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方法文章

超高分辨率成像研究原代神经元中蛋白质与突触标志物的共定位

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DOI：

10.3791/61434

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2020年10月31日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 2Department of Neuroscience, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 3Dulbecco Telethon Institute, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS

本文内容

摘要

本方案展示了如何利用超分辨率显微镜研究原代神经元培养物中蛋白质的共定位。

摘要

突触是神经元的功能单元，其缺陷或丢失是多种神经退行性疾病和神经系统疾病的基础。成像研究被广泛用于探究突触在生理和病理条件下的功能与可塑性。由于突触的尺寸和结构特点，对蛋白质进行定位研究需要高分辨率成像技术。在本实验方案中，我们描述了一种利用结构光照明显微镜（SIM）在原代神经元中以超分辨率水平研究目标蛋白与突触标志物共定位的方法。SIM 是一种采用模式化光照的技术，可使宽场显微镜的空间分辨率提高一倍，达到约 100 nm 的精细程度。本方案列出了进行可靠共定位研究所需对照和设置，并概述了正确分析成像数据的统计方法。

引言

自 Foster 和 Sherrington 于 1897 年首次描述突触以来，人们对突触的理解和认识发生了巨大变化1。此后，我们对神经元通讯及其背后分子过程的认识呈指数级增长2。目前明确，突触可被视为一个双区室系统：包含用于释放神经递质囊泡的突触前区室，以及带有受体的突触后区室3。在过去二十年中，这一简化的观点已发展为一个复杂的蛋白质网络，这些蛋白质负责将递质结合转化为信号传导4。

理解上的进展部分得益于超分辨率技术，这些技术克服了传统光学显微镜的衍射极限，更适用于突触尺度的观察5,6,7,8,9,10。由于衍射极限的存在，光学显微镜在横向上的分辨率无法超过200 nm11,12。为了突破这一限制，人们开发了多种超分辨率技术，采用不同策略实现了不同的亚衍射极限分辨率，包括：SIM、STED（受激发射损耗显微镜）、PALM（光激活定位显微镜）和STORM（随机光学重建显微镜）13,14。SIM通过在激发光路中插入衍射光栅，使基于激光的宽场显微系统的空间分辨率提高一倍15。可移动的光栅将激光束衍射，形成已知的照明图案，通常是条纹状。这种人为设计的光强分布与样品中荧光染料未知的空间分布叠加，两者产生的干涉条纹编码了常规宽场显微镜无法分辨的细微结构信息。最终的超分辨图像通过数学方法对同一样品在光栅平移和旋转过程中获取的多幅原始图像进行组合与解码而获得。对于2D-SIM，超分辨图像的横向分辨率达到100 nm，轴向分辨率为500 nm15；而对于3D-SIM，横向分辨率为100 nm，轴向分辨率为250 nm16。

鉴于许多神经系统疾病的发生和发展过程中突触功能障碍起着关键作用，对突触的新认识显得尤为重要17,18。阿尔茨海默病、唐氏综合征、帕金森病、朊病毒病、癫痫、自闭症谱系障碍以及脆性X综合征等多种疾病均已被证实与突触的组成、形态和功能异常相关19,20,21,22。

最近，我们利用一组特异性的SUMO抗体，通过SIM技术在超分辨率水平上证实了SUMO蛋白在原代海马神经元中与突触前和突触后标志物突触素（synaptophysin）和PSD95存在共定位23。这使我们能够验证先前通过生物化学和共聚焦显微镜获得的关于SUMO蛋白在神经元中定位的证据。

