使用商用自动化系统和软件对幼年斑马鱼惊跳反应前脉冲抑制进行药理学验证

摘要

本文介绍了一种利用市售自动化系统对幼年斑马鱼的脉冲前抑制（PPI）实验进行药理学验证的实验方案。

摘要

尽管目前已有大量商用且标准化的自动化系统和软件可用于啮齿类动物的前脉冲抑制（PPI）实验，但据我们所知，迄今为止所有在斑马鱼中进行的PPI实验均使用各研究团队自行搭建的定制化系统，这些系统仅限于个别实验室内部使用。这种情况带来了诸多挑战，尤其是在数据可重复性和标准化方面。在本研究中，我们建立了一种利用商用自动化系统对幼年斑马鱼PPI 实验进行药理学验证的实验方案。与已发表的研究结果一致，我们成功复现了阿扑吗啡、氟哌啶醇和氯胺酮对受精后6天斑马鱼幼鱼PPI反应的影响。

引言

斑马鱼（Danio rerio）幼体因其具备多种优势，是模拟精神疾病（如精神分裂症）的合适模型（Gawel 等人综述¹）。这些优势包括：基因组已完全测序，且与人类同源基因的序列同源性达70%²；拥有正向和反向遗传学工具，可用于基因组操作，并确定特定基因在发育或疾病中的作用³；斑马鱼大脑中存在主要的人类/啮齿类神经递质⁴。斑马鱼具有多种可评估的神经表型特征，如焦虑、学习与记忆能力³。其身体透明性以及对主要类别神经活性药物的敏感性，使其成为药理学干预和表型药物筛选的理想首选模型^5,6。

进行高通量药物筛选时，自动化以及稳定内表型的存在至关重要⁷。例如，已有多种自动记录技术被开发用于测量幼年斑马鱼的行为，包括趋触性、惊吓反应、视动性眼震反应、视动反应、习惯化、捕食行为、睡眠/觉醒行为、运动行为及其他多种行为⁶。尽管一些实验室会自行构建用于自动测量和分析其中部分行为的系统，但目前已有商业化的成像与软件系统可供使用^8,9,10,11。前脉冲抑制（Prepulse inhibition, PPI）是一种感觉运动门控现象，表现为在强烈惊吓刺激出现前短暂呈现一个微弱的非惊吓性刺激时，机体的惊吓反应会减弱；该现象已被用作研究动物模型中精神分裂症的内表型（综述见^12,13）。此外，声学惊吓反应（acoustic startle response, ASR）和PPI在研究包括斑马鱼在内的动物模型的听觉及听觉功能方面也发挥了重要作用^14,15。幼年斑马鱼在遭遇意外惊吓刺激时会表现出特征性的C型启动反应，而该反应可被一种较弱的前脉冲刺激所减弱。C型启动长期以来被视为一种由特定神经细胞群控制的逃避行为，并已在幼年斑马鱼中得到充分表征^15,16,17。

目前已有大量商用且标准化的自动化系统和软件可用于在啮齿类动物中进行PPI实验^18,19,20。然而，据我们所知，迄今为止所有在斑马鱼中开展的PPI实验均使用各研究团队自行搭建的定制化系统，这些系统仅限于个别课题组内部使用^15,16,21,22。这在标准化方面给实验数据的可重复性和可再现性带来了挑战²³。

最近，斑马鱼研究领域的一家知名供应商开发了一套系统，集成了高速相机和PPI刺激生成器附加组件，用于在幼年斑马鱼中开展PPI（惊跳前脉冲抑制）实验²⁴。该相机以每秒1000帧的速度进行记录，能够捕捉如C型起动等快速行为反应，而PPI刺激生成器则允许用户控制递送多种声学刺激以诱发惊跳反应²⁴。在此，我们将上述系统与一种市售的、专为复杂行为自动化分析设计的综合软件包相结合¹¹，建立了一套在幼年斑马鱼中进行PPI反应检测的实验方案。我们通过药理学方法对PPI反应进行验证，所用药物包括：1）阿扑吗啡（apomorphine），一种已知可导致PPI缺陷的多巴胺受体激动剂；2）氟哌啶醇（haloperidol），一种已知可增强PPI的多巴胺受体拮抗剂和抗精神病药物；以及3）氯胺酮（ketamine），一种已知可调节PPI的NMDA受体拮抗剂。

