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方法文章

脑卒中后向脑内注射水凝胶生物材料支架

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DOI：

10.3791/61450

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2020年10月1日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Department of Neurology, University of California Los Angeles, 3Department of Neurology, Duke University, 4Department of Dermatology, Duke University

本文内容

摘要

脑卒中是一个全球性难题，目前治疗手段有限，且尚无临床疗法能够实现丢失脑组织的再生。本文介绍了一种在啮齿类动物运动皮层中精确诱导光血栓性脑卒中的方法，以及随后注射水凝胶生物材料以研究其对脑卒中后组织再生影响的实验方案。

摘要

脑卒中是美国致残的首要原因和死亡的第五大原因。大约87%的脑卒中为缺血性脑卒中，其定义为向大脑供血的血管突然发生阻塞。在血管阻塞后的数分钟内，细胞开始死亡，导致不可逆的组织损伤。目前的治疗策略主要集中于血栓清除或溶解，以实现再灌注并防止更严重的脑损伤。尽管大脑的短暂可塑性可能随时间推移挽救部分受损组织，但仍有相当比例的患者遗留无法恢复的神经功能缺损。针对脑卒中引起的神经功能缺损，目前缺乏有效的治疗手段，这凸显了开发新策略以应对日益增长的患者群体的迫切需求。可注射生物材料正在被设计用于增强大脑可塑性，并通过递送活性因子或干细胞来促进内源性修复。测试这些方法的一种途径是利用啮齿类动物脑卒中模型，将生物材料注射至脑卒中核心区域，并评估修复效果。明确脑卒中核心的精确位置对于卒中后的准确治疗至关重要，因此，采用可产生可预测卒中位置的动物模型更为理想，以避免注射前必须进行影像学检查。以下实验方案将介绍如何诱导光化学血栓性脑卒中、如何以可控且精确的方式注射水凝胶，以及如何在保持生物材料完整性的前提下提取脑组织并进行冷冻切片。此外，我们将重点说明这些相同的水凝胶材料如何用于干细胞的共递送。本方案可推广应用于其他可注射生物材料向脑卒中核心区域的递送。

引言

脑卒中是美国致残的首要原因，也是第五大死亡原因1。大约87%的脑卒中为缺血性脑卒中，其余13%中大多数为出血性脑卒中2。缺血性脑卒中是指动脉血流受阻，导致周围组织供血中断。这种阻塞会引起组织缺氧，进而发生坏死，常导致存活患者出现永久性残疾。尽管脑卒中的死亡率已有所下降3，但其患病人数预计到2030年将上升至340万人4。残疾幸存者人数的增加及其带来的经济负担，推动了以神经修复机制为重点的脑卒中研究。脑卒中发生后会经历一个炎症期，最终形成瘢痕组织，以防止坏死区域进一步扩大。围绕坏死核心的区域被称为“梗周区”，有充分证据表明，该区域的可塑性变化（包括血管新生、神经发生和轴突发芽）与动物模型及人类患者中观察到的功能恢复直接相关5。由于目前尚无体外模型能够准确模拟脑卒中后的复杂相互作用，动物模型在脑卒中研究中至关重要。

有多种体内模型可用于制备缺血性脑卒中。在小鼠中，最常用的模型之一是大脑中动脉阻塞（MCAo），可通过远端或近端（经动脉内缝线）阻塞实现。近端模型也称为缝线法MCAo（fMCAo），通常导致较大的缺血性脑卒中，梗死范围可占大脑半球的5%至50%，具体大小取决于多种因素6。在这些模型中，将一根缝线或细丝从颈内动脉推进至大脑中动脉（MCA）起始部，并保持一定时间。这种阻塞方法可以是暂时性的或永久性的，所产生的梗死主要位于纹状体，可能累及也可能不累及表层皮质6。最终形成的脑卒中体积变异较大，因此需要使用激光多普勒等成像技术来确认每只小鼠手术操作的有效性。当动脉内或腔内缝线阻塞持续时间超过30分钟时，通常会产生较大体积的脑卒中。一些研究者专注于较短时间的缝线阻塞，但这需要高度精细的实验设计和实验室验证7。小鼠的缝线法MCAo模型在细胞死亡过程、缺血进展以及梗周区域形成等方面，与人类脑卒中病例具有相似的阶段特征；然而，较大的梗死更接近于恶性脑梗死的疾病状态，而这类脑卒中在临床上相对少见且治疗难度更大6。相比之下，远端MCA阻塞需要更复杂的手术操作和开颅。在此模型中，直接通过结扎缝线或电凝方式阻塞沿脑表面走行的大脑中动脉远端部分。在该技术的一些变体中，颈总动脉可被单侧或短暂双侧阻塞。远端MCAo的一个优势是其产生的皮质梗死体积变异较小，相较于缝线模型更为稳定。然而，由于该模型需切断外颈动脉（ECA），导致行为学表现较差，这一点在fMCAo模型中同样值得关注6。

