脑卒中是一个全球性难题，目前治疗手段有限，且尚无临床疗法能够实现丢失脑组织的再生。本文介绍了一种在啮齿类动物运动皮层中精确诱导光血栓性脑卒中的方法，以及随后注射水凝胶生物材料以研究其对脑卒中后组织再生影响的实验方案。
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摘要
摘要
脑卒中是美国致残的首要原因和死亡的第五大原因。大约87%的脑卒中为缺血性脑卒中，其定义为向大脑供血的血管突然发生阻塞。在血管阻塞后的数分钟内，细胞开始死亡，导致不可逆的组织损伤。目前的治疗策略主要集中于血栓清除或溶解，以实现再灌注并防止更严重的脑损伤。尽管大脑的短暂可塑性可能随时间推移挽救部分受损组织，但仍有相当比例的患者遗留无法恢复的神经功能缺损。针对脑卒中引起的神经功能缺损，目前缺乏有效的治疗手段，这凸显了开发新策略以应对日益增长的患者群体的迫切需求。可注射生物材料正在被设计用于增强大脑可塑性，并通过递送活性因子或干细胞来促进内源性修复。测试这些方法的一种途径是利用啮齿类动物脑卒中模型，将生物材料注射至脑卒中核心区域，并评估修复效果。明确脑卒中核心的精确位置对于卒中后的准确治疗至关重要，因此，采用可产生可预测卒中位置的动物模型更为理想，以避免注射前必须进行影像学检查。以下实验方案将介绍如何诱导光化学血栓性脑卒中、如何以可控且精确的方式注射水凝胶，以及如何在保持生物材料完整性的前提下提取脑组织并进行冷冻切片。此外，我们将重点说明这些相同的水凝胶材料如何用于干细胞的共递送。本方案可推广应用于其他可注射生物材料向脑卒中核心区域的递送。
引言
脑卒中是美国致残的首要原因，也是第五大死亡原因1。大约87%的脑卒中为缺血性脑卒中，其余13%中大多数为出血性脑卒中2。缺血性脑卒中是指动脉血流受阻，导致周围组织供血中断。这种阻塞会引起组织缺氧，进而发生坏死，常导致存活患者出现永久性残疾。尽管脑卒中的死亡率已有所下降3，但其患病人数预计到2030年将上升至340万人4。残疾幸存者人数的增加及其带来的经济负担，推动了以神经修复机制为重点的脑卒中研究。脑卒中发生后会经历一个炎症期，最终形成瘢痕组织，以防止坏死区域进一步扩大。围绕坏死核心的区域被称为“梗周区”，有充分证据表明，该区域的可塑性变化（包括血管新生、神经发生和轴突发芽）与动物模型及人类患者中观察到的功能恢复直接相关5。由于目前尚无体外模型能够准确模拟脑卒中后的复杂相互作用，动物模型在脑卒中研究中至关重要。
有多种体内模型可用于制备缺血性脑卒中。在小鼠中，最常用的模型之一是大脑中动脉阻塞（MCAo），可通过远端或近端（经动脉内缝线）阻塞实现。近端模型也称为缝线法MCAo（fMCAo），通常导致较大的缺血性脑卒中，梗死范围可占大脑半球的5%至50%，具体大小取决于多种因素6。在这些模型中，将....
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方案
实验按照杜克大学和加州大学洛杉矶分校的IUCAC规定进行。本研究使用8至12周龄的雄性C57Bl/6J小鼠。动物饲养环境温度控制在（22 ± 2 °C），光照-黑暗周期为12小时，可自由获取颗粒饲料和水 。镇痛和镇静方案均经IUCAC批准，但可能与其他实验室所用方案有所不同。
若动物在生存手术后出现过度躁动、发声（提示无法控制的疼痛）、自残行为、活动能力下降或受损、皮肤感染的体征、食欲减退和/或体重减轻超过10%-15%，则可能需要提前实施安乐死。注射凝胶预计不会产生不良反应，因其成分来源于天然 大脑中发生的聚合物。动物应 每天监测，包括周末和节假日，并每隔一天重新称重。本实验室及其他实验室的研究发现，小的皮质或皮质下脑卒中后的小鼠未出现理毛行为异常、体重减轻或戒断症状/慢性应激迹象。若动物出现局部头部伤口感染的任何征象，应 实施安乐死。还应监测动物的理毛情况、伤口状况以及动物间打斗的迹象（如背部伤口）。如果 如有打斗迹象或伤口裂开，动物应 首先在联系兽医后进行治疗。通常包括在饮水中添加抗生素和/或局部外用抗生素。如果这些措施未能促进愈合，应将动物 安乐死处死。
1. 材料与仪器的准备
- 手术前准备光血栓染料。将 15 mg 的玫瑰红（Rose Bengal）称量至一个 2 mL 微量离心管中。
警告：....
