脊髓损伤后小鼠膀胱分子分析的单细胞解离方法

摘要

本实验方案的目的是将优化的组织解离方法应用于脊髓损伤的小鼠模型，并通过流式细胞术对单细胞分析进行方法学验证。

摘要

我们描述了在小鼠中实施脊髓损伤以诱导逼尿肌-括约肌协同失调的方法，这是一种功能性膀胱出口梗阻，并可导致后续的膀胱壁重塑。为了便于评估未损伤对照小鼠和脊髓损伤小鼠膀胱壁的细胞组成，我们开发了一种优化的组织解离方案，该方案可维持高细胞活性，并支持通过流式细胞术检测出离散的细胞亚群。

通过完全横断胸段脊髓来建立脊髓损伤模型。在组织取材时，动物在深度麻醉下用磷酸盐缓冲液灌流，膀胱组织则采集至Tyrode缓冲液中。根据公共基因表达数据库中对小鼠膀胱胶原含量的分析结果，优化了消化缓冲液的组成，组织在该缓冲液中孵育前先进行机械剪碎。在获得单细胞悬液后，通过流式细胞术分析细胞活力、细胞数量及特定亚群。我们证明该方法获得的细胞群体活力超过90%，且能有效富集来源于间充质和上皮的细胞。该方法将有助于对小鼠膀胱中不同类型细胞进行精确的下游分析，并可能适用于其他器官。

引言

正常的膀胱功能受到干扰可能导致许多个体生活质量下降。为了更好地理解损伤或疾病如何破坏膀胱的正常功能，研究膀胱内细胞的正常生物学状态及其在实验干扰下的变化至关重要。然而迄今为止，定居于泌尿膀胱内的特定细胞群体及其在损伤情况下的变化尚未被充分表征。

单细胞分析方法（如流式细胞术或单细胞RNA测序（scRNA-seq））有望揭示膀胱内特定细胞类型的特征。然而，要使这些方法获得有意义的结果，必须以不影响细胞活性、基因表达以及所获取组织中代表性细胞群体比例的方式来消化组织。采用酶解法进行组织解离的方案可能因蛋白酶的非特异性活性而影响表面标志物的表达¹，从而影响通过流式细胞术进行的细胞鉴定；而解离过程本身也可能诱导即早基因的表达，正如Van den Brink及其同事近期所述²。作者指出，尽管受解离影响的亚群比例较小，但由于即早基因的高表达水平，其可能在整体表达研究中产生强烈的污染信号。此外，解离方案的持续时间会影响那些已被证明为某些亚群特有基因的整体表达水平的检测结果。因此，若在生成单细胞数据集时未考虑解离方案的影响，则所观察到的基因表达变化可能源于解离方法本身，而非真实的生物学差异。这些发现提示，已发表的单细胞转录组学数据应谨慎解读，并且研究结果应通过独立的方法加以验证。

尽管剧烈且耗时较长的解离方法可能会改变细胞中的基因表达²，但有效的细胞分离对于准确表征存在的细胞类型至关重要。由于膀胱是一个包含多种细胞类型的复杂器官，某些细胞群体（如尿路上皮细胞或基质细胞）可能相对丰度较低，而其他细胞类型（如成纤维细胞）则存在于细胞外基质中，难以分离。如果膀胱经历了显著的结构重塑和纤维化（例如在脊髓损伤^3,4或膀胱出口梗阻^5,6中所观察到的情况），解离过程将变得更加困难。

本文介绍了一种优化的组织解离方法，用于脊髓损伤小鼠膀胱组织的下游单细胞分析。我们通过流式细胞术比较了四种酶消化方案在获得单细胞悬液、维持细胞活力以及保持细胞群体正常比例方面的能力。基于该分析，我们得出结论：最大限度减少细胞死亡、细胞聚集体、非细胞来源的核酸以及可能干扰下游分析的抑制物，是获得高质量数据的关键。

方案

所有操作均严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。所有实验均获得波士顿儿童医院动物护理和使用委员会的批准。

注意：小鼠饲养在获得 AAALAC 认证的动物实验设施中，可自由获取食物和饮水。实验使用 8‒12 周龄的雌性小鼠。鉴于损伤的性质，额外为小鼠提供了营养强化，以确保其健康状况。

