优化的高质量DNA提取方法用于福尔马林固定石蜡包埋的人类动脉粥样硬化病变组织

摘要

本文介绍一种从人颈动脉福尔马林固定石蜡包埋病变组织中进行半自动化DNA提取的实验方案。组织裂解过程无需使用有毒的二甲苯，随后进行自动化DNA提取流程，包括第二次裂解步骤、DNA与基于纤维素的顺磁性颗粒结合、洗涤步骤以及DNA洗脱。

摘要

福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织是分子分析和临床基因组学研究的重要资源。然而，这些组织常常细胞含量较少或难以处理，因此需要谨慎地进行核酸提取。近年来，已针对多种疾病（尤其是癌症）的组织样本建立了多种DNA提取方法。遗憾的是，由于核酸链与蛋白质之间发生交联以及序列中出现随机断裂，从FFPE组织中提取的基因组DNA高度降解，导致这些样本的DNA质量显著降低，给后续的分子下游分析带来挑战。其他难以处理的组织问题还包括：钙化的人动脉粥样硬化病变和脂肪组织中细胞稀少、皮肤活检样本过小，因而目标核酸的可获取量很低，老旧或固定处理过的组织也存在类似情况。

在我们的实验室中，我们建立了一种从福尔马林固定的动脉粥样硬化病变组织中提取DNA的方法，该方法采用半自动化的分离系统。我们将此方法与其他 commercially available（商业化）的提取方案进行了比较，并重点评估了后续的下游分析效果。通过分光光度法和荧光法测定DNA的纯度和浓度。同时对DNA的片段化程度及整体质量进行了评估。

与商用FFPE方案相比，采用改良的血液DNA方案结合自动化提取系统获得了更高产量和更高质量的DNA。通过该逐步操作方案，FFPE样本的DNA得率平均提高了四倍，且提取失败的样本数量更少，这在处理小血管活检样本时尤为关键。PCR可检测到200–800 bp的扩增片段。本研究表明，尽管从FFPE组织中提取的DNA高度片段化，但仍可用于较短片段的有效扩增和测序。综上所述，在我们实验室条件下，自动化技术似乎是DNA提取的最佳系统，尤其适用于小体积FFPE组织样本。

引言

福尔马林固定后石蜡包埋（FFPE）是生物样本库中长期保存病理标本的标准方法¹。这些样本为组织学研究以及分子分析（尤其是遗传学研究）提供了宝贵的资源²。FFPE组织的其他优势还包括更佳的长期保存效果、更低的成本以及更简便的储存条件。本文旨在提供一种可靠且易于操作的实验方案，用于从小量FFPE切片中可重复地提取核酸，因为高质量DNA的提取是多种分子技术中的首要关键步骤，而FFPE组织是目前最易获得的样本来源。

新一代测序（NGS）和“组学”研究等新兴科学方法对核酸的质量提出了较高要求^3,4,5。从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中提取DNA仍是一项具有挑战性的工作。FFPE样本中DNA的质量和数量差异较大，其受样本保存时间及固定条件的影响显著。最常用的固定剂福尔马林可导致DNA-蛋白质交联^6,7,8，并引起核苷酸序列的非特异性随机断裂⁹。这些改变可能严重影响后续的基因组分析，因为交联会阻碍聚合酶链式反应（PCR）的扩增效率^6,10。此外，由于固定过程中可能引入污染物，从FFPE样本中提取的DNA纯度通常受限。近年来，已建立多种DNA提取方法，主要应用于肿瘤组织样本^2,11,12,13。

通常，从FFPE组织中提取核酸的方案可分为三大类。第一类也是最常用的方法包括市售的基于二氧化硅柱的系统¹⁴。第二类方法涉及使用苯酚和氯仿的手工有机相提取法，最早由Joseph Sambrook和David W. Russell描述¹⁵。第三类则是近年来建立的自动化系统，例如液体处理系统以及基于顺磁性颗粒的系统¹⁶。上述三种系统各有优缺点，例如可能涉及有害化学试剂（如二甲苯、苯酚、氯仿）、成本较高¹⁷、需要较多人力¹⁸以及耗时较长¹⁹。特别是对于难以处理的组织样本以及高通量分析而言，标准化、可重复性、相对较低的时间消耗、人力需求和成本是选择合适核酸提取方法时最关键的考量因素²⁰。已知自动化提取方法具有更好的可重复性，且对小体积活检样本更敏感。此外，所需组织或血液量更少，且因石蜡含量过高导致系统堵塞的风险也降低。尽管自动化核酸提取仪器及其配套试剂盒的成本高于手工方法，但由于提取过程更简便可靠，仍具有明显优势。文献检索可发现大量研究直接比较了从植物、动物、人类以及培养细胞等不同组织和生物来源中提取DNA和RNA的手工法、柱提法和自动化方法^20,21,22。现有文献也提供了证据表明，从保存达10年的速冻组织中提取的DNA和RNA可用于下游分析，如PCR、定量PCR、NGS、甲基化分析和克隆等^{9,23,24,25,26}。

