本方案描述了在同时进行经脊髓直流电刺激的条件下，对大鼠腰段运动神经元进行体内细胞内记录的方法。该方法使我们能够在脊髓阳极或阴极极化之前、期间和之后，测量运动神经元的膜特性并记录其节律性放电活动。
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方法文章
在体条件下对经脊髓直流电刺激期间类型明确的大鼠脊髓运动神经元进行细胞内记录
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
在体内的脊髓运动神经元细胞内记录为确定完整脊髓网络中细胞的电生理特性提供了“金标准”，相较于传统的体外或细胞外记录技术具有显著优势。在体细胞内记录的一个优点是，该方法可在神经系统完全成熟的成年动物上进行，因此许多观察到的生理机制可转化为实际应用。在本方法学论文中，我们描述了该技术与外源施加的恒定电流刺激相结合的操作流程，后者可模拟脊髓神经元网络内部发生的极化过程。经脊髓直流电刺激（tsDCS）是一种新兴的神经调节干预手段， increasingly 被用于各种神经损伤后的康复治疗以及运动领域。目前，tsDCS 对神经系统的影响仍知之甚少，其作用背后的生理机制在很大程度上尚不明确。将 tsDCS 与细胞内记录同步应用，使我们能够直接观察运动神经元膜特性以及节律性放电特征在脊髓神经元网络极化过程中的变化，这对于理解 tsDCS 的作用机制至关重要。此外，当本方案包含对运动神经元所支配肌肉及其功能（屈肌 versus 伸肌）以及生理类型（快型 versus 慢型）的鉴定时，便可选择性地研究 tsDCS 对脊髓回路中已鉴定组分的影响，而这些组分似乎受到极化的不同影响。本文所述操作流程重点在于细胞内记录与刺激的手术准备，强调为实现准备稳定性与结果可重复性所必需的各个步骤。文中还讨论了阳极或阴极 tsDCS 应用方法的具体细节，同时关注实际操作与安全性问题。
引言
经脊髓直流电刺激（tsDCS）正逐渐被认可为一种在健康和疾病状态下调节脊髓环路兴奋性的有效方法1,2,3。该技术通过位于选定脊髓节段上方的主动电极与位于腹侧或更头端位置的参考电极之间传递恒定电流来实现刺激4。已有多个研究证实，tsDCS可用于治疗某些病理状态，例如神经病理性疼痛5、痉挛性肌张力增高6、脊髓损伤7，或用于促进康复过程8。研究人员 提出，tsDCS可引起细胞膜内外细胞内和细胞外空间离子分布的改变，这种改变可能促进或抑制神经元活动，具体效应取决于电流的方向9,10,11。然而，直到最近，尚缺乏对运动神经元直接受此影响的直接证据。
本文介绍了一种详细的实验方案，用于在麻醉大鼠中进行腰段脊髓运动神经元的活体细胞内记录，同时应用经脊髓直流电刺激（tsDCS）....
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方案
本方案所涉及的所有操作均已获得相关主管部门（例如，当地伦理委员会）的批准，并遵循有关动物福利与管理的国家及国际准则。
注意：参与该操作的每位人员都必须接受过基本外科手术操作的适当培训，并持有进行动物实验的有效许可证。
1. 麻醉与术前给药
- 使用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（6月龄、体重400‒550 g的雄性Wistar大鼠的初始剂量为60 mg·kg-1）。
注意：本方案不限于上述品系、性别或年龄的大鼠。若出于不同研究目的或伦理委员会要求，也可选用其他麻醉剂，如氯胺酮-赛拉嗪混合剂、α-氯醛糖、或芬太尼+咪达唑仑+美托咪定组合。 - 约5分钟后，用钝头镊子夹捏大鼠后肢脚趾，检查麻醉深度。只有在未观察到反射反应时，方可进行后续操作步骤。
- 皮下注射0.05 mL阿托品，以减少插管后黏液分泌。
- 皮下注射5 mL磷酸盐缓冲液，其中含4%葡萄糖溶液、NaHCO3（1%）和明胶（14%）。该缓冲液将在实验过程中经皮下血管吸收，有助于维持体液平衡。
- 在整个手术过程中，应定期检查动物是否存在反射反应，并根据需要追加麻醉剂（戊巴比妥钠10 mg·kg-1·h-1）。
2. 手....
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结果
在确保细胞穿刺条件稳定的前提下，可通过细胞内记录计算动作电位的多个参数及细胞膜特性。图1A展示了一个由细胞内刺激诱发的典型顺向动作电位，该电位符合所有数据纳入标准（静息膜电位至少为-50 mV，峰电位幅度高于50 mV，并具有正向超射）。可测量的动作电位参数包括峰电位幅度、后超极化幅度以及后超极化半衰时间（AHP-HDT）。在大鼠运动神经元中，AHP-HDT的数值可作为区分快型与慢型运动神经元的可靠标准（慢型运动神经元AHP-HDT > 20 ms，快型运动神经元AHP-HDT < 20 ms）17。图1B显示了细胞对持续100 ms、强度为1 nA的超极化电流脉冲的反应，可通过电压偏转计算出运动神经元的峰值和平台期输入电阻（IR）。图1C展示了一个阈下动作电位的扩展电压轨迹，其中动作电位的电压阈值清晰标出，代表了电压门控钠通道被激活以启动动作电位时的膜去极化水平。在经颅静态直流电刺激（tsDCS）应用期间及之后.......
