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通过流式细胞术检测原代小鼠海马神经元主要组织相容性复合体I类分子的表达

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DOI：

10.3791/61436

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2020年5月19日

 , 
1Department of Biological Sciences, University of North Carolina at Charlotte

本文内容

摘要

本方案描述了一种从胚胎小鼠脑组织中培养原代海马神经元的方法。随后通过流式细胞术分析检测培养神经元细胞外表面主要组织相容性复合体I类分子的表达情况。

摘要

越来越多的证据支持神经-免疫相互作用在稳态和病理条件下均会影响神经系统的功能。主要组织相容性复合体I类分子（MHCI）的一个被广泛研究的功能是向适应性免疫系统呈递细胞来源的多肽，特别是在应对感染时。最近研究表明，神经元表面MHCI分子的表达可调节正常发育及神经系统疾病过程中突触连接的活动依赖性变化。这些功能对脑健康的重要性提示有必要建立一种灵敏的检测方法，以方便地检测神经元上MHCI的表达。本文介绍了一种原代培养小鼠海马神经元并利用流式细胞术分析MHCI表达水平的方法。在胚胎第18天从小鼠胎仔中显微解剖获取海马组织，通过酶消化和机械分离方法将组织解离为单细胞悬液，随后在无血清培养基中进行培养，以抑制非神经元细胞的生长。体外培养7天后，通过给予β干扰素进行药物处理，诱导MHCI表达。使用荧光标记抗体对MHCI分子进行原位标记，随后采用非酶法将细胞解离成单细胞悬液。为确认细胞的神经元身份，使用多聚甲醛固定细胞，进行通透化处理，并用识别神经元核抗原NeuN的荧光标记抗体进行标记。最后通过流式细胞术定量分析神经元上的MHCI表达水平。该原代神经元培养体系可通过基因修饰或药理干预手段方便地进行操作，以验证特定科学假设。经过轻微调整，该方法也可用于培养其他类型的神经元群体，或检测其他目标蛋白的表达水平。

引言

中枢神经系统（CNS）曾被认为缺乏免疫监视，被称为“免疫特权1”。现在已明确，这种特权并不等同于免疫成分的绝对缺失，而是一种特殊调控机制，旨在限制与免疫病理相关的损伤1。事实上，中枢神经系统与免疫系统之间的交流是一种持续进行的对话，对于正常的大脑发育以及应对感染至关重要2,3。

主要组织相容性复合体I类（MHCI）分子是一类多基因且具有多态性的跨膜蛋白，其最广为人知的功能是在感染过程中向CD8+ T细胞呈递抗原肽4。经典的MHCI复合物由一条跨膜α链和一个细胞外轻链（称为β2-微球蛋白）组成。α链包含一个具有多态性的沟槽结构，可结合抗原肽并将其呈递5。MHCI在细胞外膜上的正常表达依赖于内质网中分子伴侣的协同作用，以确保α链和β2-微球蛋白正确折叠，并加载高亲和力的抗原肽配体5。只有在MHCI复合物组装完成后，才能从内质网转运至细胞质膜6。当特异性T细胞受体与负载抗原肽的MHCI复合物结合后，CD8+ T细胞通过释放含有穿孔素和颗粒酶的溶细胞颗粒，或通过与靶细胞膜上的Fas受体结合诱导凋亡，从而介导细胞杀伤作用7。此外，CD8+ T细胞还可分泌细胞因子，如γ干扰素（IFNγ）和肿瘤坏死因子α（TNFα），这些因子可在不引起细胞病变效应的情况下激活感染细胞内的抗病毒机制8,9。对于许多嗜神经病毒而言，CD8+ T细胞是清除中枢神经系统（CNS）感染所必需的10,11,12。

过去人们认为，神经元仅在损伤、病毒感染或体外细胞因子刺激的条件下才表达MHCI。最近的研究发现，神经元表达MHCI在突触重塑和可塑性中具有重要作用13,14。尽管突触调控的确切机制尚不完全清楚，但已有数据表明，MHCI的表达水平受突触活动的调节15,16。一种假说认为，神经元在突触前表达成对免疫球蛋白样受体B（PirB），该受体可跨突触结合MHCI13,17。这种相互作用通过PirB启动信号级联反应，拮抗参与突触重塑的通路，从而加强并稳定突触连接17,18,19。在缺乏神经元活动的情况下，MHCI的表达减少14，而MHCI的缺失会导致突触消除缺陷以及突触环路的异常组织20,21。

