管，用移液器将1.5 mL细胞悬液分装至每管中，其中一管用于后续免疫荧光染色，另一管用于DNA提取。

2. 免疫荧光染色与成像方案

  1. 将步骤 1.7 中的细胞重悬于 200 μL 含 0.1% 叠氮化钠和 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 缓冲液中，并将细胞悬液的最终浓度调整至不超过 2 × 107 个细胞/mL。
  2. 用移液器将 100 μL 细胞悬液分装至两个独立的 1.5 mL 微量离心管中。
  3. 分别向其中一管加入 20 μL 与异硫氰酸荧光素（FITC）和藻红蛋白（PE）偶联的抗人 CD3/CD4 抗体，向另一管加入与 FITC 和 PE 偶联的抗人 CD4/CD25 抗体（参见 材料表）。
  4. 向每管中各加入 1 滴蓝色荧光活细胞染料（参见 材料表）。
  5. 在室温下使用管式旋转仪避光孵育 2 小时。
  6. 在室温下以 330 × g 离心 10 分钟，加速度设为快速，刹车设为高。
  7. 倒去上清液，轻轻敲击离心管使细胞沉淀重悬。加入 1 mL 含 2 mM EDTA、pH 7.2 的 PBS 缓冲液。确保管盖紧闭后，上下颠倒混匀 2 次。
  8. 重复步骤 2.6 和 2.7 共三次。
  9. 将细胞沉淀重悬于 20 μL 含 2 mM EDTA、pH 7.2 的 PBS 缓冲液中。
  10. 取 10 μL 细胞悬液滴加至硼硅酸盐显微镜载玻片上，静置 2 分钟，使细胞缓慢沉降至液滴底部。
  11. 小心地将盖玻片覆盖在显微镜载玻片上，并将载玻片置于倒置显微镜的载物台上。
  12. 使用 10 倍物镜和连接显微镜的 EMCCD 相机，对两个细胞悬液样本的每种荧光染料分别采集细胞图像。
  13. 人工计数荧光标记的细胞（原始数据参见 补充信息）。
  14. 计算抗人 CD3 和抗人 CD4/CD25 标记细胞与 DAPI 染色细胞的比值，以获得 CD3+ T 细胞和 CD4+ CD25+ 调节性 T 细胞占总白细胞的比例。

3. DNA 提取与亚硫酸氢盐转化

  1. DNA 提取
    注意：使用磁性 DNA 纯化试剂盒（参见 材料表）按照制造商提供的操作步骤，从第 1 节制备的 PBMC 中提取 DNA。
    1. 在 1.5 mL 离心管中，将细胞重悬于 100 µL PBS 中，加入 20 µL 蛋白酶 K 和 400 µL 裂解/结合缓冲液。上下吹打 10 次混匀，室温孵育 5 分钟。
    2. 将离心管置于磁力架上 1–2 分钟，捕获 DNA-磁珠复合物，小心移除并弃去上清液。
    3. 从磁力架上取下含有 DNA-磁珠复合物的离心管，加入 600 µL 洗涤缓冲液 #1 重悬磁珠，以去除非特异性结合物质。
    4. 再次将离心管置于磁力架上，小心移除并弃去上清液。
    5. 使用 600 µL 洗涤缓冲液 #2 重复步骤 3.1.3 和 3.1.4。
    6. 将离心管敞口放置，空气干燥 1 分钟。
    7. 从磁力架上取下离心管，加入 100 µL 洗脱缓冲液，上下吹打 20 次以洗脱 DNA。
    8. 将含有洗脱 DNA 的离心管再次置于磁力架上，孵育 1–2 分钟，使磁珠与洗脱的 DNA 分离。
    9. 将洗脱的纯化 DNA 溶液转移至新的洁净离心管中。
    10. 使用分光光度计测定 260 nm 处的吸光度，评估纯化 DNA 样品的浓度。
  2. 亚硫酸氢盐转化
    注意：使用甲基化检测试剂盒（参见 材料表）按照制造商提供的操作步骤，对纯化 DNA 进行亚硫酸氢盐转化。
    1. 在 PCR 管中，向 20 µL DNA 样品（200–500 ng）加入 130 µL 转化试剂，充分混匀后短暂离心。
    2. 将 PCR 管转移至热循环仪中，执行以下循环程序：98 °C 8 分钟；54 °C 60 分钟；然后保持在 4 °C。
    3. 在置于收集管中的离子色谱柱（IC 柱）内加入 600 µL 结合缓冲液。
    4. 将 DNA 样品加入含有结合缓冲液的 IC 柱中，通过反复倒置混匀。全速离心 30 秒，弃去流出液。
    5. 向柱中加入 100 µL 洗涤缓冲液，按步骤 3.2.4 所述条件离心，弃去流出液。
    6. 向柱中加入 200 µL 脱磺酸化缓冲液，室温孵育 15–20 分钟。按上述步骤离心并弃去流出液。
    7. 向柱中加入 200 µL 洗涤缓冲液，全速离心 30 秒，弃去流出液。
    8. 重复步骤 3.2.7。
    9. 将柱转移至新的 1.5 mL 收集管，向柱膜上加入 100 µL PCR 级水，全速离心 1 分钟以洗脱 DNA。
    10. 使用分光光度计测定 260 nm 处的吸光度，评估亚硫酸氢盐转化后 DNA 样品的浓度。
      注意：当 260 nm 处吸光度为 1.0 时，按 40 µg/mL 计算浓度。
    11. DNA 可在 -20 °C 下短期保存，或在 -70 °C 下长期保存。

