需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

评估SHP2（PTPN11）磷酸酶抑制剂的细胞靶点结合能力

5.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61457

⸱

2020年7月17日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Metabolism & Signaling Networks Program, NCI-Designated Cancer Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

本文内容

摘要

在完整细胞中评估候选抑制剂对靶点的结合能力对于药物发现至关重要。本方案描述了一种384孔板格式的细胞热迁移实验，可可靠地检测靶向野生型SHP2或其致癌突变体的抑制剂在细胞内的靶点结合情况。

摘要

含Src同源2（SH2）结构域的磷酸酶2（SHP2），由 PTPN11 原癌基因是受体酪氨酸激酶（RTK）驱动的细胞信号传导中的关键中介分子，可促进细胞存活与增殖。此外，SHP2 可被免疫检查点受体招募，以抑制 B 细胞和 T 细胞的活化。SHP2 功能异常已被证实参与多种癌症的发生、发展及转移过程。事实上，针对 Ras/Raf/ERK 信号通路激活的实体瘤（包括携带某些致癌性 Ras 突变的肿瘤），小分子 SHP2 抑制剂已进入临床试验阶段。然而，目前这类 SHP2 抑制剂对在白血病中频繁出现的 SHP2 致癌突变体无效，因此研发靶向致癌性 SHP2 的特异性小分子化合物正成为当前研究的重点。大多数针对 SHP2 等胞质蛋白的药物发现项目普遍面临的一个问题是 主要推动化合物发现的初筛实验通常是体外实验，无法反映候选化合物在细胞内的靶点结合情况。为了建立一种检测细胞内靶点结合的平台，我们开发了野生型和突变型SHP2的细胞热位移实验。这些实验能够可靠地检测SHP2抑制剂在细胞中的靶点结合。本文提供了该实验的完整操作流程，为SHP2抑制剂的评估与表征提供了有力工具。

引言

酪氨酸磷酸化在细胞信号转导中发挥重要作用1,2。这种翻译后修饰由蛋白酪氨酸激酶（PTKs）催化，并由蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）逆转。因此，PTK或PTP功能异常会导致多种遗传性或获得性人类疾病3,4,5,6。含Src同源2（SH2）结构域的磷酸酶2（SHP2）是一种广泛表达的非受体型PTP，由原癌基因PTPN11编码7，是多种生理过程的关键调控因子，这些过程涉及通过激活Ras/Raf/ERK、PI3K/Akt或JAK/STAT信号通路进行信号转导8。正常情况下，SHP2的活性受到严格调控，以防止异常信号传导。在基础状态下，SHP2通过其N端SH2结构域实现自抑制，该结构域阻断了催化磷酸酶结构域内活性位点的可及性（图1A）9,10。当细胞被激活时，酪氨酸磷酸化的结合蛋白招募SHP2，使其转变为活性构象，此时其活性位点可被底物接触。在多种癌症中，SHP2的活性升高。PTPN11的体细胞功能获得性（GOF）突变主要见于白血病，这类突变阻止N-SH2结构域与磷酸酶结构域结合，导致SHP2持续处于激活状态（图1B）11。PTPN11的生殖系GOF突变导致约50%的 Noonan 综合征病例，这是一种伴有恶性肿瘤风险增加的发育障碍性疾病12。在PTPN11突变罕见的实体瘤中，更高水平的磷酸化结合蛋白导致SHP2活性增强（图1C）。SHP2在免疫检查点信号传导中也具有重要作用，因为BTLA或PD-1等检查点受体会招募SHP2去磷酸化关键信号分子，从而抑制免疫细胞的活化13,14,15。

