本研究建立了一种利用连接在实验小鼠上的胶囊装置对硬蜱若虫和幼虫阶段进行饲喂的系统。该饲喂胶囊由柔性材料制成，可牢固地附着在小鼠身上至少一周，便于对蜱虫的吸血过程进行舒适且持续的观察。
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本文内容
摘要
摘要
蜱虫在发育的各个阶段（卵除外）均为专性吸血寄生虫，并被公认为多种病原体的传播媒介。在蜱虫研究中，小鼠模型的应用对于理解其生物学特性以及蜱-宿主-病原体之间的相互作用至关重要。本文展示了一种在实验小鼠上饲养硬蜱幼虫和若虫阶段的简便方法。该方法的优势在于操作简单、耗时短，并可在实验的不同时间点对蜱虫进行监测或采集。此外，该技术允许在同一小鼠身上同时固定两个独立的胶囊装置，适用于需要两种不同蜱虫群体在同一动物身上吸血的多种实验设计。该胶囊无刺激性且具有柔韧性，由易于获取的材料制成，可最大程度减少实验动物的不适。更重要的是，实验过程中无需实施安乐死，小鼠在实验结束后可完全恢复，且可重复使用。
引言
蜱是多种病原体的重要传播媒介，对动物和人类健康构成严重威胁1。在研究蜱的生物学特性、蜱-宿主-病原体相互作用或建立有效防控措施时，建立高效的摄食系统至关重要。目前已有多种无需使用活体动物的蜱人工饲喂系统可供选择2,3,4，只要实验条件允许，应优先采用这些系统。然而，在某些实验条件下，这些人工系统无法充分模拟特定的生理特征，必须使用活体动物才能获得可靠的研究结果。
实验室小鼠常用于多种生物系统的研究，并被常规用作蜱虫吸血的宿主5,6,7,8,9。使未成熟蜱虫在小鼠身上吸血的两种最常用方法包括自由寄生法和使用固定在小鼠身上的限制性装置。自由寄生法主要适用于幼虫阶段，吸饱血的蜱虫可自行脱落至回收区域以便收集。限制性装置通常由丙烯酸或聚丙烯制成的盖帽组成，并用胶水粘附于小鼠背部。第一种方法是一种有效的自然吸血系统，但由于蜱虫分散在宿主身体的不同部位，实验过程中无法对其进行密切监测。此外，脱落至回收区域的饱血蜱虫可能被粪便和尿液污染10,11,12,13,14，这会严重影响蜱虫的健康状况；若动物与回收区域之间无有效隔离，蜱虫还可能被小鼠压伤或吃掉15。基于装置的系统可将蜱虫限制在特定区域，但粘合过程费时费力，且盖帽往往与胶水粘附不牢，在实验过程中容易脱落16,17,18,19。此外，这些盖帽质地坚硬，使小鼠感到不适，并会引起皮肤反应，因此实验后无法再次使用这些小鼠，必须实施安乐死。
在我们之前的研究中，我们成功开发了一种有效的系统，使用由乙烯-醋酸乙烯酯（EVA）泡沫制成的饲养室，在实验兔上喂养蜱虫20。在此，我们将该系统改进并应用于小鼠模型，提出一种简单且洁净的方法，利用EVA泡沫制成的密闭胶囊饲养未成熟硬蜱阶段。具体而言，本系统采用弹性EVA泡沫胶囊，通过快干（3分钟）、无刺激性的乳胶胶水将其粘附于脱毛后的小鼠背部。该技术可确保胶囊在实验小鼠身上牢固且持久地固定，同时在整个实验过程中实现有效的蜱虫寄生/收集。该扁平胶囊由柔性材料制成，不妨碍对小鼠进行采血或其他操作时的抓握与处理。该系统主要适用于若虫期蜱虫的饲养，但经过轻微调整后也可用于幼虫期蜱虫的饲养。该方法可由一名经验丰富的操作者独立完成，无需 extensive 培训。
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方案