另一种侵入性较小的卒中模型是光化学血栓形成（PT）模型。该模型可产生位置明确的缺血区域，且具有较高的存活率8。该技术依赖于腹腔注射一种光敏染料，通过光照或激光照射目标组织即可实现血管内光氧化反应9。染料在激发后产生氧自由基，导致内皮细胞损伤，从而激活血小板聚集并在照射区域形成血栓8,9。由于PT模型对卒中大小和位置具有高度可控性，且可重复性高，因此非常适合用于生物材料的研究。尽管可通过激光与立体定位坐标实现精确控制，但该模型仍存在一些局限性，可能使其在某些研究中不够理想。与fMCAo模型不同，PT卒中模型无法实现再灌注，因此不适合用于研究针对再灌注后损伤或再灌注相关机制的神经保护剂8。此外，由于PT模型主要造成微血管损伤，其缺血半暗带相对较小，反而容易出现局部血管源性脑水肿，这与人类卒中的病理特征不符，因此该模型不适用于以梗死周围区域为重点的临床前药物研究6,8。

生物材料策略在脑卒中治疗中的总体目标是递送生物活性物质，或作为脑组织生长的替代性细胞外基质。我们将通过本方法探讨的一种策略是将水凝胶直接递送至脑卒中病灶核心区域，而非目前许多细胞疗法所针对的梗周组织10。该策略的理论依据在于，将材料递送至病灶核心的坏死组织中，可避免对周围健康或正在恢复的脑组织造成干扰。我们假设，生物材料中包含的任何活性物质均可从病灶核心扩散至梗周区域，尤其是我们发现水凝胶生物材料的递送能够减少胶质瘢痕的厚度11。这一点至关重要，因为已有研究表明，梗周区域在脑卒中后具有神经可塑性，因而成为极具吸引力的治疗靶点。此外，向脑卒中病灶核心递送的替代基质可负载促血管生成12或促神经发生13因子，以引导新组织的形成，同时也可携带细胞进行递送14。使用基质可显著增强细胞递送效果，因为基质能够保护细胞免受注射过程中强烈的机械力和局部恶劣环境的影响，同时促进细胞的分化与植入15。

这些可注射治疗性生物材料在脑卒中治疗中具有临床相关性，因为目前尚无能够促进卒中后神经元恢复的医学疗法。参与恢复过程的潜在神经回路位于紧邻卒中病灶核心的脑组织中16，而卒中病灶核心本身则缺乏可存活的神经组织。我们预计，将生物材料递送至坏死的卒中核心区域，有可能通过前述多种机制刺激邻近组织向再生过程发展，包括生长因子的储库式释放13、促进组织长入及恢复性脑组织发育11,12、调节免疫反应17，以及递送干细胞来源的治疗因子14,18。然而，为了有效研究这些应用的可能性，需要建立一种稳定且可重复的诱导卒中并注射生物材料的方法。光血栓形成（PT）卒中模型所采用的技术可精确控制卒中的方向和位置。立体定位装置上连接的激光用于引导定位方向，而连接在立体定位装置上的泵则可控制材料的注射速率，无需额外的成像手段。因此，本文选择描述在小鼠运动皮层实施PT卒中及向卒中核心注射生物材料的方法。在此，我们采用微孔退火颗粒（MAP）水凝胶作为注射用生物材料，未添加任何细胞或生长因子。此外，我们还解释了如何成功获取保留完整生物材料的脑组织，并讨论了用于分析注射与未注射生物材料情况下卒中结局的免疫组织化学检测方法。