4. 液滴生成装置的制备

注意：用于液滴生成的微流控装置（CAD 文件见补充信息）在洁净室（1,000 级）环境中，采用热压印技术，以热塑性弹性体（见材料表）加工制成，其制备流程如下。

  1. SU-8 模具制备
    1. 按照下述步骤，采用标准光刻工艺在 6″ 硅片上制备 SU-8 模具。
    2. 使用 500 W 氧等离子体对 6″ 硅片清洗 10 秒。
    3. 以 900 rpm 转速在硅片上旋涂 SU-8 光刻胶 40 秒，获得总膜厚为 100 µm 的涂层。
    4. 将硅片置于热板上，先在 65 °C 预烘 15 分钟，随后在 95 °C 烘烤 2 小时。
    5. 使用曝光剂量为 1,000 mJ/cm2 的 365 nm 紫外光（Hg i 线）透过高清透明光掩膜进行曝光。
    6. 将硅片置于热板上，先在 65 °C 后烘 15 分钟，随后在 95 °C 烘烤 40 分钟。
    7. 将硅片浸入丙二醇单甲醚乙酸酯（PGMEA）中显影 5 分钟。
    8. 用 PGMEA 和异丙醇冲洗，并用氮气流吹干。
    9. 将硅片置于热板上，在 135 °C 下硬烘 2 小时。
    10. 在真空干燥器中，将一滴硅烷化试剂（三氯全氟辛基硅烷）滴于相邻的玻璃载玻片上，将硅片置于其中进行硅烷化处理 2 小时。
      注：此步骤旨在使硅烷在 SU-8 母模表面形成单分子层。三氯全氟辛基硅烷必须始终在通风橱中操作，并远离水源。
  2. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制
    1. 在塑料杯中按 10:1 质量比（弹性体基料：固化剂）混合 PDMS 液态预聚物（见材料表）。
    2. 将杯子放入行星式离心真空混合器中，对 PDMS 混合物进行混合与脱气。
    3. 将 PDMS 混合物浇注至置于定制金属夹具中的模具上，以防止树脂泄漏，并在 65 °C 下固化 2 小时。
    4. 使用镊子小心地将 PDMS 模具从 SU-8 母模上剥离。
  3. 环氧树脂模具
    注：使用 PDMS 作为中间复制层，从 SU-8/硅母模制备环氧树脂模具。
    1. 按 100/83 质量比（树脂/固化剂）配制环氧树脂（见材料表）。
    2. 在减压条件下，使用真空干燥箱对混合物脱气 30 分钟。
    3. 将树脂浇注至 PDMS 复制品上，并在 80 °C 下固化 12 小时。
    4. 将固化的环氧模具从 PDMS 复制品上取下，置于热板上，在 120 °C 下硬烘 2 小时。
  4. TPE 器件
    1. 在 165 °C 下挤出 TPE 颗粒（见材料表），制成厚度为 2.0 mm、宽度为 7″、长度数米的片材，并卷绕储存以备后续使用。
    2. 使用剪刀从卷材上裁剪出一块 7″ 见方的 TPE 片材。
    3. 将 TPE 片材置于环氧模具与一片未图案化的硅烷化硅片之间（硅片硅烷化步骤见 4.1.10）。
    4. 在 125 °C 温度、10 kN 施加力、10–2 mbar 压力下热压 10 分钟。
    5. 在室温下小心脱模，使用甲醇喷雾使压印后的 TPE 与硅片及环氧模具分离。
    6. 裁剪另一块 7″ 见方的 TPE 片材，并将其置于两片未图案化的硅烷化硅片之间。
    7. 在 140 °C 温度、10 kN 施加力、10–2 mbar 压力下热压 10 分钟，形成用于封闭通道和密封器件的平面表面。
    8. 在室温下小心脱模，使用甲醇喷雾使压印后的 TPE 与两片硅片分离。
    9. 使用刮刀将每块压印后的 TPE 片材裁切成器件尺寸。
    10. 使用带推杆的 1 mm 活检穿孔针在结构化器件上打出入/出口通道的通孔。
    11. 在室温下将一块平面 TPE 器件直接贴合于通道上，以封闭通道。
    12. 可选：将器件置于 70 °C 烘箱中 2 小时，以促进器件键合。
    13. 在通孔中安装一次性流体管路（内径 0.25 mm，外径 0.8 mm），并使用环氧胶密封接头，确保无泄漏操作。