本文介绍了一种研究小鼠海马区原代神经元中蛋白质定位的实验方案。同时，该方案也可根据需要调整用于其他类型的原代神经元培养。

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方案

1. 原代培养

  1. 在符合 #1.5（0.17 mm）盖玻片厚度要求的带孔盖玻片培养皿（如 Ibidi µ-Slide 8 Well 或 Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass）中培养小鼠海马原代神经元。
  2. 用 100 µL 多聚-L-赖氨酸（100 µg/mL）包被带孔盖玻片。
  3. 次日，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤带孔盖玻片两次。
  4. 为获取小鼠原代神经元，从小鼠出生后第1至第4天（P1-P4）的幼鼠中分离海马组织23。
  5. 将解剖得到的海马组织置于 10 mL 解剖培养基（表 1）中，静置使其沉降至管底。
  6. 使用无菌移液管小心吸除解剖培养基，保持海马组织静止于管底。
  7. 向海马组织中加入 10 mL 培养基1（表 1），在 37 °C 下孵育 30 分钟。
  8. 使用无菌移液管小心吸除培养基1，保持海马组织静止于管底。
  9. 加入 10 mL 培养基2（表 1），将（加盖）离心管水平放置于生物安全柜中 45 分钟。
  10. 将离心管竖直放置，使组织沉降至管底。
  11. 使用无菌移液管小心吸除培养基2，保持海马组织静止于管底。
  12. 加入 2 mL 培养基3（表 1）。
  13. 使用带滤芯的 p1000 移液器，通过机械方式将细胞从组织中解离。
  14. 将含有分离神经元的上清液转移至 15 mL 离心管中。
  15. 将细胞悬液在室温（RT）下以 300 × g 离心 2 分钟。
  16. 离心后，细胞位于离心管底部。使用无菌移液管小心弃去上清液。
  17. 用 1 mL 培养基4 重悬细胞。
  18. 使用 70 µm 滤膜去除未解离的细胞团块。
  19. 在 Bürker 计数板中加入 1 µL 0.4% 台盼蓝溶液至 19 µL 细胞悬液中，计数活细胞。
  20. 以每孔 70,000 个细胞的密度接种，每孔体积为 200 µL。
  21. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育 2 小时，使其贴壁。
  22. 从培养箱中取出带孔盖玻片，小心更换为 200 µL 新鲜培养基。
  23. 将带孔盖玻片继续置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养。
  24. 每 5–7 天更换三分之一的新鲜培养基。
  25. 待海马原代神经元完全成熟（接种后 12–14 天）后，进行共定位研究。

2. 免疫荧光染色

  1. 从培养箱中取出带孔的盖玻片。
  2. 移除培养基。
  3. 用 200 µL PBS 快速洗涤各孔。
  4. 向神经元中加入含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 溶液（每孔 200 µL），以快速固定细胞。
  5. 在室温下孵育 15 分钟。
  6. 移除 PFA 溶液。
  7. 加入含 0.2% Triton X-100 的 PBS 溶液（每孔 200 µL）对细胞进行透化处理。
  8. 在室温下孵育 1 分钟。
  9. 移除溶液，并将样品与含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 溶液（每孔 200 µL）在室温下孵育 1 小时，以用无关蛋白被动封闭板上所有自由结合位点。不含 Triton X-100 的 BSA 封闭缓冲液比含 0.2% Triton X-100 的相同缓冲液更有效地降低抗体背景信号。
  10. 移除溶液。
  11. 加入用含 1% BSA 和 0.2% Triton X-100 的 PBS 溶液稀释的一抗（根据抗体稀释度和可用性，每孔 120–200 µL）。孵育样品 2 小时。
    1. 作为阴性对照，其中一个孔不加任何一抗。可同时使用针对不同靶标的多种不同物种来源的一抗。建议使用鸡源抗 MAP2 抗体（神经元标记物）、鼠源抗 PSD95 或突触素（synaptophysin）抗体，以及兔源抗目标蛋白抗体。这可实现三色 SIM 分析。
  12. 用 PBS 快速洗涤各孔三次（每孔 200 µL）。
  13. 加入用含 1% BSA 和 0.2% Triton X-100 的 PBS 溶液稀释的二抗（可使用 dyLight 或 Alexa 荧光二抗，每孔 200 µL）。在室温下孵育 1 小时。
  14. 用 PBS 快速洗涤各孔三次（每孔 200 µL）。
  15. 加入 Hoechst 染料，用 PBS 稀释至终浓度 1 μg/mL（每孔 200 µL），用于细胞核染色。在室温下孵育 10 分钟。
  16. 用 PBS 快速洗涤各孔两次。
  17. 使用适用于 SIM 成像的封片剂进行封片。每孔使用 10 µL ProLong Glass 抗荧光淬灭封片剂。
  18. 用盖玻片覆盖并保护细胞（例如直径为 8 mm 的圆形盖玻片），也可使用方形盖玻片。
  19. 将带孔盖玻片置于室温保存，并至少等待 48 小时后再进行成像。Diamond Glass 封片剂需至少固化两天后方可进行超分辨率成像。