1. 小鼠胸腰段脊髓横断术

1. 脊髓横断前的准备
   注意：本实验所需的手术器械包括显微解剖弹簧剪、显微解剖镊、显微缝合针持、止血钳以及7-0聚乳酸-羟基乙酸共聚物（polyglactin 910）缝线。其他所需手术用品包括手术巾、无菌手术铺单、纱布块、棉签和带有25 G针头的1 mL注射器。
   1. 在手术前对所有手术器械和用品进行高压灭菌处理。
   2. 使用酒精棉片清洁手术区域和加热垫。一块加热垫用于手术过程中，另一块用于术后即刻阶段，以维持动物体温直至其完全恢复活动能力。
   3. 使用放大头戴镜（2.5倍或更高倍数）进行手术操作。
   4. 开启加热垫、光源和玻璃珠灭菌器，确保其在手术过程中可随时使用。
   5. 打开手术巾和器械包，佩戴无菌手套后铺设手术区域，并将器械放置于无菌手术区域内。
2. 动物准备
   1. 将小鼠带入手术室，并准备一个干净的笼子用于安置脊髓损伤后的小鼠。
   2. 通过将小鼠放入诱导室中进行麻醉，异氟烷气流设定为3.0%，氧气流速为1 L/min，负压吸引为20 mmHg，直至小鼠对足垫夹捏无反应。
   3. 立即称量动物体重，然后将其俯卧位放置于加热垫上。
   4. 将麻醉面罩紧密覆盖在小鼠鼻部，将气体从诱导室切换至鼻罩，并将异氟烷气流调整为2%，氧气流速保持1 L/min。
   5. 确认小鼠已充分麻醉（对足垫夹捏无反应），用胶带将动物四肢固定在加热垫上。在小鼠下胸部下方垫一卷纱布块，以抬高并屈曲打开下胸椎节段。
   6. 在双眼涂抹眼用润滑剂。皮下注射镇痛药（美洛昔康，10 mg/kg）和抗生素（恩诺沙星，5 mg/kg）。
      注意：最终使用者应采用其所在机构动物护理与使用委员会推荐的镇痛药和抗生素。
   7. 触诊胸椎中最突出的棘突，通常对应T13棘突⁷。从小鼠颈部下端至最突出棘突（T13）稍下方，沿中线两侧各1 cm范围，剃除一条纵向矩形区域的毛发。
3. 手术操作
   1. 使用10%聚维酮碘溶液和70%乙醇 交替以环形方式对剃毛区域进行三次消毒，从切口部位开始向外扩展，随后用中心开窗的无菌4×4纱布块覆盖动物，仅暴露手术区域。
   2. 使用精细剪刀在背部正中线做一长度为1.5 cm的切口，末端止于最突出的棘突（T13）。切口应包括皮肤和浅筋膜。用剪刀向两侧分离皮肤和浅筋膜，暴露棘突及周围椎旁肌。
   3. 采用锐性与钝性分离技术，将肌肉从T9、T10和T11椎体的棘突和椎板上分离。
   4. 使用精细剪刀锐性切断T9与T10之间以及T10与T11之间的棘间韧带，随后切除T10棘突，并双侧小心实施T10椎板切除术，以充分暴露脊髓。确保椎板被完全切除。
   5. 使用精细剪刀横断脊髓。由于脊髓血管被切断，此处通常仅有少量出血。使用无菌棉签轻压出血部位以实现止血。确认完全止血后，使用7-0聚乳酸-羟基乙酸共聚物（polyglactin 910）缝线连续缝合皮肤。
   6. 皮下注射1 mL生理盐水，以预防术后脱水。
4. 术后护理
   1. 将动物置于加热垫上直至完全苏醒，随后转移至专用于脊髓损伤小鼠的笼子中。
   2. 术后护理包括每日观察和称重，并在术后7天内监测切口部位是否有感染迹象。连续3天每日皮下注射1 mL生理盐水、镇痛药（美洛昔康10 mg/kg）和抗生素（恩诺沙星5 mg/kg）。
      注意：最终使用者应采用其所在机构动物护理与使用委员会推荐的镇痛药和抗生素。
   3. 每12小时进行一次手动膀胱排空（Credé手法），直至动物能够自主排尿（通常在10至14天内）。一手固定动物，另一手按摩下腹部，然后用食指和拇指感知并轻柔压迫膨胀的膀胱。轻柔的短暂压迫应与放松交替进行。手动排空后，用自来水清洗下腹部，并用纸巾轻轻擦干，避免过度摩擦。
      注意：在开始排空前膀胱体积较小，且下腹部未被尿液浸湿，是动物已恢复自主排尿能力的提示。
   4. 为减少体重下降，可通过在笼底放置营养凝胶及其他高营养零食（如培根软条、水果脆片和蔬菜小块）为小鼠提供营养补充，便于其取食  注意： 本研究中，小鼠在脊髓损伤后8周接受灌注并获取膀胱组织。
5. 术后并发症
   1. 为避免因过度用力手动排空膀胱导致膀胱破裂，不应将膀胱完全排空。
   2. 由于括约肌功能不全导致尿液持续滴漏，可能引起会阴部皮肤糜烂。应通过用自来水清洗会阴区域来预防，并通过涂抹三重抗生素软膏减轻炎症。
      注意：脊髓损伤后，雄性小鼠可能出现短暂性血尿期间因血块导致的尿道阻塞，或因逆行射精导致精液凝块引起的尿道阻塞。雄性小鼠完全性尿道阻塞常导致膀胱破裂和死亡。根据我们的经验，导致死亡的雄性小鼠尿道阻塞发生率为10%。