5. 微滴生成与 PCR

注意：表1列出了C-LESS、CD3Z和Foxp3基因的正向与反向引物以及双淬灭水解探针的相关信息，这些是多重扩增去甲基化基因靶标所必需的。

  1. 按照所述方法制备混合液 表2.
  2. 除酶混合液外，将主混合液的所有组分解冻。使用移液器反复吹打混匀主混合液，并短暂离心。
  3. 加入适当体积的（1 μL将亚硫酸氢盐转化的DNA（来自第3.2节）加入PCR管中的主混合液中。用移液器吹打混匀反应液，然后短暂离心。
  4. 将一次性流体管路（内径 0.25 mm，外径 1.6 mm）连接至两个精密玻璃注射器250 μL 体积）使用PEEK接头。
  5. 用一支精密玻璃注射器预装 250 μL 含5%氟化表面活性剂的载油
  6. 用另一支精密玻璃注射器预装 50 µL 在加样前加入适量的载油 100 µL 确保在乳化过程中完全分配PCR混合液的全部样品体积。
  7. 在配备高速相机的直立式光学显微镜载物台上安装液滴微流控装置，以实时观察和记录液滴的形成过程。
  8. 将预装填的注射器置于可编程注射泵上，并使用带接头的 PEEK 连接管（参见 材料表），将注射器的管路连接至微流控液滴装置相应入口通道的管路上。
  9. 将液滴发生器出口端的管路置于一个0.5 mL PCR管内。
  10. 调节注射泵的流速至 2 µL/min 并在收集所得乳液前，使液滴尺寸达到稳定。
  11. 收集乳液并转移 75 μL 加入0.2 mL PCR管中进行热循环。
  12. 确保PCR管中的油相含量与分散相体积相近，以防止在热循环过程中液滴发生聚并。
  13. 将0.2 mL PCR管放入热循环仪中，并按以下程序进行扩增循环：预热温度为 95 °C 5分钟，然后进行45个循环的变性步骤，变性温度为 95 °C 15 秒，退火/延伸在 60 °C 30秒。
  14. 使用剩余的乳剂填充一支硼硅酸盐毛细管（100 μm 深度）并采用矩形轮廓成像液滴，以评估液滴直径。
  15. 将装有乳液的硼硅酸盐管置于显微镜载玻片上。使用配备 EMCCD 相机和 10 倍物镜的倒置显微镜记录液滴的明场图像。
  16. 使用图像分析软件测量液滴直径，具体步骤如下。
  17. 通过选择“设定已知距离的比例尺”，将图像中像素数量对应的已知距离以微米（μm）为单位进行标定。分析“按钮，然后“设定比例尺’.
  18. 通过选择“将图像转换为灰度”图像’ 按钮，然后 ‘类型。必要时调整亮度和对比度。通过选择“手动设定阈值”来划定并填充圆形区域图像“按钮，然后“调整阈值’.
  19. 通过选择“分析颗粒”来分析颗粒分析颗粒“按钮，并将圆度设为 0.75 – 1。
  20. 获取软件中自动显示的所测液滴的面积和直径。
  21. 计算液滴的平均直径，并假设液滴为球形，估算分相体积，该体积将用于计算目标物的绝对浓度。
  22. 通过分析变异系数（CV）来确保液滴的单分散性，CV定义为标准差与平均值之比k = 1），用于液滴直径（< 3%).