3. 抗体特异性对照

注意：采用两种策略以确保抗体特异性。第一种策略是使用至少两种针对同一底物的不同抗体。第二种策略是通过将抗体与纯化的靶蛋白或用于制备该抗体的表位进行孵育，实现抗体中和。

  1. 将所选抗体与五倍过量的重组靶标或表位在含1% BSA的PBS中于室温孵育1小时。
  2. 孵育结束后，按上述2.11步骤所述，以常规浓度使用中和后的抗体进行染色。

4. 显微镜校准

注意：我们常规使用尼康公司生产的 N-SIM 超分辨率显微镜系统进行超分辨率研究。然而，其他多家公司也在其产品目录中提供超分辨率显微镜。尽管本文具体描述了尼康 N-SIM 系统的操作指南，但以下说明可推广适用于其他系统。在采集 SIM 图像之前，系统需要使用特定亚分辨率尺寸的荧光微珠进行适当校准。例如 TetraSpeck 微球。这些微珠经不同荧光染料标记，可在同一样本中实现对多种激光器的校准。

  1. 在水浴中超声处理约 1.8 × 108 个荧光微球，持续 10 分钟。尼康 N-SIM 系统校准需要使用多色微珠样品，且微珠分布应稀疏。其他系统可能要求使用亚分辨率尺寸的荧光微珠形成致密单层，因此请根据具体系统调整荧光颗粒的数量。
  2. 将荧光微球用双蒸水按 1:500 比例稀释。
  3. 再次超声处理 10 分钟。
  4. 用移液器将 15 µL 稀释后的微球溶液加入带腔盖玻片的一个孔中。
  5. 在室温下静置干燥 5 分钟。
  6. 加入 10 µL 封片液，并在其上放置一片 8 mm 的盖玻片。
  7. 至少等待 48 小时，以确保充分固化。
  8. 打开显微镜和激光器。
  9. 让系统预热，使显微镜所有组件达到热平衡。N-SIM 超分辨率显微系统至少需要 3 小时。
  10. 选择 100 倍物镜。
  11. 通过将激光束与衍射光栅块中心对齐来启动校准程序。在 N-SIM 系统中，可通过微调旋钮和专用相机将光束精确对准目标中心。
  12. 将带腔盖玻片插入显微镜进行观察。通过调节物镜的校正环，设置系统以匹配带腔盖玻片的厚度。NIS 软件是 N-SIM 超分辨率显微系统配套的专有软件，具备自动调节校正环的功能。
  13. 针对每个通道调节光栅块的焦距，以确保样品上的结构照明图案聚焦清晰。NIS 软件为此任务提供自动功能。
  14. 接下来，采集多色微球的原始 3D-SIM 图像。使用显微镜配套软件或开源生物图像分析平台 ImageJ24 及其插件 fairSIM25 对原始图像进行重建，获得超分辨率图像。
  15. 对 4.14 步骤中获得的超分辨率图像，分别计算各分离波长的傅里叶变换。若变换后的图像未能呈现正确的花朵状图案，则表明未实现超分辨率，需从步骤 4.11 重新开始校准。
  16. 在超分辨率图像中选取单个微球，针对每个通道计算其强度分布曲线，以测量实际达到的分辨率。横向分辨率应接近 100 nm。
  17. 接下来，通过叠加微球的多通道图像进行通道配准。目标是使所有通道信号在横向和轴向上对齐。这将消除因不同通道未对准引起的色差，有助于共定位分析。
  18. 使用 SIMcheck26 工具包中的“照明相位步进”（Illumination Phase Steps）和“照明图案聚焦”（Illumination Pattern Focus）功能验证校准质量。SIMcheck 是开源软件 ImageJ 的一组插件。为此，制备一片含有致密单层 TetraSpeck 微球的带腔盖玻片，采集样品的 3D-SIM 图像。在 ImageJ 中分析图像，若检测到像差，则从步骤 4.11 重新开始显微镜校准。