方案

所有动物实验均经挪威食品安全局实验动物管理监督与申请系统（FOTS-18/106800-1）批准。

1. 斑马鱼养殖

1. 设置野生型成年雄性与雌性斑马鱼的交配Danio rerio）品系，在标准条件下维持培养²⁵ 前一天晚上。此处使用的是图普费尔长鳍（TL）品系。
2. 第二天早上移除屏障，让其通过自然产卵方式进行交配。
3. 从交配缸中收集卵子。
4. 移除未受精的卵子及其他碎屑，然后将卵子转移至培养皿中（n = 60），在28 °C培养箱中用胚胎培养液培养：1.5 mM HEPES（pH 7.6）、17.4 mM NaCl、0.21 mM KCl、0.12 mM MgSO4 和 0.18 mM Ca(NO3)₂.
5. 每天更换一半的胚胎培养基，并移除死亡的幼体，直至6 dpf。
   注意：所有实验均在受精后6天（dpf）的单个幼鱼上进行。

2. 药理学试剂与幼虫预处理

1. 将阿扑吗啡和氯胺酮分别溶解于E3培养基中，配制成500 µM和10 mM的储备液。
2. 将氟哌啶醇溶解于100%二甲基亚砜（DMSO）中，配制成10 mM的储备液。实验中DMSO的终浓度为0.1%。
3. 使用0.1% DMSO和E3培养基作为溶剂对照。
4. 使用以下药物终浓度：阿扑吗啡10 mg/mL、氯胺酮1 mM、氟哌啶醇20 µM¹⁶。
5. 阿扑吗啡和氯胺酮处理组的幼鱼预先暴露10分钟，氟哌啶醇和DMSO溶剂对照组预先暴露20分钟¹⁶。

行为测试前的准备工作

1. 实验当天，将幼虫及所有相关材料转移至实验室内，并将实验室内温度设置为 27 ± 1 °C。
2. 确保测试室内的背景噪音尽可能低，最好不超过 45 dB 声压级（SPL）。
   1. 将分贝（dB）计的声级计麦克风安装在测试室内（安装孔已由制造商预先钻好）。
   2. 为降低室内背景噪音，使用定制的隔音罩对测试室进行隔音处理（实验装置概览见图1B）。
3. 准备用于预脉冲抑制测试的 96 孔板。
   注意：视频摄像机分辨率为 2048 × 500 像素，因此每次最多只能成像 3 排（33 个孔）。
   1. 使用定制的丙烯酸材质 96 孔板以减少阴影干扰。
      注意：该定制板的尺寸参数可在以下网站获取：https://zenodo.org/record/3739378#.XooyLW5uKas
4. 借助移液器，将含有 1 只幼虫的 310 µL 暴露溶液/培养基转移至每个孔中。
5. 分别使用立体声放大器的音量旋钮和声级计校准并测量刺激强度。
6. 在“参考电平”部分记录最大声音强度。