2. 灌注与组织获取

注意：在收获组织时，通过灌注去除血液有助于后续对某些细胞类型（如外周组织中的免疫细胞）的分析，如下所述。

1. 按照手术步骤（步骤 2.2）给予麻醉，并通过前肢足垫夹捏测试确认动物已充分麻醉（无反应）（动物为截瘫状态，因此后肢感觉减弱，后肢足垫夹捏反应不再适用）。
2. 将动物置于仰卧位，用 70% 乙醇擦拭腹部和胸部，润湿毛发以防止其进入手术区域。
3. 从骨盆至横膈膜行正中腹切口，将横膈膜从肋骨上剪离。
   注意：此步骤后需迅速操作，因为胸腔压力差已不复存在，肺无法膨胀，动物将开始窒息。
4. 沿左右两侧肋骨的骨-软骨交界处，平行于胸骨方向，从横膈膜开始至第一肋骨处切开胸腔。
5. 将完整的前胸壁翻转至动物头部上方，并使用巾钳固定于该位置。切勿切断前胸壁，以免导致两侧胸廓内动脉严重出血。
6. 使用精细剪刀剪除心包膜。
7. 将 23 G 针头连接至灌注装置，然后插入左心室并缓慢进入主动脉，注意避免穿破血管。
   注意：灌注装置由灌注泵、50 mL 注射器和静脉输液管连接组成。
8. 启动灌注，同时用精细剪刀尖端在右心房做一小切口以引流液体。输液过程中注意避免引入气泡。
9. 以磷酸盐缓冲液（PBS）以 15 mL/min 的流速进行灌注。当流出液变清且肝脏颜色变浅时，表明灌注完成（图 1）。
   注意：平均灌注时间为 3.5–4 分钟。灌注不足的表现为组织褪色进展缓慢，通常由针头在左心室位置不当引起。调整针头位置并将灌注时间延长 1 至 2 分钟，可确保组织得到充分灌注。
10. 停止灌注，游离膀胱与血管蒂及尿道，将其放入含有冰冻 Tyrode 液的微量离心管中。

3. 对对照组和脊髓损伤小鼠膀胱的消化处理

注意：为了配制一种针对小鼠膀胱组织的高效消化液，我们尝试调整所用酶的单位数，以降解主要的细胞外基质成分，如胶原蛋白和透明质酸。因此，我们利用小鼠ENCODE项目公开的RNA测序数据（BioProject：PRJNA66167）提取每千碱基每百万映射读段数（RPKM），并结合Tabula Muris⁸数据库评估基因在膀胱组织中的空间表达情况。在42种不同的胶原蛋白中，胶原蛋白1、3和6是表达水平最高的三个基因（图2A）。这些胶原蛋白以及透明质酸合成酶1（Has1）的表达主要出现在膀胱壁的肌细胞和成纤维细胞中（图2B）。

