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方法文章

定量分析不同牛脑结构中的狂犬病病毒

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DOI：

10.3791/61429

⸱

2021年5月22日

 ,  ,  , 
1Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA), INIFAP, 2Campus Toluca, Universidad del Valle de México, 3Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro

本文内容

摘要

本方案介绍了一种基于qRT-PCR的方法，通过体外转录技术测定牛脑不同解剖结构中狂犬病病毒核蛋白（N）基因的拷贝数。

摘要

牛麻痹性狂犬病（BPR）是一种病毒性脑炎，对整个拉丁美洲具有重大的经济影响，并构成主要的人畜共患风险。本研究的目的是利用实验室方案，通过定量实时反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测牛脑不同解剖结构中狂犬病病毒（RABV）基因组的相对拷贝数。qRT-PCR通过扩增后产生的荧光信号来定量样本中特定基因拷贝的数量，该荧光信号与样本中目标核酸的含量成正比。该方法具有耗时短、污染风险低以及相较于其他技术更易于检测不同样本中病毒核酸的优点。六只感染狂犬病动物的脑组织被分为六个解剖结构，分别为海马、小脑、皮层、延髓、脑桥和丘脑。所有脑组织均通过直接免疫荧光试验确认为RABV抗原阳性。同时，也检测了四只RABV阴性牛脑组织中相同解剖结构。从每个结构中提取RNA并用于qRT-PCR分析。通过体外转录的核蛋白基因进行检测，以确定RABV基因的拷贝数。用于定量病毒RNA的标准曲线显示扩增效率为100%，线性相关系数为0.99。分析结果表明，皮层、延髓和丘脑是检测RABV最理想的中枢神经系统部位，因为这些结构中RABV含量最高。该检测的特异性为100%，所有样本均为阳性，未检测到假阳性结果。该方法可用于在BPR诊断过程中检测含有低水平RABV的样本。

引言

狂犬病可通过多种技术在发病期间（ante-mortem）和死亡后（post-mortem）进行确诊，这些技术能够检测脑组织、皮肤、尿液或唾液中的病毒核酸1。分子检测方法主要通过检测狂犬病病毒核蛋白（N）基因来进行诊断，该基因也用于病毒的基因分型。在动物中，可使用受感染脑组织的任意部分进行狂犬病诊断；然而，若要排除狂犬病的可能性，则必须至少检测脑部两个不同区域的组织样本2。目前存在多种用于动物狂犬病检测的诊断方法，但直接免疫荧光试验仍是标准参考技术3。其他检测方法包括小鼠接种试验、组织培养感染试验以及聚合酶链式反应（PCR）4。世界卫生组织（WHO）和世界动物卫生组织（OIE）分别推荐上述所有技术用于人和动物的狂犬病诊断5。

近年来，核酸检出与扩增技术彻底改变了狂犬病的诊断方式6，这些技术在人狂犬病的ante mortem（生前）诊断中发挥着重要作用。已有多种基于PCR的检测方法被评估，用于补充传统的ante-mortem（生前）和post-mortem（死后）狂犬病诊断方法7,8,9,10。大多数检测方法以狂犬病毒核蛋白基因作为扩增靶标，该基因是病毒基因组中最保守的区域1,11。在过去20年中，已开发出多种分子检测方法用于RABV的诊断，其中一些方法还被用于病毒的特征分析。大多数研究旨在检测病毒基因组内的保守基因，最常用的方法是常规或定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测12,13。

PCR 是一种高度敏感的诊断技术，即使在组织已发生降解的情况下，也能检测其中特定病原体的基因组。通过基于 PCR 的方法，可对临床样本中极微量的感染性病原体，通过特异性地重复扩增其 DNA 核苷酸序列进行检测。14采用荧光探针（如TaqMan）或DNA结合染料（如SYBR Green）的qRT-PCR已用于临床试验中以诊断狂犬病病毒（RABV） 前- 和 术后- 死亡后 具有高灵敏度；然而，这种方法需要专用设备。为克服这一限制，已提出采用逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术，因其成本低、操作简便，且具备检测狂犬病病毒（RABV）的理想特性。该检测方法尤为重要，可在发展中国家应用15.