使用小分子靶向蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）一直面临挑战，因为PTPs的活性位点高度保守且带有强电荷；靶向活性位点的抑制剂通常具有较强活性，但往往选择性差且口服生物利用度低16,17,18,19,20,21,22。事实上，许多已报道的SHP2抑制剂存在选择性差以及在细胞中缺乏疗效的问题23。最近，已有报道针对SHP2的变构抑制剂，具有良好的效力和优异的选择性（例如SHP09924和RMC-455025），重新激发了人们对SHP2抑制剂的兴趣。基于SHP099和RMC-4550的化合物目前正处于I期临床试验阶段，用于治疗具有受体酪氨酸激酶（RTK）通路激活的实体瘤26,27。尽管这些化合物具有突破性意义，但它们对许多驱动大量血液肿瘤患者白血病发生的SHP2致癌突变体无效28,29,30。SHP099类化合物对SHP2致癌变异体缺乏活性的原因在于其独特的变构机制：这类化合物通过结合并稳定SHP2的非活性闭合构象来抑制其活性，而该构象在SHP2突变体中已被破坏。此外，根据最近一项报道31，接受SHP099类抑制剂治疗的患者体内出现适应性耐药机制是完全可能的。因此，开发靶向SHP2活性开放构象的下一代抑制剂已成为当前研究的热点。

在细胞中对新型SHP2抑制剂进行表征是先导化合物优化过程中的关键环节。尤为重要的是，在生理条件下验证抑制剂与靶点的结合能力，可进一步确保药物化学资源被高效地用于具有潜在细胞活性的化合物。过去已开发出多种评估小分子抑制剂与其靶蛋白结合的方法，主要针对蛋白激酶32。为了建立SHP2的细胞靶点结合检测方法，我们采用了细胞热迁移实验（cellular thermal shift assay）33。该方法类似于体外蛋白热迁移（PTS）实验34，通过监测靶蛋白的热稳定性变化来反映小分子结合情况，因为小分子的结合通常会改变靶蛋白的热稳定性。原始方法是一种低通量检测，依赖抗体来定量靶蛋白水平。相比之下，我们选择了一种近期报道的热迁移实验变体，该方法基于β-半乳糖苷酶酶片段互补（EFC）检测系统（图2）35。在这些实验中，目标蛋白在细胞内以N端或C端融合蛋白的形式表达，融合部分为增强型ProLabel标签（ePL，即β-半乳糖苷酶的42个氨基酸片段）。随后将细胞转移至适用于PCR的384孔板中，并与待测化合物共同孵育。使用PCR仪对细胞施加温度梯度，细胞内的蛋白质会随着温度升高而根据其热稳定性发生变性并聚集。若候选化合物能够结合并稳定目标蛋白，则该蛋白的热稳定性将提高。因此，在细胞裂解后，经候选化合物稳定的融合标签蛋白将在较高温度下仍保留在溶液中，而对照组（仅加入溶剂）细胞中的标签蛋白则更易沉淀。报告酶受体（EA）可与溶液中保持可溶状态的ePL标记蛋白发生互补，从而通过化学发光底物检测到β-半乳糖苷酶活性。

我们近期开发了一种针对野生型SHP2（SHP2-WT）及一种常见致癌突变体SHP2（SHP2-E76K）的稳健细胞热迁移实验方法，该方法采用微型化的384孔板格式36。本文报道了该实验的详细操作流程，该方法可在细胞内可靠地检测SHP2抑制剂的靶点结合情况，并显示出抑制剂效力与细胞热迁移数据之间具有高度相关性。整体实验流程如图3所示。本平台使用N端标记的全长ePL-SHP2融合蛋白。有关相应的pICP-ePL-N-SHP2-WT和pICP-ePL-N-SHP2-E76K表达质粒的构建，请参见我们近期发表的文章36。该实验可通过温度梯度来建立SHP2的热稳定性谱型，并测定在有或无抑制剂存在条件下SHP2的熔解温度。在确定热稳定性谱型后，也可在等温条件下进行实验，从而实现对抑制剂剂量-反应关系的评估。以下将分别描述这两类实验的操作方法。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 细胞培养与试剂的准备

  1. 配制500 mL培养基，含10%胎牛血清、1×抗生素/抗真菌剂、20 mM HEPES和1 mM丙酮酸钠，4 °C保存。
  2. 从冷冻的原始储备瓶中解冻细胞热转移试剂（EA试剂、裂解缓冲液和底物）。
  3. 将试剂和缓冲液分装为每份2 mL，-20 °C保存。
    注意：为保证实验可重复性，避免反复冻融，仅使用检测步骤所需的试剂体积。