4. 刺激参数与视频采集

1. 打开计算机、放大器系统和分贝 计（实验装置的总体布局见图1A）。
2. 通过将音量旋钮调至最小或最大来调节声音强度。
   1. 每次调节音量旋钮后，均需使用分贝计检查声级。这对于确定该装置所能产生的最大和最小声音强度至关重要。
      注意：分贝计计算刺激的均方根（RMS）分贝输出。系统在测试腔体的固体组件内部产生声音，使平板保持稳固的同时，在整个平板支撑面的水平面上产生振动。
      1. 将音量旋钮调至最大，用分贝计测量声音强度，并记录该数值。
3. 在PPI生成器的界面上设定参数：刺激间间隔表示为延迟（Delay）；试次间间隔表示为采集时间增量（Acquisition delta time）；预刺激持续时间等。
   1. 对于仅含预刺激的试次，确保“振幅”或刺激持续时间中的惊跳（Startle）参数设置为零；反之，在仅含惊跳刺激的试次中，这些参数应设为零。
4. 要生成试次列表，请选择添加 > 并为该试次命名。例如，“预刺激 50 dB 单独呈现”。
   注意：可按需创建任意数量的试次，但需注意列表长度，以免导致程序崩溃。
   1. 在所有PPI实验中，应以伪随机顺序交替排列预刺激试次和单独脉冲试次。当实验中呈现多个刺激时，试次间间隔（ITI）设为30秒。
      注意：本研究中使用的惊跳刺激（脉冲）为660 Hz、持续100 ms，预刺激为440 Hz、持续5 ms。在PPI实验中，刺激间间隔（ISI）为100 ms。
5. 要保存实验协议，请选择文件 > 另存为。
6. 按以下方式调节测试腔体内的光照条件。
   1. 启动USB测量计算软件，选择模拟输出，然后进入D/A OUT O（P13）以调整光照。数值为零表示无光照，增大D/A OUT O的数值可增强箱内光照强度。所有实验均采用100的光照强度。
7. 设置摄像机
   1. 启动软件并等待摄像机加载完成。
   2. 选择调整（位于右侧），将采集帧率设为1,000，然后点击“应用”以生效。
8. 在实验开始前，将幼虫在100%光照的测试腔体内适应5分钟。
9. 开始实验时，在PPI生成器中选择实验菜单，点击运行，然后选择孔板格式（例如，33孔）。
   1. 运行实验前，务必确保摄像机软件已启动并配置了正确的设置。
   2. 每个试次采集一段2秒的视频。
   3. 确保采集帧率设置为1,000。

5. 声音惊吓反应及PPI的自动化追踪与分析

1. 实验方案设置
   1. 启动分析软件（参见 材料表）。选择 新模板 > 应用预定义模板 然后浏览其他菜单（详见下文）。
      1. 选择 来自视频文件 下 视频来源.
      2. 浏览视频文件。设置 受试者 作为 鱼 > 斑马鱼幼鱼 > 区域模板 （无模板）。请指定 竞技场数量 在……下方 阿雷纳斯.
      3. 指定 每个实验区域的受试者数量 （设为1）下 受试者.
      4. 选择 中心点、鼻尖点和尾基点检测 在……下方 追踪的特征 （参见 图2A，B).
         注意：这对于计算C型启动反应的身体角度至关重要（参见 图2C).
      5. 点击 名称 > 另存为使用的单位分别为毫米（mm）、秒（s）和度（deg），用于表示距离、时间和旋转角度。
         注意：校准比例尺时请务必使用相同的单位。
   2. 选择 竞技场设置.
      1. 点击 获取背景图像.
      2. 浏览右侧菜单中的步骤（如有疑问，请使用 帮助 菜单）。
      3. 选择圆形绘制工具以绘制实验区域。
   3. 选择 试验控制设置 > 创建新项目 > 名称.
   4. 选择 检测设置，按照右侧菜单中的步骤进行操作。
      1. 将采样率设置为 25。选择 高级检测设置 下方 方法，选择 动态减影, 高级模型/成年鱼，然后设定 主体颜色与背景的对比 作为 较暗 移动滑块以定义幼虫的对比度。
      2. 在主体轮廓下，先选择“腐蚀”，再选择“膨胀”，并逐步增加轮廓的腐蚀和膨胀值，直至动物被完全检测到。
   5. 保存该方案，用于后续分析获取的 PPI 视频。
2. 试验列表设置。
   1. 选择 试验列表，定义自变量，如幼虫编号、处理方式、刺激类型等。选择视频存储路径，并定义用于批量采集的试验列表。
3. 采集设置。
   注意：如果已生成试验列表，可对视频进行批量采集。
   1. 如果部分轨迹丢失，请使用轨迹编辑器调整已追踪的特征。
   2. 排除在使用轨迹编辑器后仍未解决的跟踪错误。
   3. 将轨迹平滑参数设置为 1 mm，以降低数据噪声。可根据幼虫的背景活动情况调整该参数。
4. 分析设置。
   1. 选择要分析的试验，需选定 数据图谱 并根据感兴趣的自变量定义轨迹。
      注意：如果组件被隐藏，请单击右上角的眼睛图标以显示。
      1. 过滤器 待分析试验部分（例如，基于治疗或刺激类型分组）。
      2. 选择要分析的轨迹部分（筑巢）。本研究中，数据按刺激 onset 至刺激 onset 后 100 ms 的时间段内的轨迹进行嵌套。
      3. 请务必使用箭头线连接所有滤光片和嵌套盒，以完成操作说明。
   2. 定义待分析的因变量，选择 分析图谱 并指定感兴趣的变量（重点关注 身体 下 因变量).
      注：如果组件被隐藏，请单击右上角的眼睛图标以显示。
      1. 双击 身体角度选择 绝对弯曲. 进行下去 试验设置 并选择 最大值，然后点击 添加。
   3. 双击 身体角度状态. 将平均间隔设为 5 个样本. 设置弯曲角度阈值。用于计算统计量 弯曲的，通过 试验统计 并选择 首次潜伏期 > 添加重复上述步骤，直至获得不同的阈值（使用范围为20–80°），并相应命名。
   4. 生成 统计与图表.
      1. 选择 分析 > 结果 > 统计学 & 图表，然后点击 计算.
      2. 确保将数据和分析配置文件设置为正确的模板，因为每个部分下可以创建多个模板。
   5. 将试验和组统计结果导出为电子表格文件，以便进行后续处理和分析。