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方案

实验按照杜克大学和加州大学洛杉矶分校的IUCAC规定进行。本研究使用8至12周龄的雄性C57Bl/6J小鼠。动物饲养环境温度控制在（22 ± 2 °C），光照-黑暗周期为12小时，可自由获取颗粒饲料和水 。镇痛和镇静方案均经IUCAC批准，但可能与其他实验室所用方案有所不同。

若动物在生存手术后出现过度躁动、发声（提示无法控制的疼痛）、自残行为、活动能力下降或受损、皮肤感染的体征、食欲减退和/或体重减轻超过10%-15%，则可能需要提前实施安乐死。注射凝胶预计不会产生不良反应，因其成分来源于天然 大脑中发生的聚合物。动物应 每天监测，包括周末和节假日，并每隔一天重新称重。本实验室及其他实验室的研究发现，小的皮质或皮质下脑卒中后的小鼠未出现理毛行为异常、体重减轻或戒断症状/慢性应激迹象。若动物出现局部头部伤口感染的任何征象，应 实施安乐死。还应监测动物的理毛情况、伤口状况以及动物间打斗的迹象（如背部伤口）。如果 如有打斗迹象或伤口裂开，动物应 首先在联系兽医后进行治疗。通常包括在饮水中添加抗生素和/或局部外用抗生素。如果这些措施未能促进愈合，应将动物 安乐死处死。  

1. 材料与仪器的准备

  1. 手术前准备光血栓染料。将 15 mg 的玫瑰红（Rose Bengal）称量至一个 2 mL 微量离心管中。
    警告：玫瑰红（Rose Bengal）可能导致严重的眼部损伤/刺激。
    1. 将玫瑰红（Rose Bengal）溶于 1.5 mL 无菌过滤的 1× PBS 中，配制成 10 mg/mL 的工作浓度。
    2. 涡旋振荡管子，直至无可见结块，表明染料已完全溶解，然后用铝箔包裹，待后续使用。
      注意：所需染料的量取决于小鼠数量。染料以 10 µL/g 的剂量腹腔注射（IP），例如，20 g 小鼠注射 200 µL。
  2. 打开加热垫，以在麻醉期间维持小鼠体温（37 °C）。
  3. 准备已灭菌的剪刀、镊子、棉球、兽用眼膏、外科胶水或缝合材料、蓝色或黑色手术标记笔，以及无菌酒精和碘伏擦拭片。准备配备已灭菌钻头的骨钻。
  4. 将 bead 灭菌装置加热至 160 °C，以便在不同小鼠手术之间对器械进行灭菌。另准备一个含有无菌生理盐水或 1× PBS 溶液的 50 mL 锥形管，用于后续保持手术区域湿润。
  5. 将激光器连接至立体定位仪。佩戴激光防护眼镜，测量激光功率（mW）。
    警告：在操作过程中，只要开启激光器，必须佩戴激光防护眼镜。
    1. 根据激光器制造商的说明，调节激光控制台上的电流，使激光输出功率显示为 10 mW，并将该电流值设为控制台主界面上的一个预设值。然后再次调节电流，设定另一个预设值，使激光输出功率为 40 mW。随后关闭激光器，待后续使用。
      注意：10 mW 功率将用于使用前的激光定位。
  6. 为术后小鼠准备一个清洁的笼子。然后将小鼠放入诱导室，使用 4% 异氟烷浓度进行麻醉，直至其自发运动停止，呼吸变为缓慢而稳定的节律。
  7. 小鼠入睡后，称量其体重，以确定需注射的玫瑰红（Rose Bengal）染料剂量。随后将小鼠转移并固定至立体定位仪，维持 1.5% 的异氟烷浓度。
    注意：提高异氟烷浓度可能导致血管扩张，从而妨碍充分的血管闭塞，或导致小鼠间脑卒中大小不一致。
  8. 在两只眼睛上涂抹兽用眼膏。
    注意：在整个操作过程中密切观察呼吸和体温，并偶尔轻捏脚趾，以确保小鼠无任何痛觉反应。