此处所述的实验方法改编自 Chevalier 等人的研究9采用流式细胞术定量分析原代培养的小鼠海马神经元表面MHC I蛋白的表达。本方案阐述了从胚胎小鼠仔鼠中显微解剖分离海马组织的初步技术，随后详细说明了将组织通过酶消化和机械解离制备成单细胞悬液的步骤，以及体外维持细胞培养的方法。. 由于神经元在培养后不再分裂，因此必须根据实验终点的要求，将神经元接种于适宜密度的培养皿中。接下来，本文概述了使用β干扰素（IFNβ）诱导MHCI表达、对MHCI和神经元核标记物NeuN进行免疫标记，并通过流式细胞术分析细胞的步骤。最后，描述了分析流式细胞术数据以鉴定MHCI阳性神经元并量化MHCI表达水平的方法。本方案还注明了若干微小调整，可用于培养皮层神经元，或替代海马神经元进行培养。该方案可轻松修改，以结合基因变异或药理学处理来验证特定假设。

方案

所有操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议，并符合《涉及动物的生物医学研究国际指导原则》。该方案已获得北卡罗来纳大学夏洛特分校机构动物护理和使用委员会批准（方案编号 #19-020）。

1. 培养前准备

注意：这些操作应在组织培养专用的生物安全柜内无菌条件下进行。培养基和溶液详见表1。

  1. 将所有解剖工具放入自封式灭菌袋中，通过高压灭菌法进行灭菌。
  2. 准备用于处理12孔培养板的多聚-D-赖氨酸工作液。
    1. 将多聚-D-赖氨酸溶于1×硼酸盐缓冲液中，配制成100 µg/mL的浓度（10倍浓缩液）。分装成约1 mL每份，于-20 ˚C保存，直至使用。
    2. 用dPBS将10倍浓缩的多聚-D-赖氨酸稀释至10 µg/mL（1倍工作浓度），并经滤膜过滤除菌。
    3. 在室温下，向12孔培养板每孔加入0.5 mL 1倍浓度的多聚-D-赖氨酸溶液，处理至少1小时，或过夜处理以备次日使用。确保加入的多聚-D-赖氨酸液体足以完全覆盖培养区域的底部。
    4. 在使用前，从培养板中移除多聚-D-赖氨酸溶液，用无菌水冲洗3次，并将培养板保持在无菌水中，直到准备接种细胞。接种细胞前，务必彻底吸除所有残留液体。
  3. 配制神经元生长培养基和FACS缓冲液。经滤膜过滤除菌后，于4 ˚C保存备用。神经元生长培养基可保存约2周；FACS缓冲液可保存约4周。