例如，老化的人类血管组织以及小组织活检样本（尤其是福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本）面临的主要问题是，在高度钙化的动脉粥样硬化病灶中细胞数量极少，从而导致核酸浓度极低¹。尽管目前已建立并广泛应用多种从FFPE组织中提取DNA的方法，但这些手工样本制备方法需要较长的操作时间²⁷，且脱蜡过程需使用二甲苯或苯酚等有毒试剂²。如前所述，脱蜡是一个关键且耗时的步骤（例如约30分钟），显著影响所提取DNA的质量和产量（例如脱蜡溶液的毒性作用可导致DNA断裂和降解，高温也会造成损伤）²⁸。近年来新开发的DNA提取方案聚焦于采用其他无毒脱蜡溶液、修复策略以及自动化磁珠技术。特别是自动化和半自动化方法已被证明在DNA提取中具有高效回收率、无交叉污染以及操作简便等优势²⁹。我们已建立一种克服上述局限性的实验方案。该技术可在保持最高定量与定性标准的同时，显著缩短处理时间和操作时间。

对于基因分型、表观基因组学研究和RNA测序等需要可重复的高通量分析而言，使用基于柱纯化系统的FFPE样本处理通常较为困难且 耗时较长（例如长时间的脱蜡步骤、柱堵塞以及较长的操作时间）。由于石蜡含量较高导致硅胶膜堵塞是主要问题。其他可能影响高质量核酸提取的因素包括组织量较少，如皮肤微小活检样本、小鼠小组织样本，以及富含脂肪或钙化的组织（如斑块、骨化组织）和陈旧样本。尤其在诊断和法医学领域，近年来自动化和半自动化系统（如液体处理系统或基于顺磁性颗粒的提取方法）变得越来越重要^30,31，主要得益于相对较短的操作时间和标准化的可行性。目前已发表的大多数方案对于细胞含量高或中等的均质组织（如肿瘤活检样本或植物组织）效果良好^13,22,32。然而，针对固定单细胞、钙化血管、富含胶原的组织以及细胞数量较少的脂肪组织等较难处理的组织，采用半自动化颗粒法提取DNA的方法在文献中报道甚少³³。

本研究描述了一种针对血管组织石蜡包埋切片DNA提取的优化半自动化方法，并将其与两种手动柱式提取方案进行了比较。通过DNA产量、纯度及片段化程度进行方法验证。本研究以 commercially available blood DNA protocol 作为起点，对半自动化系统的手动步骤进行了优化，使其适用于人和动物的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织以及新鲜冷冻组织样本，整合了FFPE方案与组织方案中的操作步骤。该方案的自动化步骤已预装于仪器中，依赖于所使用的试剂盒（此处为 blood DNA kit）。利用所述半自动化 cartridge-based 系统，可使用相同的方案、仪器、试剂盒和耗材，从血液、新鲜冷冻组织、甲醛固定组织甚至单细胞中提取DNA，而无需如厂商推荐的那样针对不同样本类型使用不同的方案和试剂盒。各方案之间仅存在少量差异，例如一种缓冲液及部分孵育时间因应用而异，这使得该方案在从各类组织中提取DNA时具有很高的通用性。本方案主要针对钙化严重、细胞含量低且富含纤维的人类血管组织进行了优化，但当然也可用于上述各类难处理组织，并可进一步优化。

综上所述，针对从事动脉粥样硬化（如主动脉、颈动脉、冠状动脉）研究的心血管领域研究人员，我们提供了一种简便易用、逐项说明的半自动化从血管FFPE样本中提取DNA的实验方案。

方案

本生物样本库收集人类颈动脉粥样硬化标本的许可已获得当地医院伦理委员会批准（编号：2799/10，德国慕尼黑工业大学医学院伦理委员会，慕尼黑，德国）。所有患者均签署了书面知情同意书。实验严格遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行。