1. 缓冲液和溶液的制备
   1. 按照 表1 在一个洁净的 500 mL 瓶中配制钠型 Tyrode 溶液。加入 300 mL 去离子水（ddH₂O）。配制后溶液呈酸性，使用 NaOH 将 pH 调整至 7.4。用双蒸水（H₂O）定容至 500 mL，分装后于 -20 °C 保存。
      注意：该缓冲液可维持消化缓冲液的 pH 和渗透压平衡，并为细胞提供水分和必需的无机离子。其中含有镁离子以及作为能量来源的葡萄糖。溶液中的钾离子对分离细胞溶液中的电机械活动具有保护作用。粉末状盐类具有吸湿性，应避免接触湿气。混合物应于配制后立即使用。不建议配制浓缩盐溶液，因为可能形成沉淀。若细胞在分析后需进行培养，可通过过滤（0.22 µm 滤膜）进行灭菌。
   2. 在 15 mL 圆锥形离心管中加入各组分的推荐体积和用量（表2），配制酶消化溶液。用钠型 Tyrode 溶液补足至 2.5 mL，充分涡旋以溶解。
      注意：木瓜蛋白酶（Papain）是一种来自番木瓜（Carica papaya）乳胶的巯基蛋白酶，具有广泛的底物特异性，可降解大多数蛋白质底物⁹。在细胞解离方案中，木瓜蛋白酶已被证明比其他蛋白酶损伤更小且效率更高¹⁰。我们在 表2 中提供了四种解离方案的详细信息；观察发现，第3部分的方案在从小鼠膀胱制备的细胞悬液中支持最高的细胞活力（93%）。
2. 解离程序与细胞悬液的制备
   1. 从灌流后的小鼠中取出膀胱组织。
   2. 如有内容物，穿刺膀胱以释放内容物。
   3. 向一个空的 1.5 mL 离心管中加入 100 µL Tyrode 溶液并去皮重，将膀胱放入管中再次称重，以确定准确的膀胱重量。
   4. 将膀胱置于冰上的 10 cm 培养皿中，并加入 100 µL Tyrode 溶液用于剪碎。
   5. 使用手术剪尽可能将组织剪碎，同时将剪碎时间控制在每只膀胱不超过 2–3 分钟。若合并多只动物的膀胱组织，应一次性完成剪碎。
   6. 使用宽口移液枪头将剪碎的膀胱组织转移至每只膀胱 2.5 mL 的消化缓冲液中。若合并多只膀胱，需相应调整体积。将组织在 37 °C 摇床培养箱中孵育 40 分钟。
   7. 孵育结束后，从培养箱中取出消化管。使用 5 mL 移液器上下吹打消化液 1 分钟进行吹打处理（trituration）。
   8. 在 4 °C 下以 350 x g 离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL 细胞解离溶液中，置于 37 °C 摇床培养箱中孵育 10 分钟。
   9. 在 4 °C 下以 350 x g 离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL 红细胞裂解缓冲液（1x）中，孵育 1 分钟。
   10. 加入 9 mL PBS 稀释红细胞裂解液，终止裂解反应。
   11. 使用注射器推杆轻轻刮擦 70 µm 细胞筛，使细胞通过筛网进入 50 mL 圆锥形离心管。确保收集通过筛网但可能滞留在筛网底面的液体。
   12. 在 4 °C 下以 350 x g 离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 200 µL 细胞染色缓冲液（含 2% FBS 的 PBS）中。
   13. 计数细胞。
3. 用于流式细胞术的特异性细胞免疫标记
   注意：为检测膀胱中的不同类型细胞，我们设计了多色流式细胞术检测面板。为进行补偿并制定合适的设门策略，需包括未染色对照和荧光减一（FMO）对照。FMO 对照对于设门阳性细胞群尤为重要，特别是当阳性细胞群荧光信号较弱时。染色步骤如下。
   1. 阻断细胞上的 FcγRII/III 受体
      注意：我们建议通过在细胞染色前与单克隆抗 Fc 受体抗体或重组 Fc 蛋白共孵育，以阻断单克隆抗体的非特异性结合。
      1. 在 4 °C 下以 350 x g 离心 5 分钟洗涤细胞，并加入细胞染色缓冲液。
      2. 弃去上清液，向细胞染色缓冲液中加入 CD16 和 CD32 抗体（稀释比例为 1:100），以阻断细胞上的 FcγRII/III 受体，防止非特异性抗体染色。
      3. 在冰上孵育 10 分钟。
         注意：无需洗涤细胞，此步骤后可直接进行染色。
   2. FMO 染色
      注意：荧光减一（FMO）对照是指实验中使用的所有荧光染料中缺少其中一种的对照管。
      1. 例如，若实验中使用了 4 种不同的荧光染料（A、B、C 和 D）以及 Annexin V 和碘化丙啶（PI），则 FMO 对照管的配制如下：FMO 管 1：偶联 B、C、D 荧光染料的抗体 +（Annexin V 和 PI）；FMO 管 2：偶联 A、C、D 荧光染料的抗体 +（Annexin V 和 PI）；FMO 管 3：偶联 A、B、C 荧光染料的抗体 +（Annexin V 和 PI）；FMO 管 4：偶联 A、B、C、D 荧光染料的抗体 +（Annexin V）；FMO 管 5：偶联 A、B、C、D 荧光染料的抗体 +（PI）。
      2. 需考虑 Annexin V 抗体所偶联荧光染料的性质。
   3. 使用目标抗体对阻断后的细胞进行染色
      1. 将阻断后的细胞与针对目标蛋白的荧光标记抗体主混合液在冰上避光孵育 20 分钟。注意包含 FMO 对照。