2. 解剖胚胎海马体

注意：该操作可在台面上进行，因为需要使用体视显微镜去除脑膜并对海马体进行显微解剖。应严格遵守无菌操作技术，以尽量减少潜在污染。

  1. 在 CO2 室内处死妊娠 18 天的 C57BL/6J 雌性小鼠。
  2. 用 70% 乙醇喷洒腹部皮肤和毛发，然后用组织镊夹起皮肤，用手术剪做一小切口。切开腹膜以暴露内脏和子宫。
  3. 用标准图案镊子夹住子宫，将其从体腔中提起，并用精细剪刀剪断与子宫系膜的连接。将带有胚胎的子宫转移至置于冰上的 100 mm 无菌塑料培养皿中。
  4. 使用精细剪刀和精细镊子，小心切开子宫并取出胚胎囊以释放胚胎。将胚胎转移至另一个置于冰上的、含有 dPBS 的 100 mm 无菌塑料培养皿中。
  5. 用精细剪刀剪下胚胎幼鼠的头部，并将头部转移至另一个置于冰上的、含有 Hibernate-E 培养基的 100 mm 无菌塑料培养皿中。
  6. 为取出脑组织，用一只手使用一对精细镊子夹住头部。另一只手使用弯头 Dumont #7 镊子，将镊子尖端插入颅底，沿中线向前轻轻夹住颅骨及表层皮肤，注意不要刺破脑组织。
  7. 用弯头镊子将皮肤和颅骨分开以暴露脑组织。从暴露的嗅球向小脑方向，用弯头镊子从脑组织下方轻轻扫过，将脑组织从颅腔中取出。将脑组织转移至另一个置于冰上的、含有 Hibernate-E 培养基的 100 mm 无菌塑料培养皿中。对每个脑组织重复此操作。
    注：除非实验需要将脑组织分开处理，否则所有脑组织可收集于同一个培养皿中。
  8. 在体视解剖显微镜下操作，每次处理一个脑组织，使用两对无菌 Dumont #5 镊子，夹除嗅球并剥离脑膜。彻底去除脑膜是必要的，以避免其他细胞污染培养物，并便于后续解剖。
  9. 脑膜完全去除后，大脑皮层上侧会向外侧展开，从而暴露海马体。使用 Dumont #5 镊子，将海马体从附着的皮层上夹离，并小心地将分离的海马体转移至一个置于冰上的、含有 5 mL Hibernate-E 培养基的无菌 15 mL 圆锥管中。
  10. 对每只胚胎小鼠的两个脑半球重复上述解剖操作，并将所有海马体合并至同一个 15 mL 圆锥管中，除非实验需要分别处理。
    1. 若需培养皮层神经元，可将皮层与皮层下结构分离，并以与海马神经元相同的方式进行处理。
      注：此时可暂停实验流程。可将脑组织或已解剖的海马体置于添加 B27（2%）的 Hibernate-E 培养基中，在 4 ˚C 下保存长达 1 个月，但长时间存放可能影响活细胞数量。

3. 分离和培养海马神经元

注意：所有操作均应在指定用于组织培养的生物安全柜内无菌条件下进行。

  1. 为每个胚胎准备 0.5 mL 木瓜蛋白酶解离液，用于海马体组织的解离。所需解离液体积将根据正在解剖的胚胎脑组织数量而变化。
    注意：对于皮层神经元培养，每个胚胎需准备 1.0 mL 木瓜蛋白酶溶液。
    1. 每 1 mL Hibernate E 培养基中加入 20 µL 木瓜蛋白酶悬浮液，涡旋振荡约 3 分钟使其充分溶解。
    2. 木瓜蛋白酶溶解后，每 1 mL 溶液中加入 1 µL DNase I。加入 DNase I 后切勿涡旋，以免使酶失活。
  2. 将含有海马体组织的 15 mL 圆锥形离心管（步骤 2.10）在 1,000 x g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，加入木瓜蛋白酶溶液。通过反复倒置数次使组织重悬。于 37 ˚C 孵育 30 分钟，每隔 10 分钟倒置混匀一次。
    1. 若进行皮层神经元培养，将所有皮层组织转移至新的 100 mm 无菌培养皿中，小心吸除培养皿中的液体，并用精细剪刀或刀片将组织切碎。向培养皿中加入木瓜蛋白酶溶液，使用无菌移液管将含酶的皮层组织转移至 15 mL 圆锥形离心管中。于 37 ˚C 孵育组织与酶溶液 30 分钟，每隔 10 分钟轻轻振荡一次。
  3. 在 30 分钟孵育期间，准备 3 支火焰抛光的玻璃巴斯德吸管：1 支完全开口，1 支半开口，1 支四分之一开口。
  4. 30 分钟孵育结束后，将含有已消化脑组织的 15 mL 圆锥形离心管在 125 x g 条件下离心 10 分钟。弃去酶溶液，加入等体积的新鲜 Hibernate E 培养基。
  5. 使用完全开口的巴斯德吸管吹打组织 10 次。静置 2 分钟使未解离组织沉淀，然后将上清液中的细胞悬液转移至无菌 50 mL 圆锥形离心管中。向残留组织中补加等体积的 Hibernate E 培养基。
  6. 使用半开口的巴斯德吸管吹打组织 10 次。静置 2 分钟后，将上清液中的细胞悬液转移至与前一步相同的 50 mL 圆锥形离心管中。向残留组织中再次补加等体积的 Hibernate E 培养基。
  7. 使用四分之一开口的巴斯德吸管吹打组织 10 次。静置 2 分钟后，再次将上清液中的细胞悬液转移至前述相同的 50 mL 圆锥形离心管中。弃去所有未解离的残留组织。
  8. 将含有细胞悬液上清液的 50 mL 圆锥形离心管在 125 x g 条件下离心 5 分钟。若尚未完成，用无菌水清洗多聚-D-赖氨酸包被的培养板，并在离心过程中彻底吸除所有液体残留。
  9. 离心后弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 5 mL 神经元生长培养基中。使用台盼蓝染色和血细胞计数板计数活细胞。
    1. 若进行皮层神经元培养，加入至少 10 mL 神经元生长培养基以获得较低密度的细胞悬液，从而实现更准确的细胞计数。
  10. 用神经元生长培养基稀释细胞，使最终铺板密度为每毫升含 5 × 105 个活细胞，并将 1 mL 稀释后的细胞悬液加入 12 孔板的每个孔中。将神经元置于 37 ˚C、5% CO2 条件下培养。
    注意：通常，1 个胚胎小鼠脑（即 2 个海马体）可获得约 1 × 106 个活细胞。此数值仅用于实验规划参考，不可替代每次培养时的实际细胞计数。
  11. 培养后次日更换培养基：从每个孔中移除一半体积的旧培养基（即 0.5 mL），沿孔壁加入等体积的新鲜培养基，以避免扰动已贴壁的细胞。在整个培养周期内，每周进行两次半量换液。