2. HEK293T 细胞的培养与维持

  1. 从冻存中获取低代次贴壁生长的 HEK293T 细胞。
  2. 将 HEK293T 细胞在 37 °C、5% CO2 条件下，用生长培养基进行培养。
  3. 每 4 天以 1:14 的比例传代细胞。
    注意：为保证最佳性能，HEK293T 细胞传代次数不应超过 25 次。

3. 瞬时转染用 HEK293T 细胞的制备

  1. 使用 3 mL 细胞解离试剂从 16 mL 培养板中解离 HEK293T 细胞。
  2. 加入 12 mL 培养基稀释，于 1,400 x g 离心 4 分钟收集细胞。
  3. 将细胞沉淀重悬于 10 mL 培养基中，使用台盼蓝染色和细胞计数仪测定细胞浓度和活力。
  4. 在转染前约 24 小时，将 7.0 × 105 个处于指数生长期的 HEK293T 细胞接种至 6 孔细胞培养板的每孔中。
    注意：为每种待转染质粒预留一个孔。
  5. 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时。

4. 转染 HEK293T 细胞

  1. 从纯化的质粒储备液 pICP-ePL-N-SHP2-WT 或 pICP-ePL-N-SHP2-E76K（约 200 ng/µL）中，取 2 µg 质粒 DNA 溶于 200 µL 转染缓冲液中。
  2. 涡旋振荡 10 秒，然后在 1,400 x g 离心 4 分钟。
  3. 向稀释后的 DNA 中加入 4 µL 转染试剂。涡旋振荡 10 秒，然后在 1,400 x g 离心 4 分钟。
  4. 在 23 °C 下孵育 10 分钟。
  5. 从培养箱中取出含有生长中 HEK293T 细胞的 6 孔板。将转染混合物加入 6 孔板中的贴壁细胞中。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时。

5. 检测板的制备

  1. 用DMSO配制待测化合物的10 mM储备溶液。
  2. 使用液体处理装置将抑制剂溶液加入384孔低死体积的源板中，立即使用。
  3. 通过液体处理装置将所需体积的抑制剂或溶剂（DMSO）点样至384孔实时PCR板中，目标终浓度DMSO体积分数低于0.5%（v/v）。使用带惰性气体吹扫的板封膜密封板孔。
    注意：进行抑制剂剂量-反应实验时，需相应补充DMSO，确保每个抑制剂浓度所用DMSO量相等。为获得最佳结果，建议将板在23 °C保存，并在24小时内使用。

6. 转染细胞的脱离与制备

  1. 将培养基和细胞解离试剂在37 °C水浴中预温。从培养箱中取出转染后的细胞。轻柔地吸除孔板中各孔的培养基。
    注意：每个含有不同转染质粒的孔应使用新的吸头。
  2. 向每个孔中加入0.3 mL细胞解离试剂。轻轻前后摇动孔板，使试剂充分覆盖孔底表面。在23 °C下孵育2分钟。
  3. 向每个孔中加入1 mL培养基。轻柔地吹打孔中的培养基和细胞，并转移至15 mL Falcon离心管中。在1,400 x g条件下离心4分钟，收集细胞。
  4. 轻柔而彻底地吸除上清液。
    注意：细胞解离试剂中残留的酚红可能干扰后续检测。
  5. 用2 mL培养基小心且充分地重悬细胞沉淀。使用台盼蓝染色和细胞计数仪测定细胞浓度和活力。
    注意：为获得最佳结果，细胞活力应> 90%。
  6. 将细胞稀释至125个细胞/µL的浓度。例如，对于5 µL的检测体系，相当于约625个细胞/µL。为保持最佳活力，细胞悬液在室温下保存时间不应超过2小时。