请注意，本方案仅可在实验室满足所有福利和安全措施的前提下应用。本方案已获得动物实验伦理委员会ComEth Anses/ENVA/UPEC批准用于蜱虫喂养实验，许可编号为E 94 046 08。在实验终点，动物分别暴露于CO2中两个阶段，每次持续4分钟和5分钟，共计9分钟。
1. 胶囊的制备
- 将2 mm厚的EVA泡沫与双面胶泡沫粘合在一起（图1A）。
- 使用直径为20 mm的皮革打孔器，从粘合好的泡沫上切下一个圆形；然后使用直径为12 mm的打孔器，切去内部部分，制成双层泡沫圆环（图1B）。
注意：胶囊的边框厚度应大于3 mm，以确保与宿主皮肤粘合时有足够的粘接面积（见下文）。 - 撕下双面胶泡沫上的保护纸条（图1C），并将一个直径为20 mm的透明圆形塑料片贴附其上（图1D）。
注意：若用于饲喂幼虫，则不要撕下双面胶泡沫上的保护纸条，直接进入实验方案中的步骤2。将包含保护纸条的双层泡沫环直接粘贴到小鼠身上。 - 在透明塑料片上切一个约1 cm长的切口（图1E）。
- 使用昆虫学用针刺出至少10个小孔（图1F），以便在实验过程中排出多余湿气。
注意：该胶囊（图1G）总高度为4 mm（2 mm EVA泡沫加2 mm胶粘泡沫），可用于饲喂所有硬蜱种类的若虫和幼虫。胶囊外径为20 mm（图1H），适用于大多数小鼠品系，必要时可进行调整。
2. 蜱虫感染前小鼠的准备
注意：本研究中，使用10至12周龄的雌性实验小鼠（品系为C57BL/6和BALB/cByJ），饲养于标准鼠笼中，自由提供食物和饮水 随意摄取 （绿色线条通风笼架，负压20 Pa）位于法国食品、环境与职业健康机构 & 安全（ANSES）认证的动物设施中，位于法国马松-阿尔福。动物由经验丰富的技术人员每天监测两次，以检查任何异常皮肤反应、健康问题或并发症。
- 将小鼠置于诱导室中，用异氟烷进行麻醉。麻醉后，将小鼠放置于操作垫上，并连接鼻罩以持续供应异氟烷（图2A）。监测呼吸频率，并调节异氟烷浓度，确保呼吸频率低于每分钟80次。
注意：操作前如需对个体小鼠进行标记，可采用纹身或射频识别芯片。建议将各小鼠单独饲养于不同笼中，以避免因啃咬导致胶囊损坏。 - 剃除小鼠肩胛骨后方至耳后区域的前部毛发（图2A）。
注意：剃毛区域应大于胶囊的接触面。 - 在已准备好的胶囊EVA泡沫部位均匀涂抹无刺激性乳胶胶水，静置1分钟（图2B）。
- 用手指对胶囊背部施加约3分钟的轻柔持续压力，将其粘附于小鼠背部（图2C），尤其注意胶囊左右两侧的贴合。轻轻抬起胶囊，目视检查其与皮肤的粘附情况。若发现未粘牢区域，可用刮刀补涂胶水，并再按压3分钟。
3. 蜱虫寄生
- 对于若虫侵染，通过步骤1.4中制作的切口将单个若虫引入胶囊内。 (图 2D).
注意：对于 Ixodes 每胶囊建议最多放置20只若虫。 - 从两侧轻轻挤压胶囊，使透明塑料弯曲，以便使用精细解剖镊更轻松地放入单个若虫图 2D）。通过胶囊的切口将单个若虫推入胶囊内。进入后，将镊子旋转90˚，然后抽出镊子，使蜱虫留在胶囊内。
- 对于幼虫侵扰，从附着的胶囊上取下纸条（图2E）。将含有幼虫的注射器放置图 2F），直接在囊内推动注射器活塞以释放蜱虫。轻轻反向旋转活塞，使附着的剩余幼虫脱离皮肤。
注意：实验前将幼虫放入一支1 mL注射器中，注射器末端切口用一小块棉花塞住。 - 幼虫被放置到皮肤上后，通过安装透明塑料片将胶囊闭合图 2G).
- 将保护性塑料带缠绕在胶囊周围（图 2H).
