使用聚合物微滴生成装置进行甲基化特异性多重微滴PCR用于血液学诊断

摘要

通过定量DNA甲基化模式，表观遗传标记可用于白细胞（WBC）亚型分型。本方案介绍了一种基于热塑性弹性体（TPE）微流控装置的多重液滴聚合酶链式反应（mdPCR）方法，用于生成液滴，从而实现对白细胞分类计数中甲基化特异性靶标的精确定量和多重检测。

摘要

本文介绍了一种用于确定基于表观遗传学的白细胞（WBC）分类计数的多重液滴PCR（mdPCR）工作流程及详细实验方案，并描述了一种基于热塑性弹性体（TPE）的微流控液滴生成装置。利用表观遗传标记对WBC 进行亚型分型，该方法在多种疾病的预后评估中具有重要价值。该技术通过定量分析基因组中特定富含CG区域（CpG位点）的DNA甲基化模式来实现。在本研究中，将外周血单个核细胞（PBMCs）经亚硫酸氢盐处理后的DNA与mdPCR试剂共同包裹于液滴中，试剂包含针对与WBC亚群相关的CpG位点的特异性引物和水解型荧光探针。该多重检测方法可在单次反应中同时分析多个CpG位点，无需进行多个独立的mdPCR反应，从而通过甲基化位点的表观遗传分析更准确地实现对WBC亚群的参数化定量。这种精确的定量方法可拓展应用于多种场景，凸显了其在临床诊断及后续预后判断中的优势。

引言

白细胞（WBC）分类分析是血液学诊断中最常进行的实验室检测项目之一。白细胞分类计数可作为多种疾病（包括感染、炎症、贫血和白血病）的指标，并正在被研究作为其他多种疾病的早期预后生物标志物。白细胞亚型分析的金标准包括免疫染色和/或流式细胞术，这两种方法均需要使用昂贵且稳定性差的荧光标记抗体，且通常高度依赖操作人员在样本制备方面的熟练程度。此外，该方法仅适用于新鲜血液样本，样本无法冷冻保存以用于运输或后续分析。

表观遗传标记最近已成为研究表型变异的有力分析工具。随后的研究表明，人类白细胞群体具有细胞谱系特异性的DNA甲基化模式，可用于精确鉴定白细胞亚群。基于表观遗传标记的分型提供了一种有前景的替代方法，该方法不依赖新鲜血液样本的采集或昂贵的抗体，且可作为疾病发生和易感性的生物标志物^1,2,3,4,5。

已开展全基因组范围的研究，以广泛绘制白细胞亚型基因组中甲基化的富含CG的特定区域（CpG岛），从而鉴定出针对白细胞亚型的候选表观遗传标记。基于此目的，已开发出针对甲基化基因区域（如对应于CD3^+<....

方案

本研究中涉及人类样本的所有实验均获得加拿大国家研究委员会（NRC）伦理委员会的批准，并依据NRC关于人类受试者的研究政策进行，遵循适用的研究指南，并符合加拿大魁北克省的法律法规。

1. 细胞准备

1. 将冻存的人外周血单个核细胞（PBMCs）迅速放入37 °C水浴中解冻5分钟。
2. 轻轻倒置冻存管两次以重悬细胞，用1 mL移液器将细胞悬液转移至15 mL离心管中。
3. 向含有PBMCs的15 mL离心管中加入10 mL预热至37 °C、添加10%胎牛血清的培养基（RPMI-1640 + 10% FBS）。
4. 在室温下，将细胞悬液放入摆动桶离心机中，以330 × g 的速度离心10分钟，加速度设为快速，刹车设为高。
5. 离心结束后，小心倾去上清液。通过轻敲管壁，用3 mL含2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的磷酸盐缓冲液（PBS）pH 7.2重悬细胞沉淀。
6. 盖紧管盖，倒置混匀细胞。
7. 准备两支1.5 mL微量离心管，用移液器将1.5 mL细胞悬液分装至每管中，其中一管用于后续免疫荧光染色，另一管用于DNA提取。

2. 免疫荧光染色与成像方案

1. 将步骤 1.7 中的细胞重悬于 200 μL 含 0.1% 叠氮化钠和 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 缓....