4. 通过流式细胞术评估 MHCI 表达

  1. 用神经元生长培养基稀释干扰素β（IFNβ）或等体积的溶剂，配制处理液。由于换液为半量更换，需配制含2倍浓度IFNβ的处理培养基。例如，若需以100 U/mL IFNβ处理12孔板中的3个孔，则应配制1.5 mL含200 U/mL IFNβ的处理液；对照组则使用等体积的IFNβ溶剂。
  2. 从每孔神经元中移除 0.5 mL 培养基，并向每孔加入 0.5 mL 含或不含 IFNβ 的神经元生长培养基。在正常生长条件（37 ˚C，5% CO₂）下培养。2根据实验条件和信号优化情况，孵育时间为 6–72 小时。
  3. 处理时间结束后，移除所有培养基，并用不含添加剂（B27、L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素）的冷 Neurobasal 培养基轻轻冲洗一次。
  4. 向每孔中加入0.5 mL未添加补充物的冷Neurobasal培养基，其中含1 µg/mL Fc阻断剂和1 µg/mL荧光标记的抗MHCI抗体。4 ˚C避光孵育45分钟。
  5. 移除含抗体的培养基，用冷的dPBS小心洗涤一次。每孔加入0.5 mL室温的无酶细胞解离缓冲液，轻轻振荡以使细胞脱落。使用倒置组织培养显微镜观察细胞解离情况。
  6. 细胞从培养皿上脱离后，向每孔加入0.5 mL FACS缓冲液，吹打混匀以分散细胞团块，然后将每孔全部液体转移至各自的1.7 mL微量离心管中。
  7. 在 1,000 离心 x g 孵育5分钟。移除上清液，将细胞沉淀用100 µL FACS缓冲液重悬，并将每管全部体积转移至96孔U型底板的各个孔中。
  8. 每孔加入 100 µL 固定剂，反复吹打数次以防止细胞聚团，室温避光孵育 15 分钟。
  9. 500离心 x g 5 分钟后，弃去上清液，用 200 µl FACS 缓冲液重悬。
  10. 500离心 x g 5分钟。弃去上清液，每孔加入含荧光标记的抗NeuN抗体（1:100稀释）的100 µL透化试剂，重悬细胞。充分混匀后，室温避光振荡孵育20分钟。
  11. 孵育后，于500 × g离心 x g 5 分钟。弃上清，加入 100 µL FACS 缓冲液重悬。重复两次。
  12. 最后一次洗涤后，将细胞重悬于100 µL含2%多聚甲醛的FACS缓冲液中。充分混匀以防止细胞聚集。4 ˚C避光保存，待流式细胞仪检测时取出。样本应尽快检测，最好在1周内完成。