6. 荧光成像与图像分析

  1. 荧光成像
    1. 扩增完成后，将PCR乳液转移至具有矩形截面的硼硅酸盐毛细管（50 μm 深度）中，以使液滴排列成紧密堆积的单层结构，便于成像。
    2. 将填充好的毛细管固定在显微镜载玻片上，并使用紫外丙烯酸胶粘剂密封两端。使用紫外光源照射胶粘剂进行固化，注意避免紫外光照射乳液，以防样品发生荧光淬灭。
    3. 将载玻片装载到配备EMCCD相机和10倍物镜的倒置显微镜上。
    4. 使用显微镜成像软件，选择采集 | 实时-快速以启动实时相机采集，观察样品，并确保捕获到毛细管的完整宽度。
    5. 将透射光灯设置为透射照明模式，电压为3.5 V。
    6. 将宽谱LED荧光灯设置为落射照明模式，强度为20%。
    7. 通过成像软件中的校准 | 光学配置命令，手动调整所有波长（明场、FAM、HEX 和 Cy5）的采集设置。对于每种荧光染料，需手动切换相应的荧光滤光片组。明场成像时也必须使用对应的滤光片组，以保持相同的光路。
    8. 在图像采集前，通过采集 | 相机设置命令手动调整每种荧光染料的曝光时间，具体参数见表3。在软件的“采集设置”菜单中，将读出模式设为EM增益17 MHz、16位，增益倍数设为100。
    9. 在软件的LUT窗口中，设置LUT比例范围，使透射信号落在设定范围内。本实验中，该范围大约设置为500至12,000。
    10. 使用多点采集程序自动完成采集，依次启用XY扫描和多波长采集选项。确保载物台移动至初始位置后，依次采集所有不同波长的图像，再移至下一个位置。
    11. 首先，在软件的XY扫描菜单中自定义XY扫描轮廓以设置XY扫描。在“自定义多点定义”中，选择大图像定义框，并将其设置为约40.0 × 1.0 mm（接近乳液填充长度），重叠率为1%。
    12. 启用“使用聚焦面”选项，并通过显微镜的聚焦旋钮调节样品不同位置的焦平面，从而建立聚焦面曲线。
    13. 其次，通过选择扫描标签页设置多波长扫描，添加步骤6.1.7中为各波长创建的光学配置。
    14. 点击选项以在载物台移动和滤光片切换期间关闭活动快门，防止样品发生荧光淬灭，然后点击“开始运行”按钮启动采集。将每次采集的帧导出为tiff文件，并使用“拆分为多个文件”选项结合已保存的LUT设置，将各通道分离为独立文件。使用点名称和通道名称选项，以便于区分每个图像文件。
  2. 图像分析
    1. 将所有采集的图像按明场和荧光滤光片分类整理，以便上传至开源图像分析软件。
    2. 使用图像分析软件建立分析流程，首先利用明场图像识别所有液滴，然后测量对应荧光液滴的强度。
