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超高分辨率成像研究原代神经元中蛋白质与突触标志物的共定位

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DOI：

10.3791/61434

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2020年10月31日

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1Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 2Department of Neuroscience, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 3Dulbecco Telethon Institute, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS

本文内容

摘要

本方案展示了如何利用超分辨率显微镜研究原代神经元培养物中蛋白质的共定位。

摘要

突触是神经元的功能单元，其缺陷或丢失是多种神经退行性疾病和神经系统疾病的基础。成像研究被广泛用于探究突触在生理和病理条件下的功能与可塑性。由于突触的尺寸和结构特点，对蛋白质进行定位研究需要高分辨率成像技术。在本实验方案中，我们描述了一种利用结构光照明显微镜（SIM）在原代神经元中以超分辨率水平研究目标蛋白与突触标志物共定位的方法。SIM 是一种采用模式化光照的技术，可使宽场显微镜的空间分辨率提高一倍，达到约 100 nm 的精细程度。本方案列出了进行可靠共定位研究所需对照和设置，并概述了正确分析成像数据的统计方法。

引言

自 Foster 和 Sherrington 于 1897 年首次描述突触以来，人们对突触的理解和认识发生了巨大变化1。此后，我们对神经元通讯及其背后分子过程的认识呈指数级增长2。目前明确，突触可被视为一个双区室系统：包含用于释放神经递质囊泡的突触前区室，以及带有受体的突触后区室3。在过去二十年中，这一简化的观点已发展为一个复杂的蛋白质网络，这些蛋白质负责将递质结合转化为信号传导4。

理解上的进展部分得益于超分辨率技术，这些技术克服了传统光学显微镜的衍射极限，更适用于突触尺度的观察5,6,7,8,9,10。由于衍射极限的存在，光学显微镜在横向上的分辨率无法超过200 nm11,12....

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方案

1. 原代培养

  1. 在符合 #1.5（0.17 mm）盖玻片厚度要求的带孔盖玻片培养皿（如 Ibidi µ-Slide 8 Well 或 Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass）中培养小鼠海马原代神经元。
  2. 用 100 µL 多聚-L-赖氨酸（100 µg/mL）包被带孔盖玻片。
  3. 次日，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤带孔盖玻片两次。
  4. 为获取小鼠原代神经元，从小鼠出生后第1至第4天（P1-P4）的幼鼠中分离海马组织23。
  5. 将解剖得到的海马组织置于 10 mL 解剖培养基（表 1）中，静置使其沉降至管底。
  6. 使用无菌移液管小心吸除解剖培养基，保持海马组织静止于管底。
  7. 向海马组织中加入 10 mL 培养基1（表 1），在 37 °C 下孵育 30 分钟。
  8. 使用无菌移液管小心吸除培养基1，保持海马组织静止于管底。
  9. 加入 10 mL 培养基2（表 1），将（加盖）离心管水平放置于生物安全柜中 45 分钟。
  10. 将离心管竖直放置，使组织沉降至管底。
  11. 使用无菌移液管小心吸除培养基2，保持海马组织静止于管底。
  12. 加入 2 mL 培养基3（

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结果

我们在此介绍了研究神经元蛋白共定位的标准工作流程。首先对显微镜进行校准，随后对样品进行SIM分析。为校准系统，我们使用了荧光微球 0.1 μm 直径。获得珠子的超分辨3D-SIM图像后，将原始图像数据进行傅里叶变换，以重新转换为空间频率表示形式。在 图2A，独特的花朵图案呈现出超分辨率细节水平的指示。接下来，我们通过计算单个微珠强度分布峰值的半高全宽（FWHM）来测量所实现的分辨率（图2B，C）。最后，我们再次使用荧光微球通过通道配准来校正色差图3A，B）。接下来，我们使用100倍物镜开始对样品进行分析，并采集了3D-SIM图像。我们利用SIMCheck评估成像过程中照明场的均匀性或样品是否发生移动（图 4A）。我们检测了不同照明模式角度之间的强度差异（图4B）我们.......

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讨论

阐明突触的结构与组成对于理解调控记忆和认知的生理及病理过程至关重要。在正常状态下，突触是记忆的基本构成单元，同时也与阿尔茨海默病等复杂的神经系统疾病密切相关32。本文所述的实验方案旨在利用一种称为SIM（结构光照明显微镜）的超分辨率显微成像技术，研究神经元蛋白的共定位情况。SIM通过特定的照明模式，可实现约0.1 μm的分辨率，适用于研究通常大小在0.03至0.15 μm之间的突触。若需更高细节，还可采用其他超分辨率技术，如STED（受激发射损耗显微镜）、PALM（光激活定位显微镜）或STORM（随机光学重建显微镜），这些技术的分辨率可达10–20 nm33。

本文介绍了在原代神经元中分析靶蛋白与突触标志物共定位的方法。该方案可应用于任何原代神经元细胞培养体系，例如海马神经元、小脑神经元或皮层神经元，甚至也可用于不属于中枢神经系统的原代神经元培养，如肠神经系统神经元。然而，实现超分辨率水平分析的关键在于成像过程中所使用的试剂，例如与物镜折射率匹配的带腔盖玻片和封片介质。我们选用带腔盖玻片.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Edoardo Micotti 对手稿提出的建设性批评。本研究得到了以下资助：BrightFocus A2019296F、Intesa Sanpaolo 集团慈善基金（LC）、伦巴第生物医学研究基金会（Care4NeuroRare CP_20/2018）（CN）、玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里创新培训网络（JK），以及 Telethon 基金会 TCP15011、阿尔茨海默协会 AARG-17-505136（LF）。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.4% 台盼蓝溶液 赛默飞世尔科技15250061化学
70 µm 滤膜 康宁352350设备
Alexa赛默飞世尔科技-抗体
抗体 SENP1圣克鲁斯sc-271360抗体
B27 补充剂Life Technologies17504044化学
牛血清白蛋白 默克5470化学
CaCl2默克生命科学21115化学
带孔盖玻片Ibidi80826仪器
DyLight赛默飞世尔科技-抗体
FBS（Hyclone）GIBCOSH3007002 (CHA1111L)血清
FluoSpheres 羧基修饰微球，0.1 μ米，黄色–绿色荧光赛默飞世尔科技F8803仪器
葡萄糖默克生命科学G8769化学
GlutamaxGIBCO35050061化学
HEPES默克生命科学H3537化学
L-半胱氨酸 默克生命科学 C6852-25g化学
MAP2默克AB15452抗体
MEM Life Technologies21575022培养基
MgCl默克生命科学M8266化学
NaOHVWR International1,091,371,000化学
Neurobasal ALife Technologies10888022培养基
N-SIM 超分辨率显微镜尼康-仪器
木瓜蛋白酶默克生命科学 P-3125化学
多聚甲醛 赛默飞世尔科技28908化学
青霉素/链霉素 10倍液Life Technologies15140122化学
磷酸盐缓冲液 Gibco10010023化学
聚-L-赖氨酸SigmaP2636化学
ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂赛默飞世尔科技P36970化学
PSD95 NeuroMabK28/43抗体
圆形盖玻片赛默飞世尔科技12052712仪器
SUMO1Abcamab32058抗体
突触素 默克S5768 抗体
Triton X-100 默克T8787化学
胰蛋白酶抑制剂 默克生命科学 T9003-500MG化学

参考文献

  1. Foster, M., Sherrington, C. S. A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).
  2. Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
  3. McAllister, A. K.

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SIM MAP2 PSD 95

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