优化的高质量DNA提取方法用于福尔马林固定石蜡包埋的人类动脉粥样硬化病变组织

摘要

本文介绍一种从人颈动脉福尔马林固定石蜡包埋病变组织中进行半自动化DNA提取的实验方案。组织裂解过程无需使用有毒的二甲苯，随后进行自动化DNA提取流程，包括第二次裂解步骤、DNA与基于纤维素的顺磁性颗粒结合、洗涤步骤以及DNA洗脱。

摘要

福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织是分子分析和临床基因组学研究的重要资源。然而，这些组织常常细胞含量较少或难以处理，因此需要谨慎地分离核酸。近年来，已针对多种疾病（尤其是癌症）的组织样本建立了多种DNA提取方法。遗憾的是，由于核酸链与蛋白质之间发生交联以及序列中出现随机断裂，从FFPE组织中提取的基因组DNA高度降解，导致这些样本的DNA质量显著降低，给后续的分子下游分析带来挑战。其他难以处理的组织问题还包括：钙化的人动脉粥样硬化病变和脂肪组织中细胞稀少、皮肤活检样本过小，因而目标核酸的可获取量很低，老旧或固定处理过的组织也存在类似情况。

在我们的实验室中，我们建立了一种从福尔马林固定的动脉粥样硬化病变组织中提取DNA的方法，该方法采用半自动化的分离系统。我们将此方法与其他 commercially available 提取方案进行了比较，并重点评估了后续的下游分析。通过分光光度法和荧光法测定DNA的纯度和浓度。同时对DNA的片段化程度和整体质量进行了评估。

与商用FFPE方案相比，采用改良的血液DNA方案结合自动化提取系统获得了更高产量和更高质量的DNA。通过该逐步操作方案，FFPE样本的DNA得率平均高出四倍，且提取失败的样本数量更少，这在处理小血管活检样本时尤为关键。PCR可检测到200–800 bp的扩增片段。本研究表明，尽管从FFPE组织中获得的DNA高度片段化，但仍可用于较短片段的成功扩增和测序。综上所述，在我们实验室条件下，自动化技术似乎是DNA提取的最佳系统，尤其适用于小体积FFPE组织样本。

引言

福尔马林固定后石蜡包埋（FFPE）是生物样本库中长期保存病理标本的标准方法¹。这些样本为组织学研究以及分子分析（尤其是遗传学研究）提供了宝贵的资源²。FFPE组织的其他优势还包括更佳的长期保存效果、更低的成本以及更简便的储存条件。本文旨在提供一种可靠且易于操作的实验方案，用于从小量FFPE切片中可重复地提取核酸，因为高质量DNA的提取是多种分子技术中的首要关键步骤，而FFPE组织是目前最易获得的样本来源。

新一代测序（NGS）和“组学”研究等新兴科学方法需要高质量的核酸^3,4,5。从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中提取DNA仍是一项具有挑战性的工作。FFPE样本中的DNA在质量和数量上可能存在很大差异，具体取决于样本的保存时间和固定条件。最常用的固定剂福尔马林会导致DNA-蛋白质交联^6,7,8，并引起核苷酸序列的非特异性随机断裂⁹。这可能对后续的基因组分析....

方案

本生物样本库收集人类颈动脉粥样硬化标本的许可已获得当地医院伦理委员会批准（编号：2799/10，德国慕尼黑工业大学医学院伦理委员会，慕尼黑，德国）。所有患者均签署了书面知情同意书。实验遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行。

1. 组织制备

1. 使用切片机从FFPE样本中制备5–8片10 µm厚的组织切片，并转移至1.5 mL离心管中。无需去除组织块中多余的石蜡。
   注意：与单一大片切片相比，较薄的多片切片可加快缓冲液反应。由于暴露于O₂，应弃去最初的切片。对于较大的样本，也可使用较少的切片。
2. 将这些离心管在台式离心机中以5,000 x g、室温离心1分钟，使每个样本沉降至管底。
   注意：离心时间过长会导致样本结块，增加裂解难度。

2. 脂质溶解与脱蜡

注意：此步骤用于脱蜡和脂质消化。所用缓冲液比商用脱蜡溶液的毒性更低。

1. 向每支试管中加入 300 µL 商业化孵育缓冲液和 6 µL 1-巯基甘油。
   注意：加入体积不得超过 300 µL，因为这是自动化系统卡盒的最大容量。
2. 涡旋振荡 10 秒，然后将样品置于加热块中，在 80 °C、500 rpm 条件下孵育 10 分钟，以溶解石蜡。
   注意....