      2. 向每管中加入 1 mL 细胞染色缓冲液洗涤细胞，然后在 10 °C 下以 350 x g 再次离心 5 分钟。
      3. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 200 µL 细胞染色缓冲液中，置于冰上直至使用流式细胞仪获取荧光数据。
   4. 应用 Annexin V/PI 染色
      1. 根据凋亡检测试剂盒的说明书，用 1x Annexin 结合缓冲液配制 PI 工作液（100 μg/mL）。
      2. 确定细胞密度，并记录细胞所处的缓冲液及体积。
      3. 在 350 x g 下离心样品 5 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于 1x Annexin 结合缓冲液中，调整细胞密度至约 1 × 10⁶ 个细胞/mL，体积为 100 μL。
      4. 向每个样品（100 μL）中加入 FITC-Annexin V（5 μL）和 PI 工作液（1 μL），按照说明书在室温下孵育 15 分钟。
      5. 向样品中加入 400 μL 1x Annexin 结合缓冲液，轻轻颠倒混匀，置于冰上直至进行流式细胞术检测。
4. FACS 校准
   1. 流式细胞术与纯度控制
      1. 首先检测未染色细胞，以确定细胞形态及各荧光染料的背景信号范围，开始流式细胞术分析。
      2. 通过调节各荧光参数的电压，调整侧向散射光（SSC）和前向散射光（FSC）。在 530 nm（Annexin V）和 >575 nm（PI）处检测荧光发射。
      3. 利用点图上的网格，在第一个数量级内定义阴性细胞群。将每个 FMO 对照放入流式细胞仪中，校正光谱重叠，直至阴性和阳性细胞群的中位值对齐。
      4. 检测 100,000 个事件。检测用特异性标记染色的细胞，并为感兴趣的细胞群创建设门。
5. 数据分析
   1. 从流式细胞仪中获取数据。打开分析软件以查看分析工作区。
   2. 创建工作区
      1. 通过将 FCS 文件拖入工作区来导入文件。文件将在工作区的样本和分组部分中显示。双击样本名称以打开文件。
      2. 将侧向散射面积（SSC-A）设为 y 轴，前向散射面积（FSC-A）设为 x 轴（图3A）。点击多边形设门图标。
      3. 在点图中通过点击创建设门节点，围绕目标细胞群连续点击直至完成设门；双击以闭合设门。
      4. 根据所捕获的细胞群命名设门（例如，“所有细胞”），然后点击 确定。
         注意：双击“所有细胞”设门将在新窗口中打开仅显示“所有细胞”内事件的图形。
      5. 点击黑色箭头并选择更改 y 轴，将新点图的 y 轴调整为 SSC-H（侧向散射高度）。
         注意：此步骤用于设门单细胞（单体），排除双细胞（doublets）或更大的聚集体（图3B）。由于单细胞的宽度和长度成比例，其应在对角线上形成一个细胞群。位于该对角线设门之外的细胞为双细胞或更大的聚集体。
      6. 双击设门以分析坏死细胞（PI 阳性）、早期凋亡细胞（Annexin V 阳性、PI 阴性）和晚期凋亡细胞（Annexin V 阳性、PI 阳性）（图3C）。
      7. 将 x 轴标记为 Annexin V，y 轴标记为 PI。
         注意：在某些情况下，当信号强度较低时，由于背景校正，细胞群可能显示为负荧光值。此时建议进行双指数变换。操作方法为：点击 y 轴旁的 T，选择 自定义坐标轴。在新窗口中将刻度改为双指数（Biex），通过增加宽度基数添加负值，然后点击 应用。这将提高低信号强度事件的分辨率。
      8. 将数据显示为计数图。使用 x 轴下方的 选项 标签，从菜单中选择 计数图。
      9. 在图上绘制 四分位 设门以定义四个独立的目标细胞群。
      10. 点击窗口顶部以打开布局编辑器，点击 布局编辑器，并将各细胞群拖入不同区域。
      11. 通过拖放将图形从工作区移入布局编辑器窗口。
   3. 使用直方图进行可视化
      1. 从 选项 标签中选择直方图。
      2. 应用设门以选择 Annexin V 阳性细胞；或者，可使用 双分器 工具定义阳性和阴性细胞群。此时样本部分应显示已形成的各细胞群及其层级关系。
      3. 为比较样本，将所有直方图叠加在一起；右键点击直方图，从 直方图 菜单中选择 错位偏移。
   4. 添加统计分析
      1. 双击目标细胞群以打开 统计 标签。选择要应用的函数及涉及的参数。
      2. 通过将 Σ 图标拖至其他细胞群名称上，对其他细胞群重复此操作。
      3. 通过选择目标样本的设门策略并将其拖入由目标标记（如 Annexin V）定义的分组中，将分析应用于所有样本。
      4. 在 FMO 对照样本中创建设门并定义阴性和阳性细胞群；该设门策略将应用于整个实验（图3D‒F）。
         注意：需逐一检查每个样本，确保设门正确，并在必要时进行修改。
      5. 若细胞已用标记抗体（如 CD45）染色，则使用相应的 FMO 对照并进行设门。
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结果