qRT-PCR 基于对分子的检测与定量，其中荧光信号的增加与单个反应中 PCR 产物的量成正比。随着核酸靶标拷贝数的增加，荧光信号也随之增强。通常使用非特异性嵌入染料（如 SYBR Green DNA 结合染料）或携带荧光基团和淬灭基团的序列特异性寡核苷酸探针，为 qRT-PCR 提供荧光信号读出。与传统的 RT-PCR 相比，该检测方法具有多项优势，包括检测时间更短（2–4 小时）、由于采用封闭管系统（无需对扩增产物进行 PCR 后操作）而降低污染风险，以及能够同时检测不同靶标16。qRT-PCR 可用于从唾液及其他样本中进行狂犬病的 ante-mortem 诊断。该检测还可作为通用的实时检测方法，用于检测不同 Lyssavirus 物种或 RABV 的谱系15。在此组合型 RT-PCR 方法中，需进行两个反应：第一个反应检测 RABV 的不同遗传谱系，第二个反应检测 Lyssavirus 物种。两个步骤均涉及 qRT-PCR 检测，其中第一步使用杂交探针，第二步使用染料15。由于已有大量检测证明该技术可成功实现 RABV 的分子检测，目前的 OIE 陆生动物手册（2018 年版）推荐使用 PCR 进行 RABV 的分子检测17。

墨西哥是一个畜牧业潜力巨大的国家。畜牧业产量最高的各州既包括热带湿润地区，也包括干旱地区，后者由于存在主要的狂犬病传播媒介——吸血蝙蝠Desmodus rotundus，存在狂犬病暴发的风险。因此，开发更多用于预防和控制墨西哥牛类麻痹性狂犬病（BPR）的工具至关重要。基于此，本研究旨在利用定量qRT-PCR技术，测定因狂犬病感染致死的牛脑中不同解剖结构内的病毒颗粒数量。

六份来自RABV阳性牛只的脑组织由外部实验室提供，用于下述qRT-PCR方案的开发。牛脑结构样本通过冷链运输至INIFAP CENID-MA实验室的BSL-2设施，并于-80 °C保存至使用。这些脑组织来自墨西哥坎佩切州、尤卡坦州和克雷塔罗州的动物。在接收前，已从脑组织中分离出多个结构，包括海马、小脑、大脑皮层、延髓、脑桥和丘脑18,19。遗传物质的提取方法如下所述。RABV诊断通过直接荧光抗体法（DFA）确认20。以接种了RABV的小鼠脑组织作为阳性对照21。此外，使用四份经DFA检测确定为RABV阴性的牛脑组织作为阴性对照。

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方案

本研究经动物实验伦理委员会（CENID-MA动物微生物学国家研究与纪律中心，IACUC）批准，并严格遵循其关于动物使用的建议进行。

1. 样品

  1. 采用6个狂犬病阳性牛脑的不同脑区组织进行RT-PCR分析。

2. 直接荧光抗体法（DFAs）检测以确诊狂犬病

注意：通过直接荧光抗体法（DFA）检测狂犬病抗原是一种定性方法，用于检测狂犬病病毒核蛋白的存在，其原理是使用荧光素标记的抗体。本实验按照 Dean 等人（1966）20 提供的方案进行，具体步骤如下。

  1. 从不同脑结构中分离的每种组织，在直径约15 mm的无菌载玻片上制备两个印迹。使用木制涂片棒将约3 mm3的组织涂抹在无菌载玻片上。通过手动轻轻按压木制涂片棒与载玻片接触，以形成涂片。
  2. 将样本涂片载玻片浸入-20 °C的100%丙酮中固定1小时。孵育后，在21 °C下用干燥布料干燥30分钟。
  3. 通过注射器滴加50 µL荧光素标记的抗核蛋白抗体至每张脑组织涂片，按1:10比例稀释。
  4. 将载玻片置于湿盒中，在37 °C下与结合物孵育1小时。
  5. 孵育后，用蒸馏水和PBS洗涤载玻片两次，以去除未结合的结合物。在21 °C下让载玻片自然干燥，轻轻吸去多余液体后，短暂空气干燥，再进行封片。
  6. 加入一滴50%磷酸甘油，覆盖涂片表面，然后加盖盖玻片。在落射荧光显微镜下以40倍放大倍数观察切片。
    1. 以与样本相同的方式处理并观察阳性对照和阴性对照（阳性对照：接种狂犬病病毒RABV的小鼠脑组织；阴性对照：RABV阴性的牛脑组织）。