    3. 在流程中上传明场和荧光tiff图像，添加模块“ColorToGray”、“IdentifyPrimaryObjects”、“MeasureObjectIntensity”和“ExportToSpreadsheet”。使用明场液滴图像识别目标对象，并将这些对象作为掩模用于测量荧光图像的强度。
    4. 运行所选tiff图像的分析流程，提取荧光液滴图像的平均荧光强度。实验需进行三次重复，每组包含约5,000个液滴用于分析。
    5. 应用“definetherain”算法（http://definetherain.org.uk/）识别阳性和阴性液滴簇。阳性液滴应位于均值3个标准差范围内。该步骤用于确定阳性液滴计数所用的阈值强度。
    6. 再次使用图像分析软件建立新的分析流程，为每个基因靶标设定上一步确定的荧光强度阈值。
    7. 将明场和荧光图像上传至流程中，添加模块“ColorToGray”、“RescaleIntensity”、“Threshold”、“IdentifyPrimaryObjects”、“MeasureObjectSizeShape”、“FilterObjects”和“ExportToSpreadsheet”。为明场图像和每种荧光滤光片的液滴分别创建独立的模块。
    8. 将每组荧光图像的强度范围重缩放为0至1，然后设定阈值以识别并计数高于设定阈值的对象。如有必要，添加“ExpandOrShrinkObjects”模块以缩小对象，便于在明场图像中识别和计数液滴。
    9. 仅识别大小在20–30像素范围内的对象，并对计数对象进行筛选，仅保留特定直径（即直径约75 µm）且圆形偏心率在0.5及以下的对象。
    10. 将结果导出为表格，列出明场图像中的总液滴数，以及所有使用的荧光通道的液滴计数；即Cy5对应C-LESS基因，HEX对应甲基化的CD3Z基因，FAM对应甲基化的FOXP3基因（参见补充信息中本mdPCR检测所获得的原始实验数据）。
    11. 计算每个基因靶标的阴性液滴比例，并应用泊松分布，利用公式1计算每个液滴的拷贝数（CPD）：
      泊松分布公式图示，P(X=x)=λˣe⁻ˡ/x!，用于统计分析。
      其中x表示含有0、1、2或更多分子的液滴数量，λ表示CPD值。
    12. 通过将步骤5.20中获得的CPD值与液滴体积的比值代入公式2，计算绝对靶标浓度：
      泊松分布公式 λ=CPD=-ln(1-p)，用于统计分析图示。
      其中(1-p)表示阴性液滴的比例。
    13. 通过将甲基化CD3Z基因和FOXP3基因的CPD值分别除以C-LESS基因（即总细胞）的CPD值，计算CD3+ T细胞和CD4+ CD25+ T调节细胞（T-Regs）的百分比（参见补充信息中由原始数据计算CPD的详细过程）。
    14. 将这些百分比数值与使用CD3+ T细胞和CD4+ CD25+ T-Reg特异性抗体进行免疫荧光成像所获得的结果进行比较。