1. 组织制备

1. 使用切片机从FFPE样本中制备5–8片10 µm厚的组织切片，并转移至1.5 mL离心管中。无需去除组织块中多余的石蜡。
   注意：使用较薄的单层切片而非一大片组织可加快缓冲液反应。由于暴露于O₂，应弃去最初的切片。对于较大的样本，也可使用较少数量的切片。
2. 将这些离心管在台式离心机中以5,000 x g离心1分钟，室温下操作，使每个样本沉降至管底。
   警告：离心时间过长会导致样本结块，增加裂解难度。

2. 脂质溶解与脱蜡

注意：此步骤用于脱蜡和脂质消化。所用缓冲液比商用脱蜡溶液的毒性更低。

1. 向每支试管中加入 300 µL 商业化的孵育缓冲液和 6 µL 1-巯基甘油。
   注意：不要加入超过 300 µL，因为这是自动化系统卡盒的最大容量。
2. 涡旋振荡 10 秒，然后将样品在加热块中于 80 °C、500 rpm 条件下孵育 10 分钟，以溶解石蜡。
   注意：组织最终应完全溶解。如有必要，在孵育过程中可多次涡旋振荡。

3. 样品与蛋白质消化

注意：使用蛋白酶K进行原位消化对于获得不含蛋白质的纯净DNA提取物至关重要。该步骤还可减少存在的任何污染蛋白。此外，核酸酶也会被破坏，从而保护DNA不被降解³⁴。此过夜步骤对于样品的完全消化也是必需的。

1. 让样品冷却至 60 °C，然后加入 30 µL 提供的蛋白酶 K 溶液。
2. 再次涡旋混匀，并将混合物置于加热块中，在 65 °C、500 rpm 条件下孵育过夜（4–20 小时）。孵育期间需不时涡旋样品，以确保样品完全消化。
   注意：过夜孵育可获得更佳结果。建议每 30–60 分钟混匀一次。最终，管内不应有可见的组织碎片。

4. 细胞裂解

1. 加入400 µL血液试剂盒中提供的裂解缓冲液，短暂涡旋振荡。
2. 将样品再次于65 °C孵育30分钟，转速为500 rpm。
3. 让样品冷却至室温。石蜡将在上层凝固。
   注意：切勿再次涡旋，以保持石蜡与样品分离。否则石蜡会与组织混合，导致样品破坏。样品将在步骤6.1中收集。

5. 预分装卡盒的制备

1. 打开仪器以及配套的平板电脑。
2. 启动软件应用程序，点击 Door 按钮以打开仪器。
3. 从仪器中取出支架，将预装填的试剂盒插入探针架中。确保试剂盒安装到位时发出两声咔嗒声，然后撕去密封箔。
4. 将推杆插入试剂盒最后一个（第8个）孔中。该推杆在仪器中用作移液吸头。
5. 将试剂盒配套提供的洗脱缓冲液取 65 µL 加入所提供的 0.5 mL 洗脱管中。保持管盖打开，然后将洗脱管插入支架前部试剂盒之后的指定位置。
   注意：洗脱的最小体积为 60 µL。系统会损失所加洗脱液体积的 5–10 µL。

6. 自动化DNA提取

1. 小心刺穿第4.3步中1.5 mL离心管顶部的石蜡层，以接触到管底的纯净样本，避免再次与石蜡混合。
2. 将制备好的样本全部混合液（730 µL）转移至试剂盒的第一个孔中。
3. 将样品架插入自动DNA提取仪中。确保样品架先在仪器后部锁紧，然后在前部锁紧。
4. 在软件中点击左上角橙色的开始按钮以启动运行。此时将弹出一个包含多个预装程序的窗口。在仪器上选择Blood DNA protocol程序。在软件中点击“是”确认已添加活塞、洗脱管和样本。仪器门将自动关闭，运行开始（指示灯变为绿色）。运行时间约为38分钟，无需进一步校准。
   注意：请观察系统是否已为样品架中的所有样本成功吸取活塞。若未成功，系统将自动停止，需重新启动仪器程序。
5. 确保系统在试剂盒的第一个孔中执行自动裂解步骤，随后在第3至第7孔中进行洗涤步骤。无需额外编程，完整程序已由公司预装。
6. 运行完成后，确保系统通过添加的活塞将DNA洗脱至已准备好的洗脱管中。磁性颗粒保留在活塞内，最终活塞返回试剂盒的最后一个孔中。