3. 为 RT-PCR 生成阳性对照

  1. 从种质库获取BHK-21细胞。使用传代次数不超过70代的细胞th 通过第2代传代培养复制狂犬病病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth（ERA）株
  2. 在含有最低必需培养基（MEM）并添加10%胎牛血清（FCS）的培养瓶中，于37 °C、CO₂条件下培养和传代BHK-21细胞2 (5%) 且在潮湿条件下。将细胞置于 25 cm² 培养瓶中培养。2 培养瓶中的细胞培养至80%汇合度后进行传代。
  3. 从细胞中移除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养瓶。向培养物中接种 105 RABV ERA 毒株的 TCID/mL。在 37 °C、CO₂ 存在条件下，将病毒接种物置于恒定振荡环境中孵育 2 小时。2 （5%）且在潮湿条件下。
  4. 移除感染培养基，加入含5%（胎牛血清）SFB的MEM。在37 °C、CO₂条件下孵育72 h。2 (5%) 在潮湿条件下。
  5. 接种后3天，当细胞出现细胞病变效应时收获RABV。将感染的细胞冷冻，然后在4 °C下解冻以裂解细胞。收集瓶中的培养基，随后将细胞转入离心管，在1,050 × g下离心 x g 4 °C 下离心 10 分钟。
  6. 将RABV的上清液于-80 °C保存，并分装成工作份数后于-70 °C储存。
  7. 将上一步获得的病毒接种至21日龄雌性CD1小鼠脑内。使用1 mL注射器接种含有10的溶液50 μL6 MICLD50 （小鼠感染性培养物半数致死剂量）注入小鼠22.

4. RNA 提取

注意：总RNA采用有机提取法直接从牛脑中提取，具体步骤如下。

  1. 使用每种解剖结构的 100 mg 脑组织，采用含有异硫氰酸胍的市售试剂提取总 RNA。
  2. 在微量离心管中，使用 Dounce 匀浆器配合小研杵，在 1 mL 异硫氰酸胍试剂中手动匀浆每种结构的 100 mg 组织，涡旋振荡 15 秒，速度调至最大。
  3. 将样品在冰上孵育 5 分钟，然后加入 200 μL 氯仿。剧烈振荡混合 15 秒，冰上孵育 2 至 3 分钟，随后在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟。
  4. 将水相转移至洁净离心管中，加入 500 μL 异丙醇。在 21 °C 下孵育 15 分钟。
  5. 在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 10 分钟。用移液器吸除上清液。分离的 RNA 将以沉淀形式存在于管底。
  6. 用 1 mL 75% 乙醇通过移液方式洗涤 RNA 沉淀，在 4 °C 下以 7500 x g 离心 5 分钟。
  7. 倾去上清液，在室温（21 °C）下将 RNA 沉淀空气干燥。随后将沉淀溶解于 50 μL 无核酸酶水中。
  8. 使用分光光度计在 260 nm 处测定 RNA 浓度和纯度。将 RNA 储存于 -80 °C 直至使用。
  9. 通过 DNase I 消化去除 RNA 样品中的 DNA。每提取 1 µg RNA 加入 2 U DNase I。然后加入 5 µL 10x 反应缓冲液，在 37 °C 下孵育 30 分钟。向混合物中加入 1 μL EDTA，随后在 65 °C 下孵育 10 分钟以灭活 DNase I。

5. cDNA 合成与 PCR

  1. 使用寡聚dT和逆转录酶合成第一链cDNA。每1 μg RNA，加入1 μL寡聚dT（500 μg/mL）、1 μL 10 mM dNTP混合物，并用无核酸酶的蒸馏水定容至终体积12 μL。将混合物在65 °C孵育5 min。
  2. 将反应混合物迅速冷却至4 °C。在1,050 x g离心30 s，然后加入4 μL反应缓冲液、2 μL 0.1 M DTT和1 μL核糖核酸酶抑制剂（40 U/μL）。
  3. 将反应混合物在37 °C孵育2 min，然后加入1 µL逆转录酶（200 U）。接着在37 °C继续孵育50 min，随后在70 °C灭活反应15 min。
  4. 将cDNA储存于-20 °C，待用。
    注意：在进行体外合成前，为验证所合成cDNA的质量，可先扩增RABV N基因的761 bp片段。具体操作请参照Loza-Rubio等11所述方案，详见下文步骤5.5。
  5. 使用Taq DNA聚合酶进行PCR，反应体系如下：含20 mM MgCl2的10x Taq缓冲液，0.2 mM dNTPs，1 U Taq聚合酶，每种引物各10 μM（SuEli+：5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ 和 SuEli-：5′ caggctcraacattcttctta 3′），2.5 μL cDNA，以及超纯水补足至终体积50 µL。
  6. 在PCR仪中进行扩增，循环条件如下：95 °C预变性3 min；35个循环：95 °C变性30 s，60 °C退火30 s，72 °C延伸1 min；最后72 °C延伸7 min，共1个循环。
  7. 通过1%琼脂糖凝胶电泳检测761 bp的PCR产物是否存在。