5. 数据的量化与评估

  1. 测量每种荧光染料的补偿对照，并校正任何光谱重叠。理想的补偿对照包括未染色的培养神经元、仅用抗MHCI染色的培养神经元，以及仅用抗NeuN染色的培养神经元。
  2. 如有可能，每个样本记录100,000个事件（至少10,000个），并保存为FCS文件。
  3. 使用适当的分析软件分析数据，按照图1A-C所示设置连续门控，以筛选NeuN阳性神经元。
    1. 绘制SSC-A（对数）对FSC-A（线性）的散点图。在细胞群体（P1）上画门，以从分析中排除细胞碎片。
    2. 在P1细胞群体内，绘制FSC-H（线性）对FSC-A（线性）的散点图。在单细胞群体上画门。
    3. 在单细胞群体内，绘制SSC-A（对数）对NeuN（对数）的散点图。以未染色或仅用MHCI染色的细胞为参考，在NeuN阳性群体上画门。
    4. 绘制MHCI荧光的直方图，y轴为归一化至众数的细胞事件。以未染色或仅用NeuN染色的神经元为参考，画一条水平门以量化MHCI阳性神经元的百分比。
    5. 导出MHCI阳性细胞的百分比，以及NeuN阳性群体中MHCI的中位荧光强度（MFI），用于统计分析和图形绘制。

结果

采用本文所述方法，于胚胎第18天从小鼠胎鼠中分离海马组织。通过酶消化和机械法将组织解离为单细胞悬液，随后接种于预先用多聚-D-赖氨酸处理过的12孔板中进行培养。体外培养7天后，细胞分别用100 U/mL的IFNβ或仅用培养基处理72小时，以诱导MHCI的表达。在对神经元进行非酶法解离成单细胞悬液之前，先对其进行原位MHCI染色。随后固定并通透细胞，再对神经元核标志物NeuN进行胞内染色。样品通过流式细胞术检测，并使用配套软件进行数据分析。通过连续设门排除细胞碎片和双联体，从总事件中鉴定出神经元（图1A,B）。神经元通过NeuN阳性表达明确鉴定（图1C）。进一步通过绘制直方图分析NeuN+细胞中MHCI的阳性情况，其中y轴为细胞数量（归一化至众数），x轴为MHCI荧光强度。MHCI+设门位于阳性与阴性峰分离的位置（图1D）。据此计算MHCI染色阳性的神经元百分比（图1E）以及中位荧光强度（MFI；图1F）。结果显示，IFNβ处理显著上调了神经元表面MHCI染色阳性细胞的比例，同时也提高了其表达水平，后者以MFI表示。统计分析和图形绘制使用商业化的统计软件完成。

显示经 IFNβ 处理后 NeuN+ 细胞分析的流式细胞术图谱与柱状图。
图 1：代表性设门策略与 MHCI 定量分析。
原代海马神经元用 100 U/mL IFNβ 或仅培养基处理。处理 72 小时后，神经元经细胞外染色使用 Pacific Blue 标记的 MHCI 抗体（1 μg/mL H2-Kb），随后经细胞内标记使用 PE 标记的 NeuN 抗体（1:100 稀释）。通过流式细胞术检测细胞荧光，并对数据进行分析。(A) 总事件数以 SSC-A（对数）对 FSC-A（线性）作图，设门 P1 以排除碎片。(B) 在 P1 群体中，以 FSC-H（线性）对 FSC-A（线性）作图，设门获得单细胞群体。(C) 在单细胞群体中，以 SSC-A（对数）对 NeuN-PE（对数）作图。设门 NeuN+ 细胞以鉴定神经元。(D) 在神经元群体中，以直方图显示，x 轴为 MHCI-PacBlu，y 轴为细胞数（归一化至众数）。绘制水平门以定量 MHCI 染色阳性神经元的百分比。(E) 仅培养基组与 IFNβ 处理组神经元中 MHCI+ 的 NeuN+ 细胞百分比的定量结果。(F) 培养基组（黑色）与 IFNβ 处理组（红色）神经元中 NeuN+ 细胞的 MHCI 中位荧光强度（MFI）定量结果。统计学显著性通过非配对 t 检验计算。**, P < 0.01。 请点击此处查看该图的高清版本。