6. 数据分析

1. 打开包含试验统计数据的电子表格文件。
2. 选择列 Body angle Maximum deg, Bent latency（不同身体角度阈值下的数据）。
3. 将刺激开始后 50 ms 潜伏期截止时间内，身体角度变化 ≥ 30° 的每一次变化视为一次有效的C型启动反应（即为有反应者）；身体角度变化 < 30° 的个体则视为无反应者。
4. 以二进制方式，对每孔中的幼鱼分别标记为 1（有反应）或 0（无反应）。
   1. 统计每孔中反应者与无反应幼鱼的总数。计算每种情况下的反应率（%），公式为（发生反应的幼鱼数 / 幼鱼总数）× 100。在分析中排除对惊吓刺激反应率低于 30% 的幼鱼¹⁶。
      注意：任何能够使等于或超过 70% 的幼鱼产生 C 型启动反应的刺激强度，均被视为合适的惊吓刺激¹⁶。
5. 按以下公式计算 %PPI：100 ×（对惊吓刺激的反应百分比 − 对预脉冲+惊吓序列的反应百分比）/（对惊吓刺激的反应百分比）¹⁶。

7. 统计学分析

1. 以均值 ± 标准差（S.D.）表示数据（统计学软件见材料表）。
2. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey’s post-hoc 检验，确定不同预脉冲强度对幼虫反应的影响。
3. 采用双因素方差分析（two-way ANOVA）结合 Holm-Sidak’s post-hoc 检验，分析药物处理在不同预脉冲强度下对 % PPI 反应的影响。

结果

进行了三项实验以验证将多个系统结合用于分析幼年斑马鱼听觉惊吓反应前脉冲抑制的方案。首先，测试了准确传递声学刺激以及捕捉幼鱼对惊吓刺激反应的能力。其次，验证了在给予前脉冲刺激时减弱惊吓反应的能力。最后，建立了检测阿扑吗啡、氟哌啶醇和氯胺酮等药物对惊吓反应前脉冲抑制产生药理学调节作用的能力。

幼年斑马鱼对声学惊吓刺激的反应
先前的研究表明，当受到惊吓性声学刺激时，幼年斑马鱼会表现出特征性的C型启动行为¹⁶。本研究测试了诱发并记录幼鱼对惊吓刺激行为反应的能力。观察到被记录的幼鱼表现出C型启动反应（图2）。强度为70 dB re（100 ms，660 Hz，补充图1A）的刺激足以在≥70%的幼鱼中引发反应（图3A）。当以30秒的试次间隔重复呈现30次时，70 dB re刺激并未导致幼鱼产生习惯化现象（N = 3个重复；每个重复16条幼鱼），如图3B所示。