结果

为建立本实验方案，采用了5例颈动脉粥样硬化患者的FFPE组织块。DNA提取使用了一种优化的半自动化方案（试剂盒C），以及两种 commercially available 手动柱式提取方案（试剂盒A和试剂盒B，参见材料表）。试剂盒A和B的DNA提取操作按照生产商提供的说明书进行。对这两种 commercially available 试剂盒（试剂盒A和试剂盒B）的唯一改动是：由于切片周围含有大量石蜡，在初始脱蜡步骤中进行了两次脱蜡处理。使用二甲苯脱蜡后，DNA被结合至柱膜上，并洗涤三次。经离心干燥膜后，使用60 µL提供的洗脱缓冲液洗脱DNA。

为了确定每位患者获得可重复结果所需的最适样本量，采用了不同量的组织样本。分别使用连续切片的2 × 10 µm（总计20 µm）、5 × 10 µm（总计50 µm）和8 × 10 µm（总计80 µm）组织切片（图1）。通过分光光度法、微孔板读板式分光光度系统以及荧光法，评估了使用自动化系统及两种手动柱式系统提取的总基因组DNA的质量和数量。采用自.......

讨论

不同FFPE组织样本的DNA提取方法在所分离DNA的质量和数量上存在差异，这不可避免地影响后续下游分析的性能。因此，自动化变得至关重要，可改善工作流程、标准化以及质量管理。本研究评估了一种从FFPE样本中提取DNA的半自动化方法，其结果优于其他测试的手动柱式提取方案。

为了优化所描述的半自动化方法，我们的目标是建立一种适用于各种组织、体液以及固定样本的通用方案。因此，我们采用某公司（材料表）提供的市售DNA血液试剂盒进行优化。首先，我们加入了一步用于脱蜡的孵育步骤，使用同一厂商提供的市售孵育缓冲液和1-巯基甘油。在针对不同孵育时间及石蜡最佳熔解温度的多次测试中，我们选择在80 °C下孵育10分钟，该条件与其他市售福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）试剂盒所推荐的条件一致。关于FFPE切片的用量，大多数公司建议使用2 µm厚、共10 µm的切片用于DNA提取。然而众所周知，在此类样本中，若细胞含量较少，则极难提取出DNA。因此，我们尝试了不同量的固定组织切片，发现总共使用50 µm的组织（最佳为5 µm–10 µm的单层切片）时效果最好。这种方法尤其适用.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于样品孵育的 1.5 ml 离心管	Eppendorf, Hamburg, Germany	30120086
1-硫代甘油	Promega, Walldorf, Germany	A208
Agilent TapeStation 软件 3.2	Agilent, Waldbronn, Germany
dsDNA HS 试剂盒	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q32851
FFPE DNA 纯化试剂盒（试剂盒 A）	Norgene Biotek, Heidelberg, Germany	47400
FFPE 组织样本 n=5	Munich Vascular Biobank, 慕尼黑, 德国
GeneRead DNA FFPE 试剂盒（试剂盒 B）	Qiagen, Hilden, Germany	180134
加热金属浴，设定为 80°C 和 65°C	VWR, Darmstadt, Germany	460-0250
高灵敏度 D5000 试剂	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5593
高灵敏度 D5000 ScreenTape	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5592
孵育缓冲液	Promega, Walldorf, Germany	D920
Maxwell 血液试剂盒 RSC，包含：裂解缓冲液、洗脱缓冲液、蛋白酶 K	Promega, Walldorf, Germany	AS1400
Maxwell RSC 48 仪器	Promega, Walldorf, Germany	AS8500
微量离心机	Eppendorf, Hamburg, Germany
NanoDrop 2000c 分光光度计	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	ND-2000C
光学封口帽	Agilent, Waldbronn, Germany	401425
光学管条	Agilent, Waldbronn, Germany	401428
移液器及移液器吸头	Eppendorf, Hamburg, Germany
Prism 6 统计软件，版本 6.01	GraphPad Inc., San Diego, California
Qubit 3.0 荧光计	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q33216
TapeStation 4200	Agilent, Waldbronn, Germany
Tecan Infinite M200 Pro	Tecan, Männedorf, Switzerland	IN-MNANO