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结果
本方法旨在演示如何在脑卒中后向脑内注射生物材料。采用玫瑰红（rose bengal）结合520 nm激光的光化学血栓模型，以精确控制脑卒中病灶的大小和位置。脑卒中发生5天后，可在手术过程中观察到梗死区域（图1B），并通过TTC染色及成像IHC切片进一步确认（图2）。使用2倍镜头扩大激光直径后，脑卒中病灶在视觉上明显扩大，范围超过2.5 mm，而仅使用激光时病灶仅为1 mm的单一片段（图2）。由于该光化学血栓（PT）模型为微创操作，术中死亡率极低，不足1%。术后死亡率也较低，小鼠死亡比例低于5%。
在卒中发生五天后，注射透明质酸基水凝胶微粒（HMPs）（图3）。HMPs 注射至卒中病灶后发生退火，形成微退火颗粒（MAP），其具有多孔支架结构，可允许细胞迁移进入卒中核心区域（图4）。注射后第.......
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讨论
本文展示了一种易于重复、创伤最小且永久性的脑卒中模型，并描述了如何在脑卒中发生五天后将生物材料注射至梗死区域。通过使用光化学血栓染料玫瑰红（Rose Bengal）以及连接到立体定位仪的520 nm准直激光器，可精确地将脑卒中定位在小鼠的运动皮层。脑卒中发生五天后，梗死区域在肉眼可见，位于前囟点外侧2.0 mm的照射中心处。随后使用注射泵将水凝胶精确注入脑卒中核心区域。该模型在手术期间及脑卒中后的死亡率几乎为零，仅有极少数小鼠因麻醉相关并发症而在术后死亡。尽管光化学血栓（PT）性脑卒中模型在生物材料应用方面具有优势，但仍存在若干生物学限制和技术难点需要解决。
从生物学局限性来看，挫伤模型（PT）并非一种能够提供脑部再灌注选项的卒中模型，而再灌注过程在人类卒中中可能自发发生，或通过血管内取栓/溶栓治疗实现。此外，与通过阻塞主要脑血管来模拟大多数人类卒中病因的MCAo模型不同，PT是通过影响许多较小血管的血流来发挥作用。注射水凝胶生物材料存在一项技术难点，即此类材料在手术过程中容易粘附于注射器，或在组织取出时粘附于颅骨。设计一种在注射时保持液态、注入后原位成胶的水凝胶可解决第一个问题；.......
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披露
作者声明，TS 是 Tempo Therapeutics 的创始人，该公司致力于 MAP 水凝胶的商业化。
致谢
我们感谢美国国立卫生研究院和国立神经疾病与卒中研究所提供的资助（R01NS079691）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% 正常山羊血清 | VWR | 100504-028 | 用于封闭缓冲液 |
| 双层酒精预浸垫，无菌，中号 | Medline | MDS090735 | |
| 25 µL Hamilton 注射器 702RN，无针头 | Fisher Scientific | 14824663 | 用于注射生物材料的注射器 |
| 25 µL 正向置换移液器 | Gilson | M-25 | |
| 2倍扩束镜，400–650 nm | Thorlabs | GBE02-A | 激光扩束镜 |
| 可调式载物台平台 | Kopf Instruments | 901 | |
| 抗葡萄糖转运蛋白 GLUT1 抗体，兔源 | Abcam | ab113435 | |
| 抗 Iba1 抗体，山羊源 | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer 安全锁式采血套装，25G，12" | Medsupply | 367294 | 用于灌注 |
| BKF12 哑光黑色铝箔 | Thorlabs | BKF12 | 用于覆盖使用激光时可能反光的物体 |
| 骨用虹膜微型剪刀 - 3-1/2" | Sklar 外科器械 | 64-2035 | |
| C57BL/6 小鼠 | Jackson Laboratory | 000664 | 8–12 周龄 |
| 笼式组件 Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" 长，直径 6 mm，4 件装 — 用于将激光器连接至立体定位仪 |
| 碳钢钻头 - 0.5 mm 直径 | Fine Science Tools | 19007-05 | 用于制作钻孔 |
| 十二水合硫酸铬钾 | VWR | EM1.01036.0250 | |
| 带尾纤激光器紧凑型控制器 | Thorlabs | CLD1010LP | |
| 棉签 | VWR | 89031-288 | |
| CP 25 移液器吸头 | Gilson | F148012 | |
| 驴抗山羊 IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
| 驴抗兔 IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
| 驴抗大鼠 IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX 封片剂 | Electron Microscopy Sciences | 13512 | 载玻片封片溶液 |
| EMS 明胶粉末 A 型 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | 用于载玻片明胶包被 |
| EMS 多聚甲醛，颗粒状 | VWR | 100504-162 | 用于配制 4% 多聚甲醛 |
| ESD 工作站套件 | Elmstat | WSKK5324SB | 用于搭建激光系统 |
| 光纤支架壁板，无螺纹 | Thorlabs | HCA3 | 用于连接激光器与 Kopf 轴 |
| FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC & APC，f=4.6 mm，350–700 nm，直径 0.75 mm |