前脉冲减弱斑马鱼幼体对声学刺激的惊吓反应
大量证据表明，前脉冲刺激可调节斑马鱼幼体对惊吓刺激的反应^15,21,22,26。实验采用双脉冲范式，其中较弱的刺激（称为前脉冲）先于引发惊吓反应的刺激（称为脉冲）出现。所使用的前脉冲刺激强度分别比设定为70 dB re的脉冲刺激低20、17或14 dB。前脉冲（5 ms，440 Hz）始终在脉冲开始前100 ms呈现（补充图1B）。每种测试的前脉冲刺激均显著降低了幼体对脉冲的反应。在图4中展示了6日龄TL品系斑马鱼幼体在E3培养基中的惊吓反应（以%表示），N = 6（每组16条幼体）。幼体对惊吓刺激（脉冲）产生反应的比例为79.86 ± 9.772%。如预期所示，当惊吓刺激前分别出现50、53或56 dB的前脉冲时，幼体反应分别下降至40.87% ± 11.30%、39.58% ± 7.345%和29.17% ± 9.350%。单因素方差分析显示不同刺激对幼体反应具有统计学差异（F (3, 48) = 57.23，P < 0.0001），Tukey多重比较检验在95%置信区间内显示各组间差异具有统计学意义。

药理学对前脉冲抑制的调节
早期研究表明，多巴胺能药物阿扑吗啡和氟哌啶醇，以及谷氨酸能药物氯胺酮，与在哺乳动物和啮齿类动物中的作用类似，均可显著调节幼虫的前脉冲抑制¹⁶。验证实验系统的药物浓度选择依据即为这些研究。所有药理学实验的刺激间间隔（ISI）均为 100 ms。

阿扑吗啡对前脉冲抑制的影响
在 图5经10 mg/mL阿扑吗啡预处理10分钟的幼鱼与E3对照组幼鱼相比，其%PPI整体下降（双因素方差分析，非重复测量（因素：处理方式和预脉冲强度；处理方式：F (1, 34) = 16.21，p = 0.0003；预脉冲强度：F (2, 34) = 8.674，P = 0.0009），交互作用无显著性差异：F (2, 34) = 2.514，p = 0.0959）。为进一步详细探究差异，采用Holm-Sidak法 事后 检验结果显示，在预脉冲强度为53（p = 0.0126）和56（p = 0.0044）时，E3对照组与阿扑吗啡处理组幼虫的惊吓反应存在显著差异，但在50 dB时差异不显著（p = 0.5813）。

氟哌啶醇对前脉冲抑制的影响
图6 与在E3培养基中的幼虫相比，经20 µM氟哌啶醇预处理20分钟的幼虫表现出%PPI的整体增加（双因素方差分析，非重复测量（因素：处理方式和预脉冲强度；处理方式：F (1, 32) = 20.75, p < 0.0001；预脉冲强度：F (3, 96) = 16.68, p < 0.0001；交互作用：F (3, 96) = 1.291, p = 0.2799））。 < 0.0001；预刺激强度：F (2, 32) = 3.147，p = 0.0565，无显著交互作用：F (2, 32) = 0.7455，p = 0.4826）。采用Holm-Sidak法 事后 检验结果显示，仅在预刺激强度为53（p = 0.00489）和56（p = 0.0348）时存在统计学显著性，而在50 dB时无统计学显著性（p = 0.067）。

氯胺酮对前脉冲抑制的影响
图7 表明在不同预脉冲刺激强度下，E3对照组幼虫与经1.0 mM氯胺酮预处理10分钟的幼虫在惊跳反应上存在差异（双因素方差分析，非重复测量（因素：处理方式和预脉冲强度；处理方式：F (1, 35) = 25.46, p < 0.0001；预脉冲强度：F (3, 35) = 3.487, p = 0.0257；交互作用：F (3, 35) = 0.8037, p = 0.5014））。 < 0.0001；预脉冲强度：F (2, 35) = 6.018，p = 0.0057，无显著交互作用：F (2, 35) = 0.8450，p = 0.4381）。Holm-Sidak法 事后 检验仅在预刺激强度为50 dB（p = 0.0039）和53 dB（p = 0.0027）时显示显著性，而在56 dB时无显著性（p = 0.0802）。