7. 使用 SHP2 抑制剂孵育细胞

  1. 将细胞分装至无菌的单通道溶液槽中。
  2. 对已预先在孔中沉积SHP2抑制剂的384孔实时PCR板，在23 °C条件下以2,500 x g离心5分钟。
  3. 移除化合物板的密封膜。使用125 µL多通道移液器，向目标孔中加入5 µL稀释后的细胞悬液。
  4. 将板在无盖条件下以42 x g离心30秒。离心后立即为板加盖密封膜，并将检测板置于37 °C、5% CO2环境中孵育1小时。

8. 化学发光试剂主混合液的制备

  1. 接种细胞后，从 -20 °C 取出所需量的检测试剂（EA 试剂、裂解缓冲液和底物），在 23 °C 下解冻。
    注意：为便于转移，建议配制的总体积为已加入培养板中细胞总体积的 1.5 倍。试剂使用后不得重复使用。
  2. 使用条件 EA-10 配制试剂主混合液，其组分及体积分数如下：EA 试剂（0.17）、裂解缓冲液（0.17）、底物（0.67）。
    注意：试剂配比基于供应商说明书所述优化实验结果确定。

9. 等温或温度梯度热脉冲

  1. 为具备梯度功能的PCR仪编程，以提供热脉冲。
    1. 对于热梯度实验，预先为PCR仪编程以下示例参数：
    2. 热脉冲：3分钟，目标熔解温度（垂直或水平梯度±15 °C；例如，在24个孔中温度范围为38–68 °C，温度梯度增量为1.25 °C）。
  2. 平衡恢复步骤：20 °C维持3分钟，升降温速率为1 °C/s
    1. 对于等温实验，设置如下程序：
    2. 热脉冲：55 °C维持3分钟。平衡恢复步骤：20 °C维持3分钟，升降温速率为1 °C/s
      注意：为提高可重复性，由于在PCR仪达到目标温度时精确放置样品板可能存在困难，建议设置程序在开始3分钟热脉冲前先倒计时15秒。本实验所用PCR仪的具体信息请参见材料表，在热脉冲过程中保持热盖开启。

10. 裂解检测与测量

  1. 使用多通道移液器向每个待分析的孔中加入等体积（5 µL）的裂解检测预混液，补充检测板。
  2. 将板在42 × g 条件下离心30秒。避光保存于23 °C，孵育30–60分钟。
  3. 使用能够检测384孔板发光信号的酶标仪测量化学发光。根据板型优化发光检测参数（积分时间1000毫秒，稳定时间0秒），以每秒计数（counts/s）为单位读取数值，并输出用于后续分析。

11. 数据分析

  1. 使用科学二维绘图和统计分析软件分析发光数据。
  2. 通过非线性回归和Boltzmann S型模型分析归一化发光数据（相对于溶剂对照组归一化），生成热变性曲线。
    注意：在热变性曲线实验中，计算得到的V50（即曲线底部与顶部中间点对应的温度）定义为SHP2的熔解温度。在等温实验中，EC50定义为产生半最大反应的抑制剂浓度。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

SHP2-WT的热梯度实验呈现出典型的折叠蛋白特征，表现为S型细胞热变性曲线，并具有较窄的熔解转变峰（图4A）。SHP2由三个独立的结构域组成：两个SH2结构域和一个催化结构域（图1）。在自抑制的闭合构象中，这些结构域发生自身相互作用；热变性曲线实验中观察到的熔解转变峰可能反映了该蛋白在细胞内的这种状态。在10 µM浓度下，变构抑制剂SHP099与SHP2-WT共孵育显著且可测量地稳定了SHP2-WT的热变性曲线（图4A）。这一现象反映了SHP099类抑制剂已知的结合模式，即在调节性结合SH2结构域与催化亚基之间充当“分子胶”37。重要的是，我们的细胞热位移实验确认SHP099能够穿透细胞膜并与标记的SHP2-WT结合。SHP2的稳定性变化也与SHP099类变构化合物的活性强弱一致。在10 µM浓度下，活性更强的RMC-4550（报道IC50 = 0.6 nM）对SHP2-WT的稳定作用强于...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