2. 光化学血栓性脑卒中模型9

  1. 用剃毛工具剃除小鼠头部的毛发，并使用酒精棉片擦拭，随后用碘伏棉片进行无菌处理，重复三次。
    注意：如有必要，最后可额外使用一次酒精棉片彻底清除残留的碘伏，因为碘伏会引起皮肤刺激，导致小鼠术后抓挠颅骨。
  2. 使用小型手术剪，在耳朵之间向眼睛方向做一条长约1-2 cm的侧向切口。操作时用镊子将皮肤向上提起形成帐篷状，先向下剪开一次，然后将剪刀插入切口，沿中线连续剪开形成切口。
  3. 分离皮肤，用镊子轻压顶骨以定位前囟点。使用手术标记笔在前囟点处做一个标记。
    注意：骨片的移动可提示顶骨的额骨边界。前囟点是额骨与顶骨骨片交汇的中心位置（图1A）。
  4. 佩戴激光防护眼镜，将激光探头移至小鼠颅骨上方，并将立体定位仪固定在90°角位置。选择10 mW预设模式，打开激光。
    1. 调节激光的x轴和y轴，使其正对前囟点。在数字显示控制台上重置x和y坐标，然后将激光向左移动1.8 mm。此时将激光尽可能靠近颅骨，但不要接触颅骨。
    2. 将激光移至前囟点左侧2.2 mm处，确认其移动路径无障碍，随后关闭激光。
  5. 使用一次性29 G针头经腹腔注射适量的玫瑰红染料（IP）。立即启动7分钟计时器，使染料在体内充分循环。选择40 mW预设模式，但暂不开启激光。
    注意：熟练掌握操作流程后，可在小鼠无菌准备前注射染料，并确保在7分钟内完成全部准备步骤，以节省时间。
  6. 当7分钟计时结束时，佩戴激光防护眼镜，开启激光（40 mW），并设置10分钟计时器。
    1. 10分钟后，在不关闭激光的情况下将其移至前囟点左侧2.2 mm处，并再次设置10分钟计时器。
    2. 第二个10分钟计时结束后，将激光功率调回10 mW，并将激光移至前囟点左侧2.0 mm处。使用手术标记笔标记该位置，随后关闭激光。
    3. 抬起激光探头并解除90°角锁定，将其移离小鼠。此时若手术区域干燥，可使用棉签涂抹无菌生理盐水或PBS。
  7. 在2.0 mm标记处，垂直于颅骨表面以短脉冲方式钻孔。
    注意：钻孔时应缓慢进行，避免过深损伤脑组织。当钻头穿透颅骨时，会感受到轻微的阻力下降或变化，钻孔过程可能引起出血。
    1. 使用棉签吸除多余血液。钻孔后颅骨动脉轻微损伤出血属正常现象；若出血过多，提示钻头已触及脑组织。若发生此情况，记录小鼠编号后继续实验。
  8. 在小鼠旁放置一小块擦拭布。用镊子将皮肤边缘拉近，为粘合做准备。
    注意：此处也可选择缝合。通常仅需3针即可完成缝合。
    1. 用镊子夹住皮肤两侧并拉拢提起。在涂抹手术胶前，先将胶头末端的大滴胶液在擦拭布上轻蘸去除。
    2. 少量涂抹手术胶，并用镊子将皮肤压合10秒。重复操作直至无可见缝隙。
      注意：胶液流出较快，切勿挤压胶瓶。避免将皮肤粘连至颅骨，或使胶液进入眼睛。
  9. 粘合或缝合完成后，将小鼠放入新笼中恢复麻醉。动物通常需要5-10分钟恢复意识，可将笼子一半置于加热垫上以助恢复。