5. 采集

  1. 使用共聚焦或宽场模式下的40倍物镜开始分析样品。此设置可在保持良好细节的同时提供较大的视野，便于样品定位。
  2. 利用MAP2抗体信号识别代表神经元突起的区域。
  3. 以共聚焦模式采集样品图像，以评估染色质量。共聚焦图像质量差将直接影响SIM成像质量，因此此类样品需予以弃用。
  4. 若所选区域及图像质量满意，则切换至100倍物镜。
  5. 在100倍物镜上滴加镜油。
  6. 采集一幅宽场或共聚焦图像，用于后续评估超分辨图像的质量（图1A,B）。
  7. 切换至3D-SIM模式。
  8. 通过对话窗口设置采集参数时，应选择可用的最高位深度以最大化颜色信息。通常情况下，16位为标准选择。此外，为提高信噪比，应选择较低的采集频率，例如1 MHz。
  9. 利用直方图窗口调节激光功率，以获得信号的线性响应。为避免信息丢失，应限制图像中饱和像素的数量。N-SIM系统使用Andor iXon3相机；在16位模式下，建议目标强度设为16,000，以确保相机的线性响应。或者，也可选择30,000–45,000范围以最大化采集的动态范围。
  10. 对样品成像时，将激光功率设置在0.1%至50%之间，曝光时间设置在50 ms至2 s之间。激光功率超过50%可能导致所用荧光染料迅速发生光漂白。
  11. 开始以3D-SIM模式采集图像。
  12. 使用SIMcheck——一套免费的ImageJ插件工具——评估原始图像采集质量。
  13. 若SIMcheck未检测到任何伪影或质量问题，则从4次技术重复中至少采集10幅图像，以便进行统计分析。

6. 后期处理：图像重建

注意：3D-SIM 获取的图像是原始图像，需要经过处理才能获得重建的超分辨率图像。原始图像的错误重建可能导致伪影，从而影响样本的分析。因此，应特别注意正确选择重建参数。

  1. 使用显微镜重建分析软件处理原始图像，以获得超分辨率图像（图1C）。或者，使用免费的ImageJ插件fairSIM对原始图像进行重建。
  2. 使用显微镜重建软件或ImageJ插件SIMCheck计算超分辨率图像的傅里叶变换。一个良好的重建图像应对每个通道均呈现类似花朵的图案。如果重建后的图像未能形成类似花朵的形状，则需从原始图像重新开始，并通过调整重建参数（如维纳滤波、窗函数平滑和零阶抑制）进行重建27。在NIS软件中，利用预览功能监测参数变化对最终分辨率图像的影响，调整以下参数：i）照明调制对比度，ii）高分辨率噪声抑制，iii）离焦信号抑制。
  3. 接下来，使用基于ImageJ的插件NanoJ-SQUIRREL28分析重建后的图像，以无偏检测图像中的伪影。
  4. 如果NanoJ-SQUIRREL检测到伪影，则需从原始图像重新开始，并通过调整重建参数（如维纳滤波、窗函数平滑和零阶抑制）进行重建。在NIS软件中，利用预览功能监测参数变化对最终分辨率图像的影响，调整参数：照明调制对比度、高分辨率噪声抑制和离焦信号抑制。
  5. 利用超分辨率图像计算共定位分布曲线和/或Pearson相关系数与Mander系数。

7. 通过轮廓分析进行共定位

注意：研究突触标志物与目的蛋白之间共定位的第一步是获取超分辨率图像，并分析单个位点以确定信号重叠情况。

  1. 在超分辨率图像上确定单个位点。
  2. 获取该感兴趣位点的荧光信号强度分布。
  3. 导出数据。
  4. 使用 GraphPad Prism 或类似的分析软件，对所有信号峰进行归一化处理，从而获得各通道间可比较的信号强度，最终目标是确定位点特异性的共定位情况。

8. Pearson 和 Mander 系数的定量分析

注意：如果轮廓分析提示存在单一位点共定位，则可通过计算 Pearson 系数和 Mander 系数对整幅图像进行更全面的分析29,30。

  1. 使用 ImageJ 插件 JACoP31 确定共定位的两个参数：Pearson 相关系数和 Mander 重叠系数。

9. 统计分析

  1. 使用 GraphPad Prism 或类似的分析和绘图软件处理通过 JACoP 收集的数据。
  2. 每种分析条件至少使用 40 张 SIM 图像，以获得图表并确保统计学意义。