神经元生长培养基（50 ml）
试剂终浓度储存液浓度配制50 ml所需体积
B27 补充剂2%100%1.0 ml
L-谷氨酰胺2 mM200 mM0.5 ml
青霉素-链霉素100 U/ml10,000 U/ml0.5 ml
Neurobasal 培养基48.0 ml
FACS 缓冲液（500 ml）
试剂终浓度储存液浓度配制500 ml所需体积
胎牛血清2%100%10 ml
EDTA1 mM500 mM1 ml
dPBS489 ml
木瓜蛋白酶解离溶液
试剂终浓度储存液浓度配制1 ml所需体积
木瓜蛋白酶悬液20 U/ml1000 U/ml0.020 ml
DNase I2.5 U/ml2500 U/ml0.001 ml
Hibernate-E1.0 ml
注：所需木瓜蛋白酶解离溶液的体积取决于正在解剖的胚胎脑数量。海马神经元按每脑0.5 ml准备，皮层神经元按每脑1.0 ml准备。
注：通过在 Hibernate-E 中涡旋震荡约3分钟使木瓜蛋白酶悬液充分溶解。待木瓜蛋白酶完全溶解后，加入 DNase I。不要对 DNase I 进行涡旋震荡。

表1：培养基与溶液。

讨论

本方案描述了从胚胎第18天的小鼠胎鼠中分离和培养原代海马神经元的方法。使用来自啮齿类动物的原代神经元进行培养是现代神经生物学中最基础的研究方法之一22。尽管永生化细胞系可在一定程度上模拟神经元的某些特性，但由于其来源于肿瘤细胞、无法形成明确的轴突，且持续分裂增殖，因此难以真实再现体内终末分化神经元的特性23。另一种替代方案是使用人诱导多能干细胞（HiPSCs）。近年来，尤其是患者来源的HiPSCs技术发展迅速24。然而，HiPSCs的应用仍存在诸多局限性，包括不同细胞系之间的变异性、功能成熟度不足以及表观遗传谱的差异25。尽管原代啮齿类神经元模型也存在一定的局限性，但培养的神经元仍保留了体内神经元终末分化、不再分裂的特性。此外，小鼠拥有丰富的分子生物学工具和成熟的遗传修饰技术，使得在许多研究应用中，原代神经元相比HiPSCs更具优势；同时，小鼠研究结果可便捷地推广至更为复杂的活体生物，而无需牺牲实验所需的遗传操作系统。基于上述原因，许多研究人员在验证其研究的关键结果甚至主要结论时，均采用原代啮齿类神经元作为实验模型。

对于某些检测，神经元可在从脑组织中离体分离后直接进行分析. 这对于涉及成年小鼠的实验尤为理想，因为这些实验可能需要施加特定的实验条件，或依赖于多种细胞类型的相互作用；然而，目前仍存在若干问题限制了可进行的分析类型。从成年小鼠脑组织中制备单个神经元细胞悬液在技术上具有挑战性，原因是神经元具有独特的相互连接特性，并被髓鞘包绕。26非酶法组织研磨在解离组织时效率低下，且易导致细胞死亡，而酶解法处理则常会切割细胞表面抗原27此外，虽然髓鞘在胚胎期小鼠中几乎不存在，但在成年小鼠大脑中约占20%，可能影响活细胞的分离，并阻碍流式细胞术分析28许多已开发的技术最终会去除神经元的胞质溶胶，留下主要由细胞核组成的小而圆形的细胞体29尽管这在某些分析中是可接受的，但不适合用于定量检测细胞质或细胞外蛋白的表达。此外，还原论的细胞培养系统能够在比体内系统更短的时间尺度上检验特定的机制性问题。

本方案还描述了使用IFNβ进行药理学刺激以诱导MHCI表达的方法，以及通过流式细胞术对细胞外MHCI表达进行定量分析。IFNβ刺激可作为测试其他实验条件的有用阳性对照；但需注意，IFNγ和红藻氨酸也可在神经元中诱导MHCI表达9,30，而河豚毒素则会降低MHCI表达14。以往检测MHCI表达的方法依赖于原位杂交和免疫组织化学分析14,15,20,31。虽然基于mRNA的检测方法（如原位杂交和qRT-PCR）能够确定基因转录的时间空间分布、细胞类型特异性和表达水平，但这些方法无法评估蛋白质翻译或向质膜的转运情况。免疫组织化学和蛋白质印迹分析可检测蛋白质表达差异并可能揭示细胞内定位，但难以实现精确的定量。此外，许多MHCI抗体识别的是该复合物的三级结构，对构象变化高度敏感。因此，透化或变性条件会导致MHCI免疫反应性的丧失32。本文所介绍的方法采用原位免疫染色检测MHCI，可在保持蛋白质天然构象的前提下使其被抗体识别，随后再进行固定和透化处理。