结果

基于TPE的微流控液滴生成装置按照所述方案制备，如图1所示。在光刻过程中使用透明掩模以获得硅（Si）母模。通过软光刻技术制备Si母模的PDMS反向复制品，随后用于制备环氧树脂模具。将环氧前体倒入PDMS模具中并固化，使其交联并硬化。该模具与Si母模完全一致，具有更高的机械稳定性，适用于后续通过热压法对热塑性塑料进行热成型。获得环氧模具后，对热塑性弹性体进行压印。压印完成后，将TPE脱模并切割成器件。使用平整的TPE基底对器件进行密封。在顶盖上打孔，并将两个基底键合。最后，插入必要的管路以实现芯片与外部系统的连接，装置即可投入使用。所制备的母模、TPE材料及压印后器件的样品图像如图2所示。组装好的带管路连接的装置由一对独立可编程的注射泵驱动，用于生成适用于mdPCR的乳液。采用经亚硫酸氢盐处理的、从冷冻PBMCs中提取的DNA进行甲基化特异性mdPCR。将针对CD3Z、FOXP3和C-Less基因的特异性引物和水解探针加入PCR反应体系中用于乳化。在生成合适尺寸的液滴（直径约72 μm）后，将乳液进行热循环处理。最后，将.......

讨论

本文介绍的实验方案和方法可在实验室内部使用自制的TPE液滴发生器、热循环仪和荧光显微镜进行微滴式PCR（mdPCR）。通过软质TPE与TPE之间的键合所制备的装置具有均匀分布于所有通道壁的疏水表面特性，因此最终装置在后续用作液滴发生器时无需任何表面处理。该材料已常规应用于需要与高通量制造兼容的即时检测平台^{9,10,11,12,13}。此外，该材料具有良好的光学透明性，并在可见光谱范围内表现出低荧光背景，这一特性有利于未来将mdPCR整合为完整的“样本进-结果出”工作流程。本文还以自配形式提供了PCR试剂配方，便于实现多重基因的定量检测，同时在整个热循环过程中保持试剂稳定性。因此，本研究所提出装置与方案的优势之一在于可根据特定应用灵活定制装置设计和所用试剂，而这一点在商业产品和专有配方中难以实现。此外，该方法还消除了实.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bio-Rad，密西沙加，安大略省	TFI0201	PCR管
RAN Biotechnologies，贝弗利，马萨诸塞州	008-FluoroSurfactant	氟化表面活性剂
Silicon Quest International，加利福尼亚州圣克拉拉
英国牛津，Oxford Instruments公司		EMCCD相机
赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆	MA5-16728
Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	22-8425-71
CellProfiler		用于荧光图像分析
日本尼康		10倍物镜
美国典型培养物保藏中心（ATCC），弗吉尼亚州马纳萨斯	PCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co.（美国新泽西州内特康）	p/n 200-U1
费舍尔，加拿大
美国新泽西州Vitrocom公司	5015 和 5010	硼硅酸盐毛细管
http://definetherain.org.uk/
日本滨松	LC-L1V5	DEL 紫外光源
Dolomite	3200063	一次性流体管路
多孔石	3200302	一次性流体管路
IDT，爱荷华州科拉尔维尔
尼康，纽约州梅尔维尔		直立式光学显微镜
Cytec Industries，伍德兰帕克，新泽西州
EV Group, Schä奥地利格拉茨
Zymo Research，加利福尼亚州尔湾市	D5030
Photron，美国加利福尼亚州圣地亚哥
IDT，爱荷华州科拉尔维尔
Gersteltec，普利，瑞士		SU-8 光刻胶
Fineline Imaging，科罗拉多斯普林斯，科罗拉多州
Qiagen，德国希尔登	203603
Image J		用于评估液滴直径
Anachemia，蒙特利尔，魁北克省
Excelitas，马萨诸塞州，美国		宽谱LED荧光灯
Galenvs Sciences Inc.，蒙特利尔，魁北克省	DE1010
Hexpol TPE Åmå瑞典		热塑性弹性体（TPE）
Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	13-400-518
日本尼康		用于图像采集
3M，明尼苏达州圣保罗		载体油
赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆	R37605	蓝色荧光活细胞染料（DAPI）
IDEX Health & 科学，奥克港，华盛顿州	P-881	PEEK接头
Sigma-Aldrich，奥克维尔，安大略省	806552
道康宁，米德兰，密歇根州
ThinkyUSA，加利福尼亚州，美国	ARV 310
美国马里兰州Ihc世界	IW-125-0
Zinsser NA, Northridge CA	2607808
Cetoni GmbH，科堡森，德国
Sigma-Aldrich，奥克维尔，安大略省	484431
Bio-Rad，密西沙加，安大略省	1861096
日立高新技术公司，密西沙加，安大略省
尼康，纽约州梅尔维尔		倒置显微镜
日本尼康
Loctite	AA 352