定量分析不同牛脑结构中的狂犬病病毒

摘要

本方案介绍了一种基于qRT-PCR的方法，通过体外转录技术测定牛脑不同解剖结构中狂犬病病毒核蛋白（N）基因的拷贝数。

摘要

牛麻痹性狂犬病（BPR）是一种病毒性脑炎，对整个拉丁美洲具有重大的经济影响，并构成主要的人畜共患风险。本研究的目的是利用实验室方案，通过定量实时反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测牛脑不同解剖结构中狂犬病病毒（RABV）基因组的相对拷贝数。qRT-PCR通过扩增后产生的荧光信号来定量样本中特定基因拷贝的数量，该荧光信号与样本中目标核酸的含量成正比。该方法具有耗时短、污染风险低以及相较于其他技术更易于检测不同样本中病毒核酸的优点。六只感染狂犬病动物的脑组织被分为六个解剖结构，分别为海马、小脑、皮层、延髓、脑桥和丘脑。所有脑组织均通过直接免疫荧光试验确认为RABV抗原阳性。同时，也检测了四只RABV阴性牛脑组织中相同解剖结构。从每个结构中提取RNA并用于qRT-PCR分析。通过体外转录的核蛋白基因进行检测，以确定RABV基因的拷贝数。用于定量病毒RNA的标准曲线显示扩增效率为100%，线性相关系数为0.99。分析结果表明，皮层、延髓和丘脑是检测RABV最理想的中枢神经系统部位，因为这些结构中RABV含量最高。该检测的特异性为100%，所有样本均为阳性，未检测到假阳性结果。该方法可用于在BPR诊断过程中检测含有低水平RABV的样本。

引言

狂犬病可通过多种技术在发病期间（ante-mortem）和死亡后（post-mortem）进行确诊，这些技术能够检测脑组织、皮肤、尿液或唾液中的病毒核酸¹。分子检测方法主要通过检测狂犬病病毒核蛋白（N）基因来进行诊断，该基因也用于病毒的基因分型。在动物中，可使用受感染脑组织的任意部分进行狂犬病诊断；然而，若要排除狂犬病的可能性，则必须至少检测脑部两个不同区域的组织样本²。目前存在多种用于动物狂犬病检测的诊断方法，但直接免疫荧光试验仍是标准参考技术³。其他检测方法包括小鼠接种试验、组织培养感染试验以及聚合酶链式反应（PCR）⁴。世界卫生组织（WHO）和世界动物卫生组织（OIE）分别推荐上述所有技术用于人和动物的狂犬病诊断⁵。

近年来，核酸检出与扩增技术彻底改变了狂犬病的诊断方式⁶，这些技术在人狂犬病的ante mortem（生前）诊断中发挥着重要作用。已有多种基于PCR的检测方法被评估，用于补充传统的ante-mortem（生前）和post-mortem（死后）狂犬病诊断方法

方案

本研究经动物实验伦理委员会（CENID-MA动物微生物学国家研究与纪律中心，IACUC）批准，并严格遵循其关于动物使用的建议进行。

1. 样品

1. 采用6个狂犬病阳性牛脑的不同脑区组织进行RT-PCR分析。

2. 直接荧光抗体法（DFAs）检测以确诊狂犬病

注意：通过直接荧光抗体法（DFA）检测狂犬病抗原是一种定性方法，用于检测狂犬病病毒核蛋白的存在，其原理是使用荧光素标记的抗体。本实验按照 Dean 等人（1966）²⁰ 提供的方案进行，具体步骤如下。

1. 从不同脑结构中分离的每种组织，在直径约15 mm的无菌载玻片上制备两个印迹。使用木制涂片棒将约3 mm³的组织涂抹在无菌载玻片上。通过手动轻轻按压木制涂片棒与载玻片接触，以形成涂片。
2. 将样本涂片载玻片浸入-20 °C的100%丙酮中固定1小时。孵育后，在21 °C下用干燥布料干燥30分钟。
3. 通过注射器滴加50 µL荧光素标记的抗核蛋白抗体至每张脑组织涂片，按1:10比例稀释。
4. 将载玻片置于湿盒中，在37 °C下与结合物孵育1小时。
5. 孵育后，用蒸馏水和PBS洗涤载玻片两次，以去除未结合的结合物。在21 °C下让载....