手术操作
胸段脊髓横断手术的成功与否需通过多项参数进行评估，其中最明显的是后肢瘫痪。动物仅能使用前肢移动，后肢拖行。除此之外，其活动水平（包括进食、理毛和警觉性）通常保持正常。此外，动物会失去自主膀胱控制能力，因此需要研究人员每12小时手动排空膀胱一次，直至损伤后10至14天反射性排尿功能恢复。在实施安乐死后，评估损伤成功的其他指标主要表现为膀胱与体重比值的增加，提示组织重塑的发生。组织学分析显示尿路上皮和平滑肌组织均出现增生³。

单细胞悬液的制备
利用公开的表达数据，确定了膀胱组织中细胞外基质蛋白的富集情况（图2），并据此指导消化液配方的设计。由于胶原蛋白是膀胱壁的关键组分^11,12，我们首先利用小鼠ENCODE项目生成的小鼠（Mus musculus）RNA表达谱数据集¹³，确定小鼠膀胱中最丰富的胶原蛋白类型。分析结果显示，I型胶原α1链（Collagen 1A1）、III型胶原α1链（collagen 3A1）、I型胶原α2链（collagen 1A2）和VI型胶原α1链（collagen 6A1）是小鼠膀胱中最丰富的胶原蛋白类型（图2A）。我们还利用Tabula Muris数据库（小鼠单细胞转录组图谱合集）⁸分析了I型、III型、VI型胶原蛋白以及透明质酸的mRNA表达水平。该数据集允许对不同组织中共有的细胞类型进行直接且受控的基因表达比较。分析结果表明，这些细胞外基质组分在间充质细胞类型中的表达比尿路上皮更普遍（图2B）。

解离对膀胱来源分离细胞活力的影响
流式细胞术分析表明，使用4种不同方案进行酶消化后，细胞活力分别为83%、86%、93%和90%。因此，第3节所述方案在维持细胞活力方面被认为最具优势。我们还观察到约4%的细胞处于坏死状态（PI⁺/Annexin V^-）（图4A）。这些结果凸显了该消化方案的高效性及其对细胞活力的积极影响。

脊髓损伤对膀胱中不同细胞群体的影响
我们观察到，与对照组相比，脊髓损伤（SCI）小鼠膀胱中的总细胞数量显著增加。来自SCI小鼠膀胱的点图模式也略有不同，符合因脊髓损伤导致的膀胱器官持续重塑现象（图4B：第一列）。与对照组相比，SCI动物的膀胱中CD45阳性细胞显著增多。

图1：灌注完成的代表性结果，肝脏颜色变浅。（A）显示灌注开始时的肝脏颜色。（B）显示灌注结束时肝脏颜色变浅。（A）中的小鼠在灌注前两周接受了脊髓横断术，导致膀胱肥大并突出骨盆，而（B）中的小鼠无脊髓损伤，其膀胱较小且位于骨盆内。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：小鼠膀胱中细胞外基质（ECM）组分的转录组表达。（A）43 种不同胶原蛋白类型的条形图。表达量以每百万映射读段中每千碱基转录本的读段数（RPKM）表示（数据来源于 BioProject：PRJNA66167）¹⁴。（B）通过对雄性和雌性解离尿膀胱样本混合物进行基于微流控液滴的 3’端计数所获得的细胞类型中的基因表达小提琴图（雄性和雌性）。对每个细胞的计数采用每百万计数的自然对数 ln(CPM+1) 进行对数标准化⁸。在取对数前，每个 CPM 值添加了 1 的伪计数。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：设门策略及FMO对照以确定荧光扩散情况。（A）细胞群体的选择。（B）单细胞设门策略。（C）利用PI和Annexin V抗体对坏死细胞、早期及晚期凋亡细胞进行设门。（D–F）多色流式细胞术的示意图（例如，与荧光染料A、B、C、D偶联的抗体 + Annexin V和PI）。该图显示了FMO对照中荧光信号扩散至荧光染料A通道的情况，与未染色对照相比。橙色虚线表示FMO设门边界，红色虚线表示未染色对照的设门边界。请点击此处查看此图的放大版本。