3. 假手术操作

  1. 除注射1× PBS或生理盐水代替玫瑰红染料外，其余所有操作步骤均与上述第2节所述操作完全相同。

4. 注射水凝胶或其他生物材料

  1. 在用户定义的时间点进行生物材料注射。本实验中，注射在卒中后5至7天之间进行。注射2–6 µL水凝胶（由用户定义）。
    1. 打开加热垫，以在麻醉期间维持小鼠体温（37 °C）。
    2. 准备已灭菌的剪刀、镊子、棉球、兽用眼膏、手术胶或缝合材料，以及无菌酒精和碘伏擦拭片。准备配备无菌钻头的骨钻，以及装有金属30 G针头的25 µL玻璃哈密尔顿注射器。
    3. 将 bead sterilization 装置加热至160 °C，以便在不同小鼠之间对器械进行灭菌。
    4. 将注射泵连接至立体定位仪。设定流速为1 µL/min，注射体积为4 µL。
    5. 为术后小鼠准备一个清洁的笼子。
  2. 将小鼠放入诱导室，使用4%异氟烷浓度进行麻醉，直至其自发运动停止，呼吸变为缓慢而稳定的节律。
    1. 待小鼠入睡后，将其转移并固定在立体定位仪上，维持1.5%异氟烷浓度。
    2. 在双眼涂抹兽用眼膏。
    3. 剃除小鼠头部可能再生的毛发，并使用酒精擦拭片随后使用碘伏擦拭片对术区进行无菌处理。重复三次。
      注意：如有必要，最后可额外使用一次酒精擦拭片，彻底清除所有碘伏残留，因其可能引起皮肤刺激，导致小鼠术后抓挠颅骨。
  3. 使用小剪刀和/或镊子重新切开脑部上方的皮肤。用蘸有无菌生理盐水或PBS的棉球清理颅骨上的任何碎屑。此时可见一个白色至黄色的环形区域（即卒中区域，图1B）以及钻孔留下的孔洞。若无法观察到坏死组织，则可能未发生卒中。若钻孔未位于卒中区域正上方，应重新钻孔以对准中心。
  4. 将注射泵定位在小鼠上方，并锁定为90°角。在反向加样前，先用无菌生理盐水或PBS溶液清洗注射器。
    1. 清洗完毕后，拆卸玻璃注射器，使其不带针头。使用25 µL正排量移液器将10 µL水凝胶（或其他含或不含细胞的生物材料）从后端加载入注射器。
    2. 使用注射器推杆将凝胶完全推至注射器前端。然后重新组装注射器，并继续推动推杆，直至凝胶明显从针头渗出。
  5. 将注射器安装到泵上。可能需要调整泵的后部以适配注射器。通过将流速设为30 µL/min，根据所需移动方向选择回抽或注射，然后按下开始按钮进行调整。当泵的后部到达正确位置时，按下停止按钮。
    1. 旋紧泵的后部，使注射器固定牢固。如之前进行了调整，需确保流速已恢复至1 µL/min，并设置为注射模式。
  6. 移动泵的x和y方向，使其对准钻孔位置。沿z方向向下移动泵，直至注射器针头接触孔口顶部。
  7. 重置数字显示控制台上的z轴读数。然后，将注射器沿z方向再下移0.750 mm。若注射器发生弯曲或遇到阻力，说明颅骨可能已愈合或未完全钻透，需重新钻孔。
  8. 在泵控制台上按下开始按钮，以1 µL/min的速率注射4–6 µL水凝胶。
  9. 当泵停止注射后，设定5分钟计时器，以允许凝胶开始交联。
  10. 5分钟后，通过旋转z轴旋钮缓慢上提注射器。观察是否有材料被意外抽出或从孔中泄漏。当针头远离颅骨足够距离后，解锁泵并将其移开。
  11. 使用镊子、手术胶或缝线闭合头部皮肤。将小鼠放入清洁笼中并观察其恢复情况。小鼠从麻醉中恢复通常需要约5–10分钟。