经过轻微修改，本文所述方法也可用于培养其他神经元群体，或检测其他感兴趣的细胞外蛋白的表达。本方案中特别指出了一些可用于培养皮层神经元的简便修改方法，但本文描述的方法同样适用于培养其他神经元群体，例如纹状体神经元33。此外，尽管本方案具体针对MHCI和NeuN的免疫染色，其他细胞标志物也可采用类似方法进行鉴定。通常情况下，细胞外标志物可参照MHCI的处理方式，而细胞内标志物则可参照NeuN的处理方式。然而需要注意的是，在细胞解离步骤中，轴突投射会与胞体分离。由于此处定义的门控策略会排除细胞碎片，并聚焦于神经元核标志物NeuN，因此仅在轴突投射中表达的蛋白可能无法被检测到。

直到最近，人们认为神经元仅在损伤、感染或体外细胞因子刺激的条件下才表达MHCI，以激活细胞毒性CD8+ T细胞9。最新研究揭示了MHCI在发育过程中调控突触连接的另一功能13。本文所述方案使用IFNβ刺激野生型培养神经元中MHCI的表达，但类似方法也可结合多种细胞刺激因素或基因修饰，用于验证特定假设。该方法将帮助研究人员探究调控MHCI表达的分子机制，从而加深对MHCI在上述两种不同细胞功能中双重作用的理解。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由 NIA R00 AG053412（KEF）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 ml 微量离心管Fisher05-408-129实验耗材
100 mm 无菌培养皿FisherFB012924组织培养耗材
15 ml 离心管Genesee21-103实验耗材
50 ml 离心管Genesee21-108实验耗材
500 mM EDTAInvitrogenAM9260GFACS 缓冲液试剂
70% 乙醇FisherBP82031Gal组织培养耗材
96 孔圆底板Genesee25-221流式细胞术耗材
B27Gibco17504044神经元培养试剂
硼酸盐缓冲液Thermo Scientific28341组织培养耗材
硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管Fisher13 678 20C实验耗材
细胞解离缓冲液Gibco13 151 014流式细胞术耗材
DNase IThermo90083解离溶液试剂
dPBSGibco14190-235组织培养耗材
Dumont #5 镊子Fine Science Tools91150-20解剖工具
Dumont #7 镊子Fine Science Tools91197-00解剖工具
胎牛血清Gibco26140079组织培养耗材
精细镊子Fine Science Tools91113-10解剖工具
精细剪刀Fine Science Tools91460-11解剖工具
Fix and Perm 细胞通透化试剂盒InvitrogenGAS003流式细胞术耗材
GlutamaxGibco35050061神经元培养试剂
Hibernate-E 培养基GibcoA1247601神经元培养试剂
即用型密封灭菌袋Fisher181254组织培养耗材
干扰素 βPBL Assay Science12405-1流式细胞术耗材
Milli-Mark Anti-NeuN-PE 抗体，克隆 A60MilliporeSigmaFCMAB317PE流式细胞术抗体
Neurobasal 培养基Gibco21103049神经元培养试剂
Pacific Blue 抗小鼠 H-2Kb 抗体BioLegend116513流式细胞术抗体
木瓜蛋白酶溶液WorthingtonLS003126解离溶液试剂
多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15714固定剂
青霉素-链霉素Gibco15140122神经元培养试剂
聚-D-赖氨酸SigmaP7280神经元培养试剂
标准纹路镊子Fine Science Tools91100-12解剖工具
体视解剖显微镜SwiftM29TZ-SM99CL-BTW1解剖工具
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参考文献

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通过流式细胞术检测原代小鼠海马神经元主要组织相容性复合体I类分子的表达
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