图4：膀胱中不同类型细胞的流式细胞术分析。（A）Annexin V/PI双染流式图。每种方案所使用的不同酶与化学试剂组合显示在相应活力图前方。这些数据表明，采用第3节方案时获得的细胞活力最高。（B）代表性直方图，显示在单通道中检测到的Ly-6A/E（Sca-1）和CD326（Ep-CAM）的荧光强度。（C）脊髓损伤（SCI）对小鼠膀胱细胞群体的影响。上图显示来自未进行手术的对照组小鼠的三个分离膀胱的染色结果，下图显示来自SCI小鼠的三个动物的染色结果。第一列为总细胞群体，第二列为单细胞门控选择，第三列为B细胞、T细胞和NK细胞阴性的活细胞亚群，第四列为CD45阳性活细胞的染色结果。请点击此处查看该图的放大版本。

组分	用量（500 mL）	摩尔浓度
NaCl	4.091 g	140 mM
KCl	0.186 g	5 mM
MgCl2	0.0476 g	1 mM
D-葡萄糖	0.9 g	10 mM
HEPES	1.19 g	10 mM

表1：配制台氏液的组分。 所示组分为配制500 mL台氏液所需。

组分	用量	实验步骤 1	实验步骤 2	实验步骤 3	实验步骤 4
BSA	5 mg	是	是	是	是
CaCl2	0.03 mM	是	是	是	是
胶原酶 I 型	132.5 单位	是	是	是	是
胶原酶 III 型	96.4 单位	是	是	是	是
胶原酶 VI 型	50 单位	否	否	是	否
DNase	10 单位	是	是	是	否
木瓜蛋白酶	115 单位	否	否	是	是
广谱胶原酶	50 单位	否	否	是	是
透明质酸酶	10.5 单位	否	否	是	是
中性蛋白酶 II	1.25 单位	是	是	否	否
细胞解离液	1 mL	是	否	是	否
重组酶	1 mL	否	是	否	是

表2：消化缓冲液的配制组分。 表中所列组分为配制2.5 mL消化混合液所需（1 U指在37 °C下每分钟催化1 µmol底物水解的酶量。各酶活性单位定义请参考相应产品说明书）。

讨论

本文所述的小鼠脊髓损伤模型提供了一种可重复的方法，通过破坏膀胱收缩与尿道外括约肌松弛之间的协调性，从而导致功能性膀胱出口梗阻。这种失协调继而引发膀胱壁的显著重塑，最早在损伤后2周即可观察到，表现为尿路上皮和逼尿肌层的扩张。在啮齿类动物中成功建立脊髓损伤模型的关键步骤包括：（i）在损伤后持续10至14天的脊髓休克期间，严格进行手动排尿；（ii）加强营养支持以减少体重下降；（iii）预防尿液灼伤风险，尤其是在实验周期超过反射性排尿恢复时间的情况下。该模型的局限性包括：小鼠在短暂血尿期间可能因血凝块导致尿道阻塞，此外，雄性小鼠在手术后可能发生逆行射精，继而因精液凝块引起尿道阻塞。

本文所述的组织解离方法强调了在实验损伤后考虑组织结构变化的重要性，例如脊髓损伤（SCI）后发生的显著组织重塑，可能会影响后续分析结果。随着单细胞分析技术的广泛应用，至关重要的是确保观察到的基因表达差异并非由解离过程本身引起的干扰所致，而应真实反映与疾病模型相关的潜在生物学变化。通过利用公开可用的表达数据，我们能够优化消化缓冲液的配方，在有效降解细胞外基质的同时最大程度地维持细胞活性。未来应用中还可考虑进一步改进，例如添加放线菌素D，以抑制对解离方案敏感的即刻早期基因的转录¹⁵。

在解离组织或转移已处于悬浮状态的细胞时，移液技术至关重要。为了减少剪切力对细胞造成的物理损伤，在细胞重悬过程中应轻柔、缓慢地进行移液操作。通常建议使用宽口移液器吸头。若使用标准吸头，则尤其需要注意轻柔地移取细胞悬液，以避免因剪切力而损伤细胞。本实验方案中不可避免地需要使用细胞筛网，但细胞浓度可能因此下降20%或更多，同时伴随100 µL或更多的体积损失。我们建议在过滤后测定细胞浓度，以确保细胞计数的准确性。