5. 灌注与样本采集

  1. 使用异氟烷麻醉小鼠。
  2. 将动物固定于仰卧位，沿中线切开腹腔。可选操作：夹闭腹主动脉降支，以减少固定液和PBS的用量。
  3. 切开膈肌，向上推开肋骨两侧以打开胸腔。将灌注套管插入左心室，并在右心房剪开一个小口。开始缓慢灌注10–20 mL PBS，直至流出液基本澄清。
  4. 当流出液变清后，更换为4%多聚甲醛（PFA）继续灌注10–20 mL。此时可松开固定四肢的针，使其在PFA灌注过程中自然收缩。待肢体停止活动后，再等待30秒。
  5. 将动物断头，向后剥离皮肤以暴露颅骨。使用钝头、细小的镊子小心去除颅骨碎片，暴露脑组织。在移除梗死灶上方颅骨时需格外小心。此处可使用小型手术剪辅助剪除颅骨。最大的挑战是颅骨去除过程中，凝胶可能粘附在颅骨上并随其带出脑组织。
  6. 脑组织完全离体后，置于10–15 mL 4% PFA中固定过夜（不超过24小时）。
  7. 次日将脑组织从PFA转移至30%蔗糖溶液中。当脑组织完全沉降至管底时（约需2–3天），即可用于冷冻切片。此时也可长期保存。

6. 冷冻切片与染色

  1. 将脑组织从蔗糖中取出，置于玻璃载片上。用剃刀片切下脑组织后部的一小部分，以形成一个平整的表面，便于固定到样本夹（chuck）上。
    1. 在样本夹上滴加适量最佳切割温度化合物（OCT），然后将脑组织平整面朝下放置于OCT中。将该样本置于干冰上直至冻结，或置于冷冻切片机的冷冻台上。
      注意：可添加OCT完全包裹脑组织，以帮助防止切片过程中组织从脑组织上分离。
  2. 在-20 °C条件下，使用冷冻切片机对脑组织进行连续切片，厚度为30 µm，每张明胶包被的载玻片上收集10片切片。切片时需小心操作，避免丢失水凝胶。若操作困难，可在脑组织表面的凝胶上方覆盖少量OCT（图3）。切片完成后于-80 °C保存，待后续使用。
  3. 从-80 °C取出载玻片，置于染色缸中使其自然干燥。未冷冻仅刚切好的切片也可立即进行染色。
  4. 使用疏水性笔在载玻片上的脑切片周围画出一个圆圈。待其干燥后，用1×过滤PBS重新水化脑切片，并在室温下置于摇床上振荡15分钟。每张载玻片（含9–12个脑切片）约需1 mL缓冲液。
  5. 用1×过滤PBS在室温下洗涤载玻片5分钟，重复三次。
  6. 在室温下，使用含10%驴血清和0.01% PBS-Triton X的封闭液在摇床上封闭30分钟至1小时。每张载玻片约需200 µL封闭液。
  7. 将一抗抗体溶于含10%驴血清和0.01% PBS-Triton X的溶液中，在4°C下于摇床上孵育过夜。使用前应先测试一抗，以确定最佳工作浓度。本实验中使用了GFAP（1:400）、Iba1（1:250）、Glut1（1:500）（图4）。
  8. 次日，用1×过滤PBS在室温下洗涤载玻片5分钟，重复三次。
  9. 在室温下，将二抗抗体和DAPI溶于含10%驴血清和0.01% PBS-Triton X的溶液中，在摇床上孵育2小时。所有二抗和DAPI的稀释比例均为1:1,000。
  10. 用1×过滤PBS洗涤载玻片5分钟。
  11. 将切片置于室温避光环境中自然干燥。干燥时间约为20分钟至4小时；将载玻片置于干燥器中可加快干燥过程。
  12. 依次使用浓度递增的酒精溶液（每种溶液1分钟）进行脱水处理：50%、70%、95%、100%和100%。
  13. 先在第一缸二甲苯中脱脂1分钟，再在第二缸二甲苯中脱脂5分钟。
  14. 迅速逐张取出载玻片，在切片仍被二甲苯润湿时立即滴加封片剂，并快速加盖盖玻片。应根据所用载玻片和成像显微镜的要求，选择合适长度和厚度的盖玻片。
  15. 用移液器吸头从载玻片中心向外轻轻按压，以排除盖玻片下的气泡。将DPX封片剂在室温避光条件下干燥4小时至过夜。
  16. 用剃刀片刮除载玻片上溢出并已干燥的封片剂，再用镜头清洁剂擦拭载玻片表面。此时载玻片可用于荧光显微镜成像。
    注意：建议在完成成像前将载玻片避光保存或置于4 °C环境中。