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讨论
如果操作正确，所述实验方案的手术部分应在大约三小时内完成。手术过程中应特别注意维持动物生理状态的稳定，尤其是体温和麻醉深度。除了明显的伦理考量外，麻醉不足可能导致在神经分离或椎板切除期间出现过度的肢体运动，从而损伤制备标本或导致实验提前终止。在使用微电极穿刺脊髓之前，若对动物实施麻痹，必须密切监测麻醉深度和心率，并根据动物体重及肺容量调整适当的通气参数。一旦生理参数偏离正常范围，必须立即纠正，以确保手术成功。手术完成后，应能够维持至少四小时的稳定记录状态。
在运动神经元穿刺后，记录的稳定性至关重要。对照记录期间必须保持膜电位恒定，因为任何波动都会显著影响阈下电流（rheobase current）以及节律性放电的阈值。适当固定脊柱可提供基本的稳定性，而实施气胸的目的则是减少呼吸所诱发的脊髓运动。此外，在进行穿刺前，必须确保肌肉收缩已完全消除，并需定期给予神经肌肉阻断剂。
在成功穿透后，可通过刺激相应的神经分支逆行识别所记录的运动神经元。这是体内实验准备的一大优势，因为在此条件下运动神经元的轴突仍与所支配的肌肉保持连续，而相比之.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由国家科学中心资助，项目编号为 2017/25/B/NZ7/00373。作者谨此感谢 Hanna Drzymała-Celichowska 和 Włodzimierz Mrówczyński 的贡献，他们两人均参与了本文所呈现结果的数据收集与分析工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 药物与溶液 | - | - | - |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| 葡萄糖 | Merck | 346351 | - |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | - |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | - | 神经肌肉阻滞剂 |
| 戊巴比妥钠 | Biowet Pu?awy Sp. z o.o | - | 主要麻醉剂 |
| 柠檬酸钾 | Chempur | 6100-05-06 | - |
| Tetraspan | Braun | - | HES 溶液 |
| 手术器械 | - | - | - |
| 21 号刀片 | FST | 10021-00 | 手术刀片 |
| 电凝器 | FST | 18010-00 | - |
| 胸腔引流管 | Mila | CT1215 | - |
| Dumont #4 镊子 | FST | 11241-30 | 肌肉镊 |
| Dumont #5 镊子 | FST | 11254-20 | 硬脑膜镊 |
| Dumont #5F 镊子 | FST | 11255-20 | 神经镊 |
| Dumont #5SF 镊子 | FST | 11252-00 | 软脑膜镊 |
| 镊子 | FST | 11008-13 | 钝头镊 |
| 镊子 | FST | 11053-10 | 皮肤镊 |
| 止血钳 | FST | 13013-14 | - |
| 咬骨钳 | FST | 16021-14 | 用于椎板切除术 |
| 剪刀 | FST | 15000-08 | 静脉剪 |
| 剪刀 | FST | 15002-08 | 硬脑膜剪 |
| 剪刀 | FST | 14184-09 | 用于气管切开 |
| 剪刀 | FST | 104075-11 | 肌肉剪 |
| 剪刀 | FST | 14002-13 | 皮肤剪 |
| 气管插管 | - | - | 定制 |
| 静脉导管 | Vygon | 1261.201 | - |
| 血管插管镊 | FST | 18403-11 | - |
| 血管夹 | FST | 18320-11 | 用于静脉夹闭 |
| 血管扩张探针 | FST | 10160-13 | 用于静脉解剖 |
| 手术材料 | - | - | - |
| 明胶海绵 | Pfizer | GTIN 00300090315085 | 止血剂 |
| 丝线 4.0 | FST | 18020-40 | - |
| 丝线 6.0 | FST | 18020-60 | - |
| 设备 | - | - | - |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | 已停产 | 细胞内放大器/新型号 Axoclamp 900A |
| CapStar-100 呼气末 CO2 监测仪 | CWE | 11-10000 | 气体分析仪 |
| Grass S-88 | A-M Systems | 已停产 | 恒流刺激器 |
| 带柔性探针的恒温毯系统 | Harvard Apparatus | 507222F | 加热系统 |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | 细胞外放大器 |
| 显微操作器 | - | - | 定制/替代 IVM/Scientifica |
| P-1000 微电极拉制仪 | Sutter Instruments | P-1000 | 微电极拉制仪 |
| SAR-830/AP 小动物呼吸机 | CWE | 12-02100 | 呼吸机 |
| 支撑架 | - | - | 定制/替代 实验室标准底座 51601/Stoelting |
| 脊柱夹具 | - | - | 定制/替代 大鼠脊柱适配器 51695/Stoelting |
| TP-1 直流刺激器 | WiNUE | - | 经颅直流电刺激器（tsDCS stimulator） |
| 其他材料 | - | - | - |
| 1B150-4 玻璃毛细管 | WPI | 1B150-4 | 用于微电极制备 |
| 脱脂棉 | - | - | - |
| 柔性管路 | - | - | 用于连接呼吸机和 CO2 分析仪 |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | 用于填充微移液管 |
| 银丝 | - | - | 用于神经电极 |
参考文献
- Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90(2017).
- Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A.
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