图1：实验装置。（A）设备布置的总体示意图。（B）实验装置的自制隔音措施，用于在实验过程中最小化背景噪声。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：幼年斑马鱼声学惊吓反应的分析。（A）6 条 6 日龄斑马鱼幼鱼表现出的典型C型启动反应。（B）在 6 日龄幼鱼图像上叠加的三个追踪特征的代表性图像：中心点（红色）、鼻尖点（青色）和尾基点（紫色）。（C）6 日龄TL野生型斑马鱼幼鱼表现出的绝对弯曲角度的代表性图像。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：声学惊跳反应阈值的确定。（A）70 dB 的刺激强度（以红色虚线表示）能够引发 >70% 的幼鱼出现C型启动反应（N = 33；6 dpf TL）。（B）幼鱼在30秒的试验间间隔下，连续接受30次70 dB 重刺激时未表现出习惯化现象（N = 3 个重复；每重复16条幼鱼）。数据以均值 ± 标准差表示。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：预脉冲引起的幼虫反应降低百分比（%）。 比70 dB惊吓刺激强度低20、17和14 dB的预脉冲刺激可导致野生型TL幼鱼C型启动反应个体数量减少。所有数据以均值 ± 标准差表示，N = 5（每组16条幼鱼），****p < 0.0001。 < 0.0001，与惊吓刺激相比具有显著差异（Tukey法） 事后 单因素方差分析后检验。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图5：阿扑吗啡诱导的%PPI缺陷。 所有数据均以均值 ± 标准差表示，N = 4‒5（每组16条幼虫），组间差异经Holm-Sidak法检验具有统计学意义 事后 双因素方差分析后检验。*p = 0.0126，E3 对照/阿扑吗啡处理组在 53 dB；**p = 0.0044，E3 对照/阿扑吗啡处理组在 56 dB。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图6：氟哌啶醇诱导的PPI百分比增强。 所有数据均以均值 ± 标准差表示，N = 4‒5（每组16条幼虫），组间差异经Holm-Sidak法检验具有统计学意义 事后 双因素方差分析后检验。**p = 0.0048，DMSO 对照组/去甲吗啡处理组在 53 dB 时；*p = 0.0348，DMSO 对照组/去甲吗啡处理组在 56 dB 时。 请点击此处查看此图的放大版本。

图7：氯胺酮诱导的PPI百分比增强。 所有数据均以均值 ± 标准差表示，N = 4‒5（每组16条幼虫），采用Holm-Sidak法进行统计学显著性差异分析 事后 双因素方差分析后检验 **p = 0.0039，E3 对照/阿扑吗啡处理组在 50 dB 条件下，**p = 0.0027，E3 对照/阿扑吗啡处理组在 53 dB 条件下。 请点击此处查看此图的放大版本。

补充视频1：幼虫对70 dB声学惊吓刺激产生C型启动反应的代表性视频。 请点击此处下载该视频。

补充图1：使用PPI生成器生成的刺激条件的代表性示例。 （A）仅刺激试验，（B）预脉冲抑制试验（预脉冲+脉冲），（C）无刺激试验，用于测量未受刺激幼虫的阈值基线弯曲角度。请点击此处下载该图。

讨论

验证任何新的行为检测系统对于改进和优化神经行为学研究的实验方案至关重要。本研究评估了两种市售系统及配套软件在诱导斑马鱼幼鱼产生听觉惊吓反应，以及检测和量化已知药物对这类行为的调节作用方面的能力。

为优化实验设置，进行了多项改进并排除了故障。默认的C型启动反应分析软件会在每次实验数据采集完成后自动开始分析（每个实验包含22次试验/孔板），这限制了每天可运行的孔板数量，从而降低了通量（每天5块孔板）。为克服这一限制，需要将分析软件与数据采集过程分离，从而使通量提高至平均每天10块孔板。因此，改用独立的非实时分析软件的决策被证明更为成功且高效。为避免阴影或其他碎屑干扰而引入数据噪声，建议将孔完全充满培养基，彻底去除所有气泡，并避免残留食物颗粒等可能被误识别为幼虫的物质，以减少数据噪声。在对声音刺激进行校准后，分贝计测得放大器系统所能达到的最大强度为85 dB re，而测试腔室的初始背景噪声为60 dB re，导致可用的分贝操作窗口较窄。因此，尽可能降低背景噪声至关重要。为此，使用Parafon声学材料（见材料表）在测试腔室外构建了一层额外的隔音层，并结合使用录音棚隔音套件（见材料表）增加另一层隔音。通过这些隔音措施，测试腔室内的背景噪声成功从最初的60 dB re降低至45 dB re。

