从福尔马林固定石蜡包埋的人动脉粥样硬化病变中优化高质量 DNA 提取

摘要

在这里，我们提出了一种从人颈动脉的福尔马林固定石蜡包埋病变中提取半自动 DNA 的方案。组织裂解在没有有毒二甲苯的情况下进行，然后进行自动化 DNA 提取方案，包括第二个裂解步骤、DNA 与顺磁性颗粒结合以进行基于纤维素的结合、洗涤步骤和 DNA 洗脱。

摘要

福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 组织是分子分析和临床基因组研究的宝贵来源。这些组织通常细胞不足或难以处理。因此，需要仔细分离核酸。近年来，已经为许多疾病（主要是癌症）的组织建立了各种 DNA 分离方法。不幸的是，由于核酸链和蛋白质之间的交联以及序列的随机断裂，从 FFPE 组织中提取的基因组 DNA 会高度降解。因此，这些样品的 DNA 质量显著降低，成为进一步分子下游分析的挑战。困难组织的其他问题是，例如，钙化的人类动脉粥样硬化病变和脂肪组织中缺乏细胞，皮肤活检小，因此所需核酸的可用性低，就像在旧组织或固定组织中一样。

在我们的实验室中，我们建立了一种使用半自动分离系统从福尔马林固定的动脉粥样硬化病变中提取 DNA 的方法。我们将该方法与其他市售提取方案进行了比较，并专注于进一步的下游分析。通过光谱法和荧光法测量 DNA 的纯度和浓度。评估了碎片化程度和整体质量。

使用用于自动提取系统的改良血液 DNA 方案，而不是市售 FFPE 方案，获得最高的 DNA 数量和质量。通过这种循序渐进的方案，FFPE 样品的 DNA 产量平均高出四倍，并且提取过程中未通过的样本更少，这在处理小血管活检时至关重要。PCR 可检测 200–800 bp 的扩增子大小。这项研究表明，尽管从我们的 FFPE 组织中获得的 DNA 高度片段化，但它仍然可以用于成功扩增和测序较短的产物。总之，在我们手中，自动化技术似乎是 DNA 提取的最佳系统，尤其是对于小 FFPE 组织标本。

引言

福尔马林固定后石蜡包埋 （FFPE） 是在生物样本库中长期保存病理标本的标准程序¹。这些样本为组织学研究和分子分析，尤其是遗传学研究² 提供了有价值的来源。FFPE 组织的其他优点是更好的长期储存、更低的成本和更容易的储存条件。我们的目的是提供一种可靠且易于使用的方案，用于从少量 FFPE 切片中分离可重现的核酸，因为高质量的 DNA 提取是各种分子技术中的第一个关键步骤，而 FFPE 组织是最可用的样品来源。

新的科学方法，如下一代测序 （NGS） 和"组学"研究方法，需要高质量的核酸 ^3,4,5。从 FFPE 组织样本中提取 DNA 仍然是一项具有挑战性的工作。来自 FFPE 样品的 DNA 在质量和数量上可能会有很大差异，具体取决于其年龄和固定条件。福尔马林是最常用的化合物，可导致 DNA-蛋白质交联 ^6,7,8 并导致核苷酸序列出现非特异....

方案

当地医院伦理委员会（2799/10， Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München， Munich， Germany）批准了在我们的生物样本库中收集人颈动脉粥样硬化标本的许可。获得所有患者的书面知情同意书。实验是根据赫尔辛基宣言的原则进行的。

1. 组织制备

1. 使用切片机从 FFPE 样品中制备 5-8 个 10 μm 的组织切片，并将其转移到 1.5 mL 试管中。没有必要减少块中过量的石蜡。
   注:较薄的单个切片而不是一个大切片会加速缓冲液反应。由于 O₂ 暴露，丢弃第一部分。对于较大的样品，也可以使用更少的部分。
2. 将这些试管在台式离心机中离心，在室温下设置为 5,000 x g 1 分钟，以收集试管底部的每个样品。
   注意:离心时间过长会导致样品凝结并使裂解复杂化。

2. 脂质溶解和脱蜡

注:此步骤是脱蜡和脂质消化所必需的。使用的缓冲液比市售脱蜡溶液毒性小。

1. 向每个试管中加入 300 μL 市售孵育缓冲液和 6 μL 1-硫代甘油。
   注:请勿使用超过 30....