6. 体外转录

注意：体外转录可生成目的基因的 mRNA。使用一对引物扩增完整的 RABV N 基因，以及另一对用于 qRT-PCR 检测的阳性对照引物。这些引物设计用于扩增完整的 RABV N 基因，并添加可被 T7 聚合酶识别的启动子序列（TAATACGACTCACTATAG）。

  1. 为了扩增整个RABV的N基因，使用引物Trans-Nrab正向引物（5ʹ gatgagtcactcgaatatgtctt 3ʹ）和反向引物（5ʹ caataatacgactcactatagggatggatgccgacaagatt 3ʹ），并采用高保真PCR试剂盒。
    1. 每个反应中，在洁净的PCR管中配制PCR主混合液：加入10×反应缓冲液、2 mM DMSO、25 mM MgCl2、10 mM dNTPs、每种引物各10 μM、0.5 U高保真DNA聚合酶、1.5 μL cDNA（步骤5制备）以及超纯水，总体积为50 µL。
    2. 使用设定如下程序的热循环仪进行扩增：94 °C预变性1 min；进行4个循环，每循环为94 °C变性1 min、40 °C退火1 min、72 °C延伸2 min；再进行35个循环，每循环为94 °C变性1 min、60 °C退火1 min、72 °C延伸2 min；最后在72 °C延伸2 min。
  2. 将PCR产物作为体外合成的模板，并去除步骤6.1.2中酶促反应的残留组分，使用基于离心柱的浓缩试剂盒按照制造商说明书纯化PCR产物，随后用分光光度计定量。
  3. 进行RNA合成时，使用体外转录试剂盒，反应体系如下：5 μL T7转录5×缓冲液、每种三磷酸核苷酸各1.9 μL、10 μg纯化的RABV N DNA VP2 DNA以及2.5 μL酶混合物。随后在37 °C孵育4小时。然后向反应体系中加入1 μL浓度为1 U/μg的无RNase DNA酶，37 °C孵育15分钟，以消除DNA污染。
  4. 对体外转录的RNA进行纯化，然后使用苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）进行浓缩。
  5. 将纯化的RNA沉淀重悬于70 μL TE缓冲液中，保存于-80 °C备用。
  6. 重复步骤6.1的PCR流程，直至获得约5 μg的PCR产物。经过纯化和浓缩后，体外转录的N基因mRNA浓度将达到4.711 μg/μL。
  7. 确认体外转录的mRNA与本方案步骤5中所得序列一致，并将其作为实时逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）的阳性对照使用。

7. 实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）

  1. 进行qRT-PCR时，使用编码完整N基因的体外mRNA转录本作为阳性对照，并根据制造商说明书，结合商业化的一步法qRT-PCR试剂盒和杂交探针进行检测。采用Carneiro等（2010）23描述的探针和引物检测RABV基因N的保守区域（BRDesrot-Rev：5′ aaactcaagagaaggccaacca 3′，BRDesrot-Fwd：5′ cgtactgatgtggaagggaattg 3′，以及BRDesrot-Probe：5′-FAM-acaagggaccctactgtttcagagcatgc-3′-BHQ）。
  2. 使用以下热循环条件：50 °C孵育10分钟，95 °C预变性2分钟，1个循环；随后进行40个循环：95 °C变性15秒，50 °C退火延伸30秒。

8. 校准曲线或标准曲线

  1. 通过连续移液，将体外转录的mRNA以1 μg/μL的浓度进行系列稀释，直至获得六个十倍稀释梯度。每个稀释度准备三份100 μL体积的样品，用于构建标准曲线。按照步骤7所述进行qRT-PCR。
  2. 在带有转子的热循环仪中进行qRT-PCR，同时处理不同脑组织样本，并与标准曲线反应、阳性对照、阴性对照以及从细胞培养物中分离的上清液一同运行。
  3. 为评估检测限、检测效能及灵敏度，需在相同条件下使用三份重复的标准曲线。

9. 生物样本的qRT-PCR

  1. 为检测RABV的N基因，使用田间样本、阳性对照、阴性对照以及细胞培养上清液的RNA，采用第7步所述的PCR试剂盒进行qRT-PCR。
  2. 为确定牛脑组织样本中RABV基因组的拷贝数，需从标准曲线和生物样本的Ct值数据中获取，并结合校准曲线方程插值得出结果。

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结果

DFA 检测结果显示，大脑皮层、丘脑、延髓、脑桥和角的 RABV 阳性率分别为 100%、100%、83.3%、66% 和 50%。这些结果证实了先前的结果，且每个脑组织中至少有三个被分离的结构呈 RABV 阳性。图 1 展示了一个典型的 DAF 染色阳性结果。

图2显示了使用Loza-Rubio等人首次报道的引物扩增RABV N基因片段（步骤5.5）的结果11。这表明用于扩增的材料质量良好。

PCR扩增片段的大小如图3所示。标准曲线的方程反映了样品中RABV遗传物质含量与PCR扩增片段大小之间的关系。通过将Ct值代入图4所示方程，在标准曲线上进行插值，可推算出RABV遗传物质的含量（单位为ng）。根据该方程，检测限为1 × 105<...