目前，该实验装置的一个优势在于所有组件均为市售产品，因此不受限于少数实验室。即使对编程语言了解有限的人员也可使用，因为该方案相对易于理解和操作。例如，通过使用PPI系统，可以以不同的刺激间间隔（inter-stimulus interval）和试次间间隔（inter-trial interval）递送脉冲和预脉冲刺激，并记录幼鱼对这些刺激的行为反应。一旦捕获到这些行为，即可利用分析软件将其分类为“反应者”和“非反应者”。反应者组定义为在刺激后潜伏期小于<50 ms内表现出≥30°C型起始（C-start）反应的幼鱼。此外，靶向多巴胺能和谷氨酸能信号通路的药物可调节PPI反应（Geyer及其同事综述²⁷）。与既往研究一致，非选择性多巴胺受体激动剂阿扑吗啡（apomorphine）降低了幼年斑马鱼惊吓反应的预脉冲抑制，而多巴胺受体拮抗剂氟哌啶醇（haloperidol）则增强了该反应。在幼年斑马鱼中，研究表明氯胺酮（ketamine）对PPI的调节作用依赖于刺激间间隔（ISI）的持续时间¹⁶。在前述研究中，经氯胺酮预处理后，当ISI为30 ms时PPI增强，而在ISI为500 ms时PPI受到抑制。尽管本研究未采用可变ISI，但观察到在ISI为100 ms时氯胺酮增强了PPI，这与先前研究中ISI为30 ms时的结果具有可比性。该研究证明，通过整合这些市售系统，能够在斑马鱼幼体中可靠地执行PPI检测，并稳定地检测药物诱导的PPI反应变化。该系统的局限性在于，分析软件所追踪的“鼻尖点”始终落在幼鱼的某一只眼睛上，从而产生一个基线角度。为克服这一问题，必须始终测定未受刺激幼鱼的基线弯曲角度，本研究中所用幼鱼的该角度约为30°。因此，将30°作为判定惊吓状态下幼鱼是否产生阳性C型起始反应的阈值。若能充分考虑上述因素，则任何具备该装置设备的实验室均可开展PPI检测。由于潜伏期变异范围较广，本文未如先前报道¹⁶那样将惊吓反应的运动学特征进一步细分为短潜伏期和长潜伏期类型，仅采用刺激开始后潜伏期小于<50 ms的C型起始反应进行分析¹⁵。

已有研究报道，不同品系会影响斑马鱼在多种实验中的行为表现^28,29,30,31，同时也会影响其听觉敏感性³²。因此，确定所测试品系的基线弯曲角度至关重要。由于各品系的听觉敏感性可能存在差异，确定其基线惊跳反应、最适合用作预脉冲或惊跳刺激的声音强度，以及刺激呈现的持续时间也十分关键。刺激间间隔（ISI）是另一个需要仔细考虑的参数，因为某些药物对前脉冲抑制（PPI）的增强或减弱作用可能取决于预脉冲与惊跳刺激起始之间的时间间隔¹⁶。预计对认知功能、神经精神疾病和听觉（听觉功能）研究感兴趣的实验室，将发现本前脉冲抑制（PPI）装置与方案在筛选药理学和/或遗传学模型时具有实用价值。本方案还为化合物文库的高通量筛选提供了基础。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿扑吗啡	Sigma Aldrich	A4393	多巴胺受体激动剂
分贝计	PCE instruments	PCE-MSM 4	用于测量刺激强度
二甲基亚砜	Sigma Aldrich	D8418	用于溶解有机溶质
Dynavox 放大器	Dynavox	CS-PA1 MK	用于传递声学刺激
EthoVision XT	Noldus, 荷兰	EthoVision XT, 版本 14	自动化追踪软件
GraphPad Prism	GraphPad Software	版本 8	统计分析软件
氟哌啶醇	Sigma Aldrich	H1512	多巴胺受体拮抗剂
氯胺酮	Sigma Aldrich	Y0000450	NMDA 受体拮抗剂
parofon 声学材料	Paroc	8528308	有助于降低测试柜中的背景噪音
t.akustik 声学舱套装	Thormann, 德国	458543	有助于降低测试柜中的背景噪音
ZebraBox Revo 配 PPI 附加组件	ViewPoint, 法国	ZebraBox Revo with PPI add-ons	包含硬件和软件