7. 完成运行

1. 当运行完成后（仪器显示绿色闪烁灯），点击开门按钮（门形标志）打开仪器，从系统中取出样本架。
2. 丢弃 cartridges（反应管）。
3. 将空样本架重新插入仪器中，并通过右上角的门控按钮关闭仪器门。关闭软件程序，关闭仪器及平板电脑。
4. 洗脱液可于 -20 °C 长期保存，或于 4 °C 短期保存，也可直接用于下游分析或浓度测定。

结果

为建立该实验方案，采用了5例颈动脉粥样硬化患者的FFPE组织块。DNA提取使用了一种经过优化的半自动化方案（试剂盒C），以及两种 commercially available 手动柱式提取方案（试剂盒A和试剂盒B，参见材料表）。试剂盒A和B的DNA提取操作按照生产商提供的说明书进行。对这两种 commercially available 试剂盒（试剂盒A和试剂盒B）的唯一改动是：由于切片周围含有大量石蜡，在初始脱蜡步骤中进行了两次脱蜡处理。使用二甲苯脱蜡后，DNA被结合至柱膜上，并洗涤三次。经离心干燥膜后，使用60 µL提供的洗脱缓冲液洗脱DNA。

为了确定每位患者获得可重复结果所需的最适样本量，采集了不同数量的材料。分别使用连续的2 × 10 µm（总计20 µm）、5 × 10 µm（总计50 µm）和8 × 10 µm（总计80 µm）组织切片（图1）。采用分光光度法、微孔板读板式分光光度系统以及荧光法，对全自动系统和两种手动柱式系统提取的总基因组DNA的质量和产量进行评估。使用自动...

讨论

不同FFPE组织样本的DNA提取方法在所分离DNA的质量和数量上存在差异，这不可避免地影响后续下游分析的性能。因此，自动化变得至关重要，可改善工作流程、标准化以及质量管理。本研究评估了一种从FFPE样本中提取DNA的半自动化方法，其结果优于其他测试的手动柱式提取方案。

为了优化所述的半自动化方法，我们的目标是建立一种通用方案，适用于各种类型的组织、体液以及固定样本。因此，我们采用某公司（材料表）提供的市售DNA血液试剂盒进行优化。首先，我们增加了一步用于脱蜡的孵育步骤，使用同一厂商提供的市售孵育缓冲液和1-巯基甘油。在针对孵育时间和石蜡最佳熔解温度的不同测试中，我们选择在80 °C下孵育10分钟，该条件与其他市售福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）试剂盒所推荐的条件一致。关于FFPE切片的用量，大多数公司建议使用2 µm × 10 µm的切片用于DNA提取。然而众所周知，在此类样本中若细胞含量较少，则极难提取出DNA。因此，我们尝试了不同量的固定组织切片，发现总共使用50 µm的组织（最佳为5 µm–10 µm的单层切片）时效果最好。这种方法尤其适用于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于样品孵育的 1.5 ml 离心管	Eppendorf, Hamburg, Germany	30120086
1-硫代甘油	Promega, Walldorf, Germany	A208
Agilent TapeStation 软件 3.2	Agilent, Waldbronn, Germany
dsDNA HS 试剂盒	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q32851
FFPE DNA 纯化试剂盒（试剂盒 A）	Norgene Biotek, Heidelberg, Germany	47400
FFPE 组织样本 n=5	Munich Vascular Biobank, 慕尼黑, 德国
GeneRead DNA FFPE 试剂盒（试剂盒 B）	Qiagen, Hilden, Germany	180134
加热模块，设定为 80°C 和 65°C	VWR, Darmstadt, Germany	460-0250
高灵敏度 D5000 试剂	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5593
高灵敏度 D5000 ScreenTape	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5592
孵育缓冲液	Promega, Walldorf, Germany	D920
Maxwell 血液试剂盒 RSC，包含：裂解缓冲液、洗脱缓冲液、蛋白酶 K	Promega, Walldorf, Germany	AS1400
Maxwell RSC 48 仪器	Promega, Walldorf, Germany	AS8500
微量离心机	Eppendorf, Hamburg, Germany
NanoDrop 2000c 分光光度计	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	ND-2000C
光学封口帽	Agilent, Waldbronn, Germany	401425
光学管条	Agilent, Waldbronn, Germany	401428
移液器及移液器吸头	Eppendorf, Hamburg, Germany
Prism 6 统计软件，版本 6.01	GraphPad Inc., San Diego, California
Qubit 3.0 荧光计	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q33216
TapeStation 4200	Agilent, Waldbronn, Germany
Tecan Infinite M200 Pro	Tecan, Männedorf, Switzerland	IN-MNANO