结果

为了建立该方案，使用了来自颈动脉动脉粥样硬化患者的 5 个 FFPE 组织块。使用优化的半自动方案（试剂盒 C）以及两种市售的基于色谱柱的手动方案（试剂盒 A 和试剂盒 B，参见 材料表）分离 DNA。根据制造商的方案使用试剂盒 A 和 B 进行 DNA 提取。两种市售试剂盒（试剂盒 A 和试剂盒 B）的方案中所做的唯一更改:由于切片周围有大量石蜡，开始时的脱蜡进行了两次。用二甲苯脱蜡后，DNA 结合到柱膜上并洗涤 3 次。离心干燥膜后，用 60 μL 提供的洗脱缓冲液洗脱 DNA。

为了确定每位患者获得可重现结果所需的最佳样品量，采集了不同量的材料。使用 2 x 10 μm（总共 20 μm）、5 x 10 μm（总共 50 μm）和 8 x 10 μm（总共 80 μm）的连续组织切片（图 1）。使用自动系统和双手动柱式系统分离的总基因组 DNA 的质量和数量，使用光谱法、酶标仪光谱系统和荧光法进行评估。使用自动筛选带技术和聚合酶链反应 （PCR） 进行片段分析。使用市售软件进行统计分.......

讨论

FFPE 组织的 DNA 提取方法在分离 DNA 的质量和数量上各不相同，这不可避免地会影响进一步下游分析的性能。因此，自动化对于改进工作流程和标准化以及质量管理变得势在必行。因此，在本研究中，评估了一种从 FFPE 样品中提取 DNA 的半自动方法，证明其结果优于其他测试的手动柱式方案。

为了优化所描述的半自动方法，我们的目标是为每种组织和体液以及固定标本制定一个通用方案。因此，我们使用了该公司的市售 DNA Blood 试剂盒（材料表）进行优化。首先，我们包括一个用于脱蜡的孵育步骤，使用市售的孵育缓冲液和同一制造商的 1-硫代甘油。在关于石蜡孵育时间和最佳熔解温度的不同测试中，我们选择了 80 °C 的 10 分钟孵育步骤，如其他市售 FFPE 试剂盒中所预期的那样。关于 FFPE 切片的量，大多数公司建议使用 2 μm x 10 μm 切片进行 DNA 提取。众所周知，从含有少量细胞的标本中分离 DNA 是极其困难的。因此，我们尝试了不同数量的固定组织切片，发现总共使用 50.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于样品孵育的 1.5 ml 试管	Eppendorf，德国汉堡	30120086
1-硫代甘油	Promega，德国 Walldorf	A208
安捷伦磁带站软件 3.2	安捷伦，德国
dsDNA HS 试剂盒	ThermoFisher Scientific，德国 Schwerte	Q32851
FFPE DNA 纯化试剂盒（试剂盒 A）	Norgene Biotek，德国海德堡	47400
FFPE 组织样本 n=5	慕尼黑血管生物库，德国
GeneRead DNA FFPE 试剂盒（试剂盒 B）	Qiagen，希尔登，德国	180134
块，设置为 80°;C 和 65°C	VWR，德国达姆施塔特	460-0250
高灵敏度 D5000 试剂	安捷伦，瓦尔德布隆，德国	5067-5593
高灵敏度 D5000 ScreenTape	安捷伦，瓦尔德布隆，德国	5067-5592
孵育缓冲液	Promega，瓦尔多夫，德国	D920
Maxwell 血液试剂盒 RSC，包括：裂解缓冲液、洗脱缓冲液、蛋白酶 K	Promega，瓦尔多夫，德国	AS1400
Maxwell RSC 48 仪器	Promega，瓦尔多夫，德国	AS8500
微量离心机	Eppendorf，德国
NanoDrop 2000c 光谱仪	ThermoFisher Scientific，德国 Schwerte	ND-2000C
光学帽	安捷伦，瓦尔德布隆，德国	401425
光学试管联排	安捷伦，瓦尔德布隆，德国	401428
移液器和移液器吸头	Eppendorf，德国
统计，版本 6.01	GraphPad Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚
Qubit 3.0 荧光计	ThermoFisher Scientific，德国 Schwerte	Q33216
TapeStation 4200	Agilent，Waldbronn，德国
Tecan Infinite M200 Pro	Tecan，Männedorf， 瑞士	IN-MNANO