在流式细胞术中，FMO对照用于评估因发射峰重叠导致的信号溢出背景。它们并不能反映非特异性抗体结合或当某个通道中加入抗体时可能出现的背景染色。为了校正非特异性抗体结合，必须设置相应的同型对照；而对于背景染色，则需要设置阴性对照。综合使用这些对照，可确保对细胞群体的准确检测。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2.5 倍放大手术放大镜
7-0薇乔缝线，6.5毫米针，3/8圆	ETHICON	J546
70 μm细胞筛	赛默飞世尔科技	22363548
含0.5 mM EDTA的BPBS中的Accutase	Millipore	SCR005
气溶胶过滤宽口移液器吸头（1000 µL	VWR	89049-168
气溶胶过滤宽口移液器吸头（1000 µL	VWR	89049-168
APC 抗小鼠 CD326（Ep-CAM），大鼠单克隆，IgG2a κ，亲和纯化	BioLegend	118213
BB515 大鼠抗小鼠 CD45，大鼠单克隆抗体，IgG2b κ，克隆 30-F11	BD 生物科学	564590
BONN 显微解剖镊，直型，1×2 齿，3.75" 长度，0.3 mm 尖端宽度，0.12 mm 齿部	ROBOZ 外科器械公司	RS-5172	ROBOZ 外科器械公司，美国马里兰州盖瑟斯堡
牛血清白蛋白	Sigma	A9647-100G
CaCl2	Sigma	2115-250ML
CASTROVIEJO 显微缝合针持，直型带锁扣，5.75" 长度	ROBOZ 外科器械公司	RS-6412	ROBOZ外科器械公司，美国马里兰州盖瑟斯堡
细胞计数试剂盒，30个双腔载玻片，可进行60次计数，含台盼蓝	伯乐（Bio-Rad）	1450003
细胞染色缓冲液	BioLegend	420201
产气荚膜梭菌胶原酶	Sigma	C0130-1G
I型胶原酶	Worthington Biochemical Corporation	LS004196
III型胶原酶	沃辛顿生化公司	LS004182
胶原酶，6型	沃辛顿生化公司	LS005319
Annexin V Alexa Fluor 488 凋亡与死细胞检测试剂盒 &碘化丙啶（PI）	赛默飞世尔科技	V13241
Dispase II	Sigma	D4693-1G
DNase	Sigma	DN25-1G
恩诺沙星（Baytril）	拜耳医药保健有限责任公司	NADA # 140-913 获美国食品药品监督管理局（FDA）批准。批号：AH01CGP	2.27%注射液
Falcon 15 ml 圆锥形离心管	Fisher Scientific	352096
Falcon 50 ml 圆锥形离心管	Fisher Scientific	352070
FITC 标记的抗小鼠 Ly-6A/E（Sca-1）抗体，大鼠单克隆，IgG2a κ，亲和纯化	BioLegend	122505
来自绵羊睾丸的透明质酸酶，II型	Sigma	H2126
MACS SmartStrainer（100 µm)	Miltenyi Biotec, Inc.	130-110-917
麦克弗森-范恩斯微型解剖弹簧剪，直头，4号" 长度，0.15 mm 尖端宽度	ROBOZ 外科器械公司	RS-5630	ROBOZ外科器械公司，美国马里兰州盖瑟斯堡
美洛昔康	Patterson Veterinary	07-891-7959
木瓜蛋白酶	Worthington Biochemical Corporation	LS003119
PE/Cy5 抗小鼠 CD19 抗体，大鼠单克隆，IgG2a κ，亲和纯化	BioLegend	115509	废液通道
PE/Cy5 抗小鼠 CD3ε 抗体， Armenian hamster 单克隆，IgG，亲和纯化	BioLegend	100309	废液通道
PE/Cy5 抗小鼠 CD4 抗体，大鼠单克隆，IgG2b κ，亲和纯化	BioLegend	100409	废液通道
PE/Cy5 抗小鼠 CD8a 抗体，大鼠单克隆，IgG2a κ，亲和纯化	BioLegend	100709	倾倒通道
PE/Cy5 抗小鼠 NK-1.1 抗体，小鼠单克隆，IgG2a κ，亲和纯化	BioLegend	108715	废液通道
PE/Cy5 抗小鼠 TER-119/红系细胞抗体，IgG2b κ，亲和纯化	BioLegend	116209	倾倒通道
纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭抗体），大鼠单克隆抗体，IgG2b κ，克隆 2.4G2	BD 生物科学	553141
RBC裂解缓冲液（10X）	BioLegend	420301
红细胞裂解缓冲液 1x	Biolegend	420201
螺口微量离心管，1.5 ml	VWR	89004-290
TC20 自动细胞计数仪	伯乐（Biorad）	1450102
三种抗生素软膏（新霉素/多粘菌素B/杆菌肽）	Patterson Veterinary	07-893-7216	皮肤保护剂
TrypLE Select 酶（10 倍浓度），无酚红	赛默飞世尔科技	A1217701
维他霉素眼膏	德克拉动物保健产品	NADA # 065-016，已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准。	麻醉期间保护眼睛