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讨论

既往研究表明，直接荧光抗体法（DFA）仅能在样本于室温（21 °C）保存七天内检测到狂犬病病毒（RABV）14。相比之下，本研究显示，逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）的灵敏度在样本暴露于室温12天后开始下降。因此，实时定量逆转录PCR（qRT-PCR）可在样本暴露于室温长达23天后仍检测到RABV基因组。这表明qRT-PCR对高度降解的样本具有相对更高的检测灵敏度。然而，仍有必要开发出不降低特异性的更简便检测方法25。本研究展示了一种分子检测方法，其灵敏度高于DFA，依据在于该方法能够不受特定脑组织结构影响而检测到病毒基因组。

多项科学研究已强调了RT-PCR技术在检测病原体方面的优势。然而，该技术也存在一些缺点，例如执行成本较高，因其需要专用设备。操作分子生物学检测需要经过培训的专业人员。此外，需要指出的是，由于该技术具有高度敏感性，某些步骤对于获得最佳结果至关重要。其中之一便是RNA提取过程中对样本的正确处理。此步骤极为关键，因为RNA容易降解，从而可能影响实验结果。建议在操作过...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由国家农业、林业和畜牧业研究所（INIFAP）资助。我们感谢Jerzayn Fraustro Esquivel在制作本文件相关视频过程中提供的合作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯仿SIGMAC7559有助于回收被石蜡油覆盖的PCR反应中的水相。
DNA Clean & Concentrator-500ZimoD4031DNA Clean & Concentrator-500（DCC-500）专为快速、大规模纯化和浓缩高质量DNA而设计，最多可处理500 µg DNA，适用于大规模限制性内切酶消化产物及不纯DNA样品的处理。
乙醇Amresco193-500用于核酸的纯化
FastStart High Fidelity PCR System试剂盒，dNTPackRoche3553400001高保真酶，用于扩增PCR产物，避免随机碱基错配
GelDoc XRBioRadXR+用于分析较大尺寸的蛋白质和DNA凝胶
GelRedBiotium41003新一代核酸凝胶染料，具有新颖的化学结构，旨在最大限度减少染料与活细胞中核酸相互作用的可能性。
iCycler Thermal Cycler GradientBioRad582BR可通过仪器算法、样品内探针或样品模块模式监控和控制温度
iTaq Universal Probes One-Step试剂盒BioRad1725141用于实时PCR反应的反应混合物，采用TaqMan型杂交探针
异丙醇Amresco0918-500用于核酸沉淀
QIAquick凝胶回收试剂盒Qiagen28706QIAquick试剂盒包含硅胶膜组件，可在高盐缓冲液中结合DNA，并用低盐缓冲液或水洗脱。该纯化流程可去除DNA样品中的引物、核苷酸、酶、石蜡油、盐类、琼脂糖、溴化乙锭及其他杂质
M-MLV逆转录酶Invitrogen28025-021莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLV RT）在引物存在下，以单链RNA或DNA为模板合成互补
DNA链。
NanoDrop 2000Thermo-ScientificND2000微量分光光度计
oligo(dT)18引物InvitrogenSO132oligo(dT)18引物是一种合成的单链18聚体寡核苷酸，具有5'-和3'-羟基末端。
RiboMAX大规模RNA生产系统试剂盒 SP6和T7PromegaP1300体外转录反应用于从重组DNA模板合成微克级RNA探针。大多数用于生成RNA探针的转录反应均经过优化，以最大化放射性标记核糖核苷酸的掺入，而非大量生产RNA
Taq DNA聚合酶Invitrogen#EP0402Taq DNA聚合酶是一种来源于嗜热细菌水生栖热菌（Thermus aquaticus）的高度耐热DNA聚合酶。该酶催化DNA的5’至3’合成
 
TRIzol试剂Invitrogen15596026TRIzol试剂是一种完整且即用型的试剂，专为从多种生物样品中分离高质量总RNA，或同时分离RNA、DNA和蛋白质而设计。

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