我们介绍了一种靶点结合检测方法，可用于确认小分子在细胞内与SHP2磷酸酶的直接结合。该检测方法能够区分低亲和力与高亲和力抑制剂，并且重要的是，能够证实变构抑制剂（如SHP099型）对获得功能型致癌突变SHP2-E76K缺乏抑制活性。该微型化检测方法的一个优势在于可整合到SHP2抑制剂筛选项目中。该方法能够确认未知化合物在细胞内与SHP2的结合能力，这一特性对于确保高效利用筛选资源至关重要。总体而言，该微型化实验方案具有良好的稳健性和可靠性。

实验的关键在于时间控制；转染HEK293T细胞后24小时可获得最佳结果。SHP2-WT和SHP2-E76K蛋白似乎无细胞毒性；然而，长期高表达可能降低实验的敏感性，需重新优化条件。在细胞处理过程中，需谨慎操作以充分解离并制备用于检测的细胞悬液，这也是一个关键因素。不过，常规的细胞培养方法已足以获得高质量的数据。由于本实验使用的体积较小，我们在操作流程中加入了多个离心步骤，目的是确保反应体系的定量混匀，因此建议严格遵循规定的离心加速度和时间。值得注意的是，实验试剂若操作不当可能受到影响。因此，我们建议将试剂分装后冷冻保存，直至使用。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明，他们对本文内容不存在利益冲突。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院资助项目1R21CA195422（授予L. T.）、Epstein家族基金会奖（授予N. D. P. C.）以及美国国家癌症研究所癌症中心支持资助项目P30CA030199的支持。此外，本项目全部或部分由美国国家癌症研究所、美国国立卫生研究院的联邦资金资助，合同编号为化学生物学联盟HHSN261200800001E。本出版物的内容不一定反映美国卫生与公共服务部的观点或政策，提及的商标名称、商业产品或组织也不意味着美国政府的认可。本内容完全由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
384孔梯度热循环仪Eppendorf AGX50h
384孔低残留体积Echo认证微孔板Beckman Coulter, Inc.LP-0200
6孔细胞培养板Greiner Bio-One657 160带盖无菌
抗生素-抗真菌素（Anti Anti）100 XThermo Fisher Scientific15240-062
细胞计数仪Thermo Fisher ScientificCountess II FL
杜尔贝科改良伊格尔培养基 1X + GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566-016500 mL
Echo声波液体处理系统Beckman Coulter, Inc.Echo 550
电子多通道移液器Thermo Fisher ScientificE1 ClipTip
胎牛血清Thermo Fisher Scientific26140-079500 mL
HEPES缓冲液Thermo Fisher Scientific15630-680100 mL
InCell Pulse启动试剂盒Eurofins DiscoverX Corp.94-4007组分包括EA缓冲液、裂解缓冲液和底物
微孔板读板仪Tecan Trading AGSpark
单通道溶液槽Thermo Fisher ScientificS253012005
丙酮酸钠Thermo Fisher Scientific11360-010100 mM
微孔板热封仪Agilent Technologies, Inc.PlateLoc
转染试剂Polyplus TransfectionjetPRIME
台盼蓝Thermo Fisher ScientificT10282
TrypLE Express消化试剂Thermo Fisher Scientific12605-010
Twin.tec 384实时PCR板Eppendorf AG30132734

参考文献

  1. Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
  2. Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
  3. Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309(2002).
  4. Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
  5. Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
  6. Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
  7. Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
  8. Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
  9. Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
  10. Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
  11. Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, Academic Press. Amsterdam. 771-809 (2010).
  12. Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
  13. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
  14. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
  15. Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
  16. Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
  17. Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
  18. Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. Targeting the PTPome in human disease. Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).
  19. Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
  20. Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
  21. Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
  22. He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
  23. Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
  24. Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
  25. Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
  26. Clinical Trial NCT03114319. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019).
  27. Clinical Trial NCT03634982. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019).
  28. Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
  29. LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508(2018).
  30. Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507(2018).
  31. Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
  32. Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
  33. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  34. Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  35. McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
  36. Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
  37. Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

SHP2 HEK293 T SHP099 SHP2
评估SHP2（PTPN11）磷酸酶抑制剂的细胞靶点结合能力
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。