| 精细剪刀 - 直头/尖钝/10 cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| GFAP 抗体，大鼠源 | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| 加热板 | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge 疏水屏障笔 | Vector Laboratories | H-4000 | 用于载玻片染色 |
| IMPAC 6-集成式多患者麻醉中心 | VetEquip | 901808 | |
| 碘伏消毒垫 | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| #5 珠宝镊 | GFS chemicals | 46085 | |
| 激光防护眼镜 | Thorlabs | LG10B | 琥珀色镜片，可见光透过率 35%（也有护目镜版本） |
| M27-1084 高亮度 LED 双鹅颈灯 | United Scope | LED-11C | |
| 医用 USP 级氧气 | Airgas | OX USP250 | |
| Miltex Adson 组织镊，解剖级 | Integra Miltex | V96-118 | |
| 微型有线/无线小型动物毛发修剪器 | Harvard Apparatus | 72-6110 | |
| 微型泵，可变流速 | Thomas Scientific | 70730-064 | 用于灌注的泵 |
| 小鼠脑组织切片模具，冠状面切片，1 mm | Kent Scientific | RBMA-200c | 用于 TTC 切片 |
| 小鼠气体麻醉头固定装置 | Kopf Instruments | 923-B | |
| Nanojet 控制盒 | Chemyx | 10050 | |
| Nanojet 泵接头 | Chemyx | 10051 | 连接至立体定位装置以注射生物材料 |
| 针头 RN 30G PT STY 3，0.5 英寸 | Fisher Scientific | NC9459562 | |
| 非穿刺式耳杆 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS 缓冲液 pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
| 尾纤式激光器 520 nm，100 mW，5G 针 | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| 带正电荷的玻璃载玻片 | Hareta | AHS90-WH | |
| 功率/能量计 | Thorlabs | PM100D | 用于测量激光器的 mW 输出功率 |
| Puralube Vet 软膏 | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| 小鼠直肠探头 | Kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
| 玫瑰红染料 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| 轴体改装，8-32 螺纹孔，深度 1/2" | Kopf Instruments | 1770-02 | 用于将激光器连接至立体定位装置 |
| 超薄光电二极管功率传感器 | Thorlabs | S130VC | 与功率能量计配合使用 |
| SM1 螺纹 30 mm 笼板，厚度 0.35"，带两个固定环 | Thorlabs | CP02 | 用于连接激光扩束镜 |
| Sol-M U-100 胰岛素注射器，带 1/2 单位刻度，0.5 mL | VWR | 10002-726 | 用于注射玫瑰红 |
| StainTray 载玻片染色系统 | Simport Scientific | M920-2 | 用于载玻片染色 |
| 立体定位仪 | Kopf Instruments | 940 | 小型动物立体定位仪 |
| 学生用 Adson 镊子 - 1×2 齿 | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| 学生用精细镊子 - 直头/宽柄 | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| 温度控制器 | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Tissue-Tek OCT 包埋剂 | VWR | 25608-930 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| 上支架夹具 | Kopf Instruments | 1770-c | 用于将激光器连接至立体定位装置 |
| Vetbond 组织粘合剂 3 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
| Vogue Professional My Manicurist | Bargain Source | 6400 | 用于钻头 |
| VWR 珠式灭菌器 | VWR | 75999-328 | |
| Tissue Tek OCT 包埋剂 | Sakura | 4583 | 用于组织包埋 |
参考文献
- National Center for Health Statistics. Health, United States, 2015: With Special Feature on Racial and Ethnic Health Disparities. , U.S. Department of Health and Human Services. Hyattsville, MD. No. 2016-123 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke stati....
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重印与许可