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结果

本文介绍了研究神经元蛋白共定位的标准工作流程。首先对显微镜进行校准，随后对样品进行SIM分析。系统校准使用直径为0.1 μm的荧光微球。在获得微球的超分辨3D-SIM图像后，将原始图像数据进行傅里叶变换，以重新转换为空间频率表示。在图2A中，呈现出明显的花形图案，表明达到了超分辨率的细节水平。接着，我们通过计算单个微球强度分布峰值的半高全宽（FWHM）来测量所实现的分辨率（图2B,C）。最后，我们利用荧光微球再次进行通道配准，以校正色差（图3A,B）。随后，我们使用100倍物镜开始对样品进行分析，并采集3D-SIM图像。我们使用SIMCheck评估成像过程中照明场的均匀性或样品是否发生移动（图4A）。检查了不同照明图案角度之间的强度差异（图4B），并计算调制对比度与噪声的比值...

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讨论

阐明突触的结构与组成对于理解调控记忆和认知的生理及病理过程至关重要。在正常状态下，突触是记忆的基本构成单元，同时也与阿尔茨海默病等复杂的神经系统疾病密切相关32。本文所述的实验方案旨在利用一种称为SIM（结构光照明显微镜）的超分辨率显微成像技术，研究神经元蛋白的共定位情况。SIM通过特定的照明模式，可实现约0.1 μm的分辨率，适用于研究通常大小在0.03至0.15 μm之间的突触。若需更高细节，还可采用其他超分辨率技术，如STED（受激发射损耗显微镜）、PALM（光激活定位显微镜）或STORM（随机光学重建显微镜），这些技术的分辨率可达10–20 nm33。

本文介绍了在原代神经元中分析靶蛋白与突触标志物共定位的方法。该方案可应用于任何原代神经元细胞培养体系，例如海马神经元、小脑神经元或皮层神经元，甚至也可用于不属于中枢神经系统的原代神经元培养，如肠神经系统神经元。然而，实现超分辨率水平分析的关键在于成像过程中所使用的试剂，例如与物镜折射率匹配的带腔盖玻片和封片介质。我们选用带腔盖玻片...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Edoardo Micotti 对手稿提出的建设性批评。本研究得到了以下资助：BrightFocus A2019296F、Intesa Sanpaolo 集团慈善基金（LC）、伦巴第生物医学研究基金会（Care4NeuroRare CP_20/2018）（CN）、玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里创新培训网络（JK），以及 Telethon 基金会 TCP15011、阿尔茨海默协会 AARG-17-505136（LF）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.4% 台盼蓝溶液 赛默飞世尔科技15250061化学
70 µm 滤膜 康宁352350设备
Alexa赛默飞世尔科技-抗体
抗体 SENP1圣克鲁斯sc-271360抗体
B27 补充剂Life Technologies17504044化学
牛血清白蛋白 默克5470化学
CaCl2默克生命科学21115化学
带孔盖玻片Ibidi80826仪器
DyLight赛默飞世尔科技-抗体
FBS（Hyclone）GIBCOSH3007002 (CHA1111L)血清
FluoSpheres 羧基修饰微球，0.1 μ米，黄色–绿色荧光赛默飞世尔科技F8803仪器
葡萄糖默克生命科学G8769化学
GlutamaxGIBCO35050061化学
HEPES默克生命科学H3537化学
L-半胱氨酸 默克生命科学 C6852-25g化学
MAP2默克AB15452抗体
MEM Life Technologies21575022培养基
MgCl默克生命科学M8266化学
NaOHVWR International1,091,371,000化学
Neurobasal ALife Technologies10888022培养基
N-SIM 超分辨率显微镜尼康-仪器
木瓜蛋白酶默克生命科学 P-3125化学
多聚甲醛 赛默飞世尔科技28908化学
青霉素/链霉素 10倍液Life Technologies15140122化学
磷酸盐缓冲液 Gibco10010023化学
聚-L-赖氨酸SigmaP2636化学
ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂赛默飞世尔科技P36970化学
PSD95 NeuroMabK28/43抗体
圆形盖玻片赛默飞世尔科技12052712仪器
SUMO1Abcamab32058抗体
突触素 默克S5768 抗体
Triton X-100 默克T8787化学
胰蛋白酶抑制剂 默克生命科学 T9003-500MG化学

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