注意：保护性塑料环在整个实验过程中显著提高了胶囊的耐久性（图2I,J）。可以将两个胶囊连接到同一只小鼠上（图2K在此情况下，胶囊之间至少需保持3 mm的间距，且应相应扩大脱毛区域。 - 将小鼠放回笼中。
4. 蜱虫的采集
- 按照上述步骤 2.1 对小鼠进行麻醉。
- 使用解剖刀在塑料膜上切出一个十字形切口（图 3A）。
注意：该十字形切口便于收集饱血蜱虫，或在必要时移除正在吸血的蜱虫。 - 如需关闭胶囊，可用一块粘性塑料贴片贴在透明塑料膜上以密封（直径 20 mm，图 3B）。
注意：若需在多个时间点收集蜱虫，可重复使用同一块粘性贴片。根据实验要求，也可对小鼠实施安乐死，取下胶囊，并收集或分离蜱虫（图 3C）。
5. 小鼠的恢复
- 将小鼠继续饲养在笼中一周。
- 让胶囊自然脱落。
注意：在此情况下，胶囊大约需要 8–9 天脱落。当胶囊脱落后，重要的是检查小鼠皮肤是否有异常反应。如果出现刺激，可涂抹润肤乳液，但通常无需特殊处理。如果符合伦理规范，恢复后的小鼠（图 3D）可再次用于其他蜱虫感染实验或不同的实验。
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结果
我们提出了一种在小鼠背部应用EVA泡沫胶囊饲喂未成熟硬蜱各阶段的详细逐步操作方法（图2）。该方法操作简便，适用于需要对蜱虫进行精确监测和收集的多种实验。此方法的主要优势在于其简单性、材料易得且成本低廉，以及操作耗时短。此外，我们成功地在同一只小鼠个体上固定了两个胶囊（图2K），从而可在同一动物身上同时饲喂两组不同的蜱虫。使用高效、快干且无刺激性的乳胶胶水，可确保胶囊在3分钟内牢固粘附。胶囊可稳定附着至少一周（图2J），足以满足大多数未成熟硬蜱种类完成吸血所需的时间21,22,23,24。由于胶囊具有弹性，后续对小鼠进行采血或其他操作时极为方便。该方法还可在实验结束后实现小鼠的完全恢复（
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讨论
该方案中最关键的步骤是将胶囊牢固地粘附在小鼠皮肤上。因此，应将乳胶胶水均匀地涂在整个胶囊的EVA泡沫表面，并持续施加压力3分钟，尤其注意胶囊的左侧和右侧。我们还建议将胶囊尽可能向前放置于背部，以避免小鼠用后肢将其抓掉。在我们的实验中，仅验证了EVA泡沫与乳胶胶水在小鼠皮肤上的粘附效果，若使用其他材料，无法保证获得相同的结果。
在实验过程中，前七天内未观察到胶囊从皮肤上脱落的情况。我们强烈建议使用塑料带保护胶囊的外表面（图2H）。如果在蜱虫吸血过程中保护带受损，可更换新的保护带。可根据不同小鼠品系的体型调整胶囊的直径。建议每天至少两次监测取食中的蜱虫，并在蜱虫脱落后立即收集，以避免其干燥。
寄生蜱的数量受胶囊直径以及宿主体型的限制。在我们的实验中，每只小鼠最多使用20只若虫或100只I. ricinus幼虫。对于体型较大的蜱种，如Amblyomma或Hyalomma sp.等，应减少寄生蜱的数量，以避免因失血对宿主造...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢法国国家农业食品与环境研究院（INRAE）的 Alain Bernier 和法国食品、环境与职业健康安全局（ANSES）的 Océane Le Bidel 提供的技术支持。本研究由法兰西岛大区“同一健康”研究计划（DIM One Health - Région Île-de-France）资助（项目简称：NeuroPaTick）。实验小鼠由法国食品、环境与职业健康安全局（ANSES）采购。感谢 Jeffrey L. Blair 博士对论文早期版本的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2 mm厚EVA泡沫（低密度） | 角色扮演服装店 | EVA-45kg（950/450/2 mm） | 也可通过亚马逊购买（货号：B07BLMJDXD） |
| 热缩管电线包裹套管 31毫米/1.22英寸 | 亚马逊 | B0848S3S6T | 不同直径的热缩管可通过亚马逊购买。 |
| 小鼠 BALB/cByJ | 查尔斯河实验室 | 菌株编号 627 | |
| 小鼠 C57BL/6 | Charles River | 菌株编号 664 | |
| 无毒乳胶胶水 | 撕裂修复器 | 织物 &和皮革粘合剂 | 也可通过亚马逊购买（货号：B001RQCTUU） |
| 打孔工具 手工工具 艺术工具 | 亚马逊 | B07QPWNGBF | 由亚马逊销售的皮革加工工具 1-25 毫米圆形钢制皮革裁切器，适用于皮带 Strap |
| PVC 透明装订封套 | 亚马逊 | B078BNLSNP | 厚度在 0.150 mm 至 0.180 mm 之间的任何透明 PVC 片材均可使用 |
| 自粘垫海绵双面涂覆泡沫胶带 | 亚马逊 | B07RHDZ35J | 由亚马逊销售，2卷双面泡沫胶带，超强白色 mounting tape 泡沫 |
| 透明密封贴纸（直径 20 mm 的圆形） | 亚马逊 | B01DAA6X66 |
参考文献
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