方法文章

超分辨率成像研究原发神经元中蛋白质和突触标记的共同定位

DOI：

10.3791/61434

⸱

2020年10月31日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 2Department of Neuroscience, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 3Dulbecco Telethon Institute, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS

本文内容

摘要

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该协议演示了如何使用超分辨率显微镜来研究蛋白质在原发神经元培养物中的共定位。

摘要

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突触是神经元的功能元素，其缺陷或损失是几种神经退行性和神经性疾病的基础。成像研究被广泛用于研究其在生理和病理条件下的功能和可塑性。由于其尺寸和结构，蛋白质的定位研究需要高分辨率成像技术。在该协议中，我们描述了一个程序，用于研究在初级神经元中使用结构化照明显微镜 （SIM） 在超分辨率级别使用突触标记的目标蛋白质的共同定位。SIM 是一种图案照明技术，可使广场显微镜的空间分辨率翻倍，细节达到 100 nm 左右。该协议指示强大的联合本地化研究所需的控制和设置，并概述正确分析成像数据的统计方法。

引言

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自从1897年福斯特和谢林顿在1897年第一次描述突触以来，对突触的理解和看法发生了巨大的变化。从那时起，我们对神经元交流的知识及其背后的分子过程呈指数级增长。很明显，突触可以被认为是一个双隔间系统:一个包含用于释放神经递质的囊泡的突触前隔间，以及一个具有受体3的突触后隔间。在过去的二十年里，这种简单化的观点已经演变成一个复杂的蛋白质网络，这些蛋白质是将发射机结合成信号4所需的蛋白质。

理解的收获部分是由于超分辨率技术，克服了传统光显微镜的衍射极限，以适应突触的尺寸更好5，6，7，8，9，10。6,7,8,9,105由于衍射限制，光学显微镜不能达到分辨率超过200纳米横向11，12。11,

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方案

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1. 主要文化

  1. 培养小鼠海马原神经元在室盖玻片（如伊比迪μ-滑动8井或N得不好实验室-Tek室盖玻璃），符合#1.5（0.17毫米）盖玻片厚度的客观要求。
  2. 涂覆室盖玻片，带 100 μL 聚 L-lysine （100 μg/mL）。
  3. 第二天，用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗两次室盖玻片。
  4. 要获得小鼠原发神经元，请将海马从P1-P4幼崽23中分离。
  5. 将解剖的海马放在10 mL的解剖介质（表1）中，并把它们放在管的底部。
  6. 使用无菌移液器，小心地去除解剖介质，使海马在管底不受干扰。
  7. 将10 mL的介质1（表1）加入海马，在37°C下孵育30分钟。
  8. 使用无菌移液器，小心地取出介质 1，使海马在管底不受干扰。
  9. 加入10 mL的介质2（表1），将（封盖）离心管水平放在发动机罩下45分钟。
  10. 让离心管垂直站立，让组织在管的底部沉淀。
  11. 使用无菌移液器，小心地取出介质 2，使海马在离心管底部不受干扰。
  12. 添加 2 mL 的介质 3 （表 1）
  13. 使用带过滤尖端的 p1000 移液器，机械地将细胞与组织分离。

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结果

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我们在这里介绍研究神经元蛋白共同定位的标准工作流程。我们首先校准了显微镜，然后对样品进行了 SIM 分析。为了校准系统，我们使用直径为0.1 μm的荧光微球。在获取珠子的超解析 3D-SIM 图像后，对底层图像数据进行 Fourier 转换，以将其重新转换为空间频率表示。在图2A中，不同的花型显示为超分辨率细节水平的指示。接下来，我们测量了通过计算单个珠的强度轮廓峰值（图2B，C）的半最大值（FWHM）的全宽来达到的分辨率。最后，我们再次使用荧光微球（图3A，B）通过通道注册纠正了色差。接下来，我们开始分析样本的100倍目标，我们获得了3D-SIM图像。我们使用 SIMCHECK 评估采集过程中场光或运动的均匀性（图 4A）。我们检查了照明模式角度之间的强度差异（图4B），并.......

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讨论

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阐明突触的结构和组成对于理解调节记忆和认知的生理和病理过程至关重要。虽然在正常状态下，突触是记忆的积木，它们也是复杂的神经系统疾病（如阿尔茨海默氏症32）的根据。此处描述的协议用于研究神经元蛋白与称为 SIM 的超分辨率显微镜技术的共同定位。使用特定的照明模式，SIM 可以达到约 0.1 μm 的分辨率，这适用于研究突触，通常测量在 0.03 和 0.15 μm 之间。对于更详细的，其他超分辨率技术，如STED（刺激发射耗竭显微镜），PALM（光激活的定位显微镜）或风暴（随机光学重建显微镜），可以达到10-20纳米的分辨率，可以应用33。

在这里，我们描述了目标蛋白与初级神经元中突触标记的共同定位分析。该协议可以应用于神经元细胞的任何原生培养物，如海马、小脑或皮质神经元，甚至适用于不属于中枢神经系统的原发神经元培养物，如肠神经系统神经元。然而，在超分辨率级别进行分析的关键是采集过程中使用的试剂，如与目标衍射指数兼容的室盖玻片和安装解决方案。我们使用室盖玻片来方便使用，但涂层盖玻璃上生长原.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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作者感谢爱德华多·米科蒂对手稿的建设性批评。这项研究得到了B brightFocus A2019296F、Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo （LC）、Fdazione 区域每拉赖斯卡生物医学组织 （Care4NeuroRare CP_20/2018） （CN） 和玛丽·斯科多夫斯卡-居里创新培训网络 （JK） 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.4% 台盼蓝溶液 Thermo Fisher Scientific15250061化学
70 µM 滤镜 康宁352350Equiment
AlexaThermo Fisher Scientific-抗体
SENP1Santa Cruzsc-271360抗体
B27 补充剂Life Technologies17504044化学
血清白蛋白 Merck5470化学
CaCl2Merck Life Science21115化学
室盖玻片Ibidi80826Equiment
DyLightThermo Fisher Scientific抗体
FBS（海克隆）GIBCOSH3007002 （CHA1111L）血清
FluoSpheres 羧酸盐修饰的微球，0.1 &μ;m， 黄色–绿色荧光Thermo Fisher ScientificF8803Equiment
GlucoseMerck Life ScienceG8769化学
GlutamaxGIBCO35050061化学
HEPESMerck Life ScienceH3537化学
-半胱氨酸 默克生命科学 C6852-25g化学
MAP2默克AB15452抗体
MEM Life Technologies21575022中等
MgClMerck Life ScienceM8266
NaOHVWR International1,091,371,000
Neurobasal ALife Technologies10888022中等
N-SIM超分辨率显微镜尼康仪器
木瓜蛋白酶 Merck Life Science P-3125化学
多聚甲醛 Thermo Fisher Scientific28908化学
笔/链球菌10xLife Technologies15140122化学
磷酸盐缓冲盐水 Gibco10010023化学
Poly-L赖氨酸SigmaP2636
ProLong金刚石玻璃抗淬灭封片剂Thermo Fisher ScientificP36970
PSD95 NeuroMabK28/43抗体
圆形盖玻片Thermo12052712Equiment
SUMO1Abcamab32058抗体
触素 默克S5768 抗体
Triton X-100 MerckT8787化学
胰蛋白酶抑制剂 默克生命科学 T9003-500MG化学
牛L化学化学化学化学突

参考文献

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  1. Foster, M., Sherrington, C. S. A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).
  2. Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
  3. McAllister, A. K.

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