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结果

本方法旨在演示如何在脑卒中后向脑内注射生物材料。采用玫瑰红（rose bengal）结合520 nm激光的光化学血栓模型，以精确控制脑卒中病灶的大小和位置。脑卒中发生5天后，可在手术过程中观察到梗死区域（图1B），并通过TTC染色及成像IHC切片进一步确认（图2）。使用2倍镜头扩大激光直径后，脑卒中病灶在视觉上明显扩大，范围超过2.5 mm，而仅使用激光时病灶仅为1 mm的单一片段（图2）。由于该光化学血栓（PT）模型为微创操作，术中死亡率极低，不足1%。术后死亡率也较低，小鼠死亡比例低于5%。

在卒中发生五天后，注射透明质酸基水凝胶微粒（HMPs）（图3）。HMPs 注射至卒中病灶后发生退火，形成微退火颗粒（MAP），其具有多孔支架结构，可允许细胞迁移进入卒中核心区域（图4）。注射后第...

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讨论

本文展示了一种易于重复、创伤最小且永久性的脑卒中模型，并描述了如何在脑卒中发生五天后将生物材料注射至梗死区域。通过使用光化学血栓染料玫瑰红（Rose Bengal）以及连接到立体定位仪的520 nm准直激光器，可精确地将脑卒中定位在小鼠的运动皮层。脑卒中发生五天后，梗死区域在肉眼可见，位于前囟点外侧2.0 mm的照射中心处。随后使用注射泵将水凝胶精确注入脑卒中核心区域。该模型在手术期间及脑卒中后的死亡率几乎为零，仅有极少数小鼠因麻醉相关并发症而在术后死亡。尽管光化学血栓（PT）性脑卒中模型在生物材料应用方面具有优势，但仍存在若干生物学限制和技术难点需要解决。

从生物学局限性来看，挫伤模型（PT）并非一种能够提供脑部再灌注选项的卒中模型，而再灌注过程在人类卒中中可能自发发生，或通过血管内取栓/溶栓治疗实现。此外，与通过阻塞主要脑血管来模拟大多数人类卒中病因的MCAo模型不同，PT是通过影响许多较小血管的血流来发挥作用。注射水凝胶生物材料存在一项技术难点，即此类材料在手术过程中容易粘附于注射器，或在组织取出时粘附于颅骨。设计一种在注射时保持液态、注入后原位成胶的水凝胶可解决第一个问题；...