结果

DFA 检测结果显示，大脑皮层、丘脑、延髓、脑桥和角的 RABV 阳性率分别为 100%、100%、83.3%、66% 和 50%。这些结果证实了先前的结果，且每个脑组织中至少有三个被分离的结构呈 RABV 阳性。图 1 展示了一个典型的 DAF 染色阳性结果。

图2显示了使用Loza-Rubio等人首次报道的引物扩增RABV N基因片段（步骤5.5）的结果¹¹。这表明用于扩增的材料质量良好。

PCR扩增片段的大小如图3所示。标准曲线的方程反映了样品中RABV遗传物质含量与PCR扩增片段大小之间的关系。通过将Ct值代入图4所示方程，在标准曲线上进行插值，可推算出RABV遗传物质的含量（单位为ng）。根据该方程，检测限为1 × 10^5<.......

讨论

既往研究表明，直接荧光抗体法（DFA）仅能在样本于室温（21 °C）保存七天内检测到狂犬病病毒（RABV）¹⁴。相比之下，本研究显示，逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）的灵敏度在样本暴露于室温12天后开始下降。因此，实时定量逆转录PCR（qRT-PCR）可在样本暴露于室温长达23天后仍检测到RABV基因组。这表明qRT-PCR对高度降解的样本具有相对更高的检测灵敏度。然而，仍有必要开发出不降低特异性的更简便检测方法²⁵。本研究展示了一种分子检测方法，其灵敏度高于DFA，依据在于该方法能够不受特定脑组织结构影响而检测到病毒基因组。

多项科学研究已强调了RT-PCR技术在检测病原体方面的优势。然而，该技术也存在一些缺点，例如执行成本较高，因其需要专用设备。操作分子生物学检测需要经过培训的专业人员。此外，需要指出的是，由于该技术具有高度敏感性，某些步骤对于获得最佳结果至关重要。其中之一便是RNA提取过程中对样本的正确处理。此步骤极为关键，因为RNA容易降解，从而可能影响实验结果。建议在操作过.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯仿	SIGMA	C7559	有助于回收被石蜡油覆盖的PCR反应中的水相。
DNA Clean & Concentrator-500	Zimo	D4031	DNA Clean & Concentrator-500（DCC-500）专为快速、大规模纯化和浓缩高质量DNA而设计，最多可处理500 µg DNA，适用于大规模限制性内切酶消化产物及不纯DNA样品的处理。
乙醇	Amresco	193-500	用于核酸的纯化
FastStart High Fidelity PCR System试剂盒，dNTPack	Roche	3553400001	高保真酶，用于扩增PCR产物，避免随机碱基错配
GelDoc XR	BioRad	XR+	用于分析较大尺寸的蛋白质和DNA凝胶
GelRed	Biotium	41003	新一代核酸凝胶染料，具有新颖的化学结构，旨在最大限度减少染料与活细胞中核酸相互作用的可能性。
iCycler Thermal Cycler Gradient	BioRad	582BR	可通过仪器算法、样品内探针或样品模块模式监控和控制温度
iTaq Universal Probes One-Step试剂盒	BioRad	1725141	用于实时PCR反应的反应混合物，采用TaqMan型杂交探针
异丙醇	Amresco	0918-500	用于核酸沉淀
QIAquick凝胶回收试剂盒	Qiagen	28706	QIAquick试剂盒包含硅胶膜组件，可在高盐缓冲液中结合DNA，并用低盐缓冲液或水洗脱。该纯化流程可去除DNA样品中的引物、核苷酸、酶、石蜡油、盐类、琼脂糖、溴化乙锭及其他杂质
M-MLV逆转录酶	Invitrogen	28025-021	莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLV RT）在引物存在下，以单链RNA或DNA为模板合成互补 DNA链。
NanoDrop 2000	Thermo-Scientific	ND2000	微量分光光度计
oligo(dT)18引物	Invitrogen	SO132	oligo(dT)18引物是一种合成的单链18聚体寡核苷酸，具有5'-和3'-羟基末端。
RiboMAX大规模RNA生产系统试剂盒 SP6和T7	Promega	P1300	体外转录反应用于从重组DNA模板合成微克级RNA探针。大多数用于生成RNA探针的转录反应均经过优化，以最大化放射性标记核糖核苷酸的掺入，而非大量生产RNA
Taq DNA聚合酶	Invitrogen	#EP0402	Taq DNA聚合酶是一种来源于嗜热细菌水生栖热菌（Thermus aquaticus）的高度耐热DNA聚合酶。该酶催化DNA的5’至3’合成
TRIzol试剂	Invitrogen	15596026	TRIzol试剂是一种完整且即用型的试剂，专为从多种生物样品中分离高质量总RNA，或同时分离RNA、DNA和蛋白质而设计。