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结果

基于TPE的微流控液滴生成装置按照所述方案制备，如图1所示。在光刻过程中使用透明掩模以获得硅（Si）母模。通过软光刻技术制备Si母模的PDMS反向复制品，随后用于制备环氧树脂模具。将环氧前体倒入PDMS模具中并固化，使其交联并硬化。该模具与Si母模完全一致，具有更高的机械稳定性，适用于后续通过热压法对热塑性塑料进行热成型。获得环氧模具后，对热塑性弹性体进行压印。压印完成后，将TPE脱模并切割成器件。使用平整的TPE基底对器件进行密封。在顶盖上打孔，并将两个基底键合。最后，插入必要的管路以实现芯片与外部系统的连接，装置即可投入使用。所制备的母模、TPE材料及压印后器件的样品图像如图2所示。组装好的带管路连接的装置由一对独立可编程的注射泵驱动，用于生成适用于mdPCR的乳液。采用经亚硫酸氢盐处理的、从冷冻PBMCs中提取的DNA进行甲基化特异性mdPCR。将针对CD3Z、FOXP3和C-Less基因的特异性引物和水解探针加入PCR反应体系中用于乳化。在生成合适尺寸的液滴（直径约72 μm）后，将乳液进行热循环处理。最后，将...

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讨论

本文介绍的实验方案和方法可在实验室内部使用自制的TPE液滴发生器、热循环仪和荧光显微镜进行微滴式PCR（mdPCR）。通过软质TPE与TPE之间的键合所制备的装置具有均匀分布于所有通道壁的疏水表面特性，因此最终装置在后续用作液滴发生器时无需任何表面处理。该材料已常规应用于需要与高通量制造兼容的即时检测平台9,10,11,12,13。此外，该材料具有良好的光学透明性，并在可见光谱范围内表现出低荧光背景，这一特性有利于未来将mdPCR整合为完整的“样本进-结果出”工作流程。本文还以自配形式提供了PCR试剂配方，便于实现多重基因的定量检测，同时在整个热循环过程中保持试剂稳定性。因此，本研究所提出装置与方案的优势之一在于可根据特定应用灵活定制装置设计和所用试剂，而这一点在商业产品和专有配方中难以实现。此外，该方法还消除了实...

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披露

不存在任何利益冲突需要声明。

致谢

作者感谢加拿大国家研究委员会提供的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Bio-Rad，密西沙加，安大略省TFI0201PCR管
RAN Biotechnologies，贝弗利，马萨诸塞州008-FluoroSurfactant氟化表面活性剂
Silicon Quest International，加利福尼亚州圣克拉拉
英国牛津，Oxford Instruments公司EMCCD相机
赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆MA5-16728
Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆22-8425-71
CellProfiler用于荧光图像分析
日本尼康10倍物镜
美国典型培养物保藏中心（ATCC），弗吉尼亚州马纳萨斯PCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co.（美国新泽西州内特康）p/n 200-U1
费舍尔，加拿大
美国新泽西州Vitrocom公司5015 和 5010硼硅酸盐毛细管
http://definetherain.org.uk/
日本滨松LC-L1V5DEL 紫外光源
Dolomite3200063一次性流体管路
多孔石3200302一次性流体管路
IDT，爱荷华州科拉尔维尔
尼康，纽约州梅尔维尔直立式光学显微镜
Cytec Industries，伍德兰帕克，新泽西州
EV Group, Schä奥地利格拉茨
Zymo Research，加利福尼亚州尔湾市D5030
Photron，美国加利福尼亚州圣地亚哥
IDT，爱荷华州科拉尔维尔
Gersteltec，普利，瑞士SU-8 光刻胶
Fineline Imaging，科罗拉多斯普林斯，科罗拉多州
Qiagen，德国希尔登203603
Image J用于评估液滴直径
Anachemia，蒙特利尔，魁北克省
Excelitas，马萨诸塞州，美国宽谱LED荧光灯
Galenvs Sciences Inc.，蒙特利尔，魁北克省DE1010
Hexpol TPE Åmå瑞典热塑性弹性体（TPE）
Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆13-400-518
日本尼康用于图像采集
3M，明尼苏达州圣保罗载体油
赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆R37605蓝色荧光活细胞染料（DAPI）
IDEX Health & 科学，奥克港，华盛顿州P-881PEEK接头
Sigma-Aldrich，奥克维尔，安大略省806552
道康宁，米德兰，密歇根州
ThinkyUSA，加利福尼亚州，美国ARV 310
美国马里兰州Ihc世界IW-125-0
Zinsser NA, Northridge CA2607808
Cetoni GmbH，科堡森，德国
Sigma-Aldrich，奥克维尔，安大略省484431
Bio-Rad，密西沙加，安大略省1861096
日立高新技术公司，密西沙加，安大略省
尼康，纽约州梅尔维尔倒置显微镜
日本尼康
LoctiteAA 352

参考文献

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  2. Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
  3. Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance. Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).
  4. Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. Epigenetics and the adaptive immune response. Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).
  5. Zouali, M. The Autoimmune Diseases. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
  6. Wiencke, J. K., et al. A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood. Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).
  7. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  8. Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
  9. Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices. Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).
  10. Roy, E., et al. From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).
  11. Malic, L., et al. Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR. Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).
  12. Malic, L., et al. Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes. Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).
  13. Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing. Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).

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