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披露

作者声明，TS 是 Tempo Therapeutics 的创始人，该公司致力于 MAP 水凝胶的商业化。

致谢

我们感谢美国国立卫生研究院和国立神经疾病与卒中研究所提供的资助（R01NS079691）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% 正常山羊血清VWR100504-028用于封闭缓冲液
双层酒精预浸垫，无菌，中号MedlineMDS090735
25 µL Hamilton 注射器 702RN，无针头Fisher Scientific14824663用于注射生物材料的注射器
25 µL 正向置换移液器GilsonM-25
2倍扩束镜，400–650 nmThorlabsGBE02-A激光扩束镜
可调式载物台平台Kopf Instruments901
抗葡萄糖转运蛋白 GLUT1 抗体，兔源Abcamab113435
抗 Iba1 抗体，山羊源abcamab5076
BD Vacutainer 安全锁式采血套装，25G，12"Medsupply367294用于灌注
BKF12 哑光黑色铝箔ThorlabsBKF12用于覆盖使用激光时可能反光的物体
骨用虹膜微型剪刀 - 3-1/2"Sklar 外科器械64-2035
C57BL/6 小鼠Jackson Laboratory0006648–12 周龄
笼式组件 RobThorlabsER3-P43" 长，直径 6 mm，4 件装 — 用于将激光器连接至立体定位仪
碳钢钻头 - 0.5 mm 直径Fine Science Tools19007-05用于制作钻孔
十二水合硫酸铬钾VWREM1.01036.0250
带尾纤激光器紧凑型控制器ThorlabsCLD1010LP
棉签VWR89031-288
CP 25 移液器吸头GilsonF148012
驴抗山羊 IgG H&L (488)abcamab150129
驴抗兔 IgG H&L (647)abcamab150075
驴抗大鼠 IgG H&L (555)abcamab150154
EMS DPX 封片剂Electron Microscopy Sciences13512载玻片封片溶液
EMS 明胶粉末 A 型 300 BloomElectron Microscopy Sciences16564用于载玻片明胶包被
EMS 多聚甲醛，颗粒状VWR100504-162用于配制 4% 多聚甲醛
ESD 工作站套件ElmstatWSKK5324SB用于搭建激光系统
光纤支架壁板，无螺纹ThorlabsHCA3用于连接激光器与 Kopf 轴
FiberPortThorlabsPAF-X-5-AFC/APC & APC，f=4.6 mm，350–700 nm，直径 0.75 mm
精细剪刀 - 直头/尖钝/10 cmFine Science Tools14028-10
GFAP 抗体，大鼠源Thermo Fisher Scientific13-0300
加热板Kopf InstrumentsHP-4M
ImmEdge 疏水屏障笔Vector LaboratoriesH-4000用于载玻片染色
IMPAC 6-集成式多患者麻醉中心VetEquip901808
碘伏消毒垫Medx SuppleMED MDS093917H
#5 珠宝镊GFS chemicals46085
激光防护眼镜ThorlabsLG10B琥珀色镜片，可见光透过率 35%（也有护目镜版本）
M27-1084 高亮度 LED 双鹅颈灯United ScopeLED-11C
医用 USP 级氧气AirgasOX USP250
Miltex Adson 组织镊，解剖级Integra MiltexV96-118
微型有线/无线小型动物毛发修剪器Harvard Apparatus72-6110
微型泵，可变流速Thomas Scientific70730-064用于灌注的泵
小鼠脑组织切片模具，冠状面切片，1 mmKent ScientificRBMA-200c用于 TTC 切片
小鼠气体麻醉头固定装置Kopf Instruments923-B
Nanojet 控制盒Chemyx10050
Nanojet 泵接头Chemyx10051连接至立体定位装置以注射生物材料
针头 RN 30G PT STY 3，0.5 英寸Fisher ScientificNC9459562
非穿刺式耳杆 60ºKopf Instruments922
PBS 缓冲液 pH 7.4VWR97062 338
尾纤式激光器 520 nm，100 mW，5G 针ThorlabsLP520-MF100
带正电荷的玻璃载玻片HaretaAHS90-WH
功率/能量计ThorlabsPM100D用于测量激光器的 mW 输出功率
Puralube Vet 软膏Dr. Foster Smith9N-76855
小鼠直肠探头Kopf InstrumentsRet-3-ISO
玫瑰红染料 95%Sigma-Aldrich330000-5G
轴体改装，8-32 螺纹孔，深度 1/2"Kopf Instruments1770-02用于将激光器连接至立体定位装置
超薄光电二极管功率传感器ThorlabsS130VC与功率能量计配合使用
SM1 螺纹 30 mm 笼板，厚度 0.35"，带两个固定环ThorlabsCP02用于连接激光扩束镜
Sol-M U-100 胰岛素注射器，带 1/2 单位刻度，0.5 mLVWR10002-726用于注射玫瑰红
StainTray 载玻片染色系统Simport ScientificM920-2用于载玻片染色
立体定位仪Kopf Instruments940小型动物立体定位仪
学生用 Adson 镊子 - 1×2 齿Fine Science Tools91127-12
学生用精细镊子 - 直头/宽柄Fine Science Tools91113-10
温度控制器Kopf InstrumentsTCAT-2LV
Tissue-Tek OCT 包埋剂VWR25608-930
Triton X-100VWR97063-864
上支架夹具Kopf Instruments1770-c用于将激光器连接至立体定位装置
Vetbond 组织粘合剂 3 mLSanta Cruz Biotechnologysc-361931
Vogue Professional My ManicuristBargain Source6400用于钻头
VWR 珠式灭菌器VWR75999-328
Tissue Tek OCT 包埋剂Sakura4583用于组织包埋

参考文献

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