MCF7细胞单层中细胞基质粘附面积和细胞形状分布的定量

Summary

本文描述了1）焦点粘附的大小和数量，2）细胞形状指数及其分布从MCF7细胞的汇合单层共聚焦图像。

Abstract

此处介绍的方法从多个适当染色的共聚焦图像中量化了汇合粘附细胞单层之间的一些参数:粘附到基底，作为焦粘附数和大小的函数，以及以细胞形状索引和其他形状描述符为特征的细胞形状。焦粘附物通过paxillin染色和细胞边界以结球蛋白和行动素为标志。细胞培养和染色的方法是标准的;图像代表单个焦点平面;使用公开提供的图像处理软件进行图像分析。提出的协议用于量化焦点粘附的数量和大小以及单层中细胞形状分布的差异，但它们可以重新用于量化任何其他可染色的不同细胞结构（例如线粒体或核）的大小和形状。评估这些参数对于粘附细胞层中动态力的表征非常重要，包括影响细胞形状的细胞粘附和运动素收缩性。

Introduction

上皮细胞单层作为一个整体，其中细胞和细胞基板粘附以及收缩力和张力代表重要的参数^,，其适当的平衡有助于^{单元1，2，3,2的整体完整性}。因此，评估这些参数是建立细胞层的当前状态的一种方式。

此处描述的两种方法表示对粘附的上皮细胞（本例中为 MCF7 乳腺癌细胞系）的汇合单层进行二维分析。使用 Z 轴上不同区域的共和图像（单个 Z 切片）执行分析;基座附近的基底区域，用于焦粘附 （FA） 测量，用于细胞形状测量的平面区域。提出的方法相对简单，需要标准的实验室技术和开源软件。共体显微镜足以满足此协议，因此无需采用更专业的 TIRF（总内部反射荧光）显微镜即可执行。因此，该议定书可以在相对标准的实验室环境中实施。虽然方法的准确性有限，但它们可以区分焦粘附和细胞形状的基本差异。

此处描述的两种方法都包括使用 ImageJ 执行的标准实验程序，如细胞培养、免疫污染、共体成像和图像分析。但是，可以使用任何具有适当功能的图像处理软件。提出的方法可以跟踪和比较药理治疗或最小的基因改造带来的变化。由于这些方法的精度有限，不建议获取确定值。包括两个自动宏，以方便测量许多图像。

Protocol

1. 准备步骤

1. 细胞播种，以获得汇合单层
   1. 播种前，用胶原蛋白 I（或选择的其他 ECM 组件）涂覆 4 孔室滑轨的孔。对于胶原蛋白 I 涂层，请遵循https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html:浓度为 8 μg/cm²。
   2. 种子400，000细胞到一个井的4井室幻灯片。
   3. 染色前培养细胞24小时（或更长，取决于实验终点），在37°C的培养箱中，5%CO_2。此步骤允许细胞接触的成熟和单层的形成。
   4. 使用光学倒置显微镜验证汇合（约 90% 需要）和单层一般条件。如果单元格是浮动的或看起来有压力，请勿继续。
2. 免疫荧光染色
   注:细胞可以染色与选择的协议。在这里，免疫荧光执行如前所述^4。
   1. 对于焦粘附分析，用选择的焦点粘附蛋白（在此协议中）染色细胞。用于细胞形状分析染色与细胞结蛋白的选择（在此协议中脱烟蛋白蛋白蛋白）。
   2. 对于该过程，除非另有说明，否则请使用 0.5 mL 的指定解决方案。
   3. 在PBS中修复4%甲醛中的细胞，在冰上30分钟。
   4. 用0.1 M 氯化铵（PBS）孵育10分钟，以淬火自动荧光。
   5. 添加 0.5% Triton X-100 （PBS） 30 分钟（渗透）。
   6. 在 TBS-T 中用 5% 牛奶（或 1% BSA）进行块块 1 小时。
   7. 在4°C过夜用原抗体孵育（抗青霉素:兔，1:250，抗蛋白:兔，1:400）
   8. 用二次抗体孵育30分钟（亚历克萨氟尔594山羊抗兔，1:500，1:500）
   9. 带 300 nM DAPI 的污渍 1-5 分钟，不受光线污染。
      注:可选地，可与荧光粉绿素结合剂（conc.1:400）进行其他行为素染色;与二级抗体在同一步骤添加 phaloidin。
3. 共体成像
   1. 使用共和显微镜拍摄单个 Z 切片的图像（例如，蔡司 LSM800）。
      注:可选的法素染色可能有助于评估适当的焦平面。皮质作用素染色存在于平底区域，而作用应应纤维存在于基底区域，靠近基材，如图1所示。
   2. 聚焦粘附成像
      1. 选择 Z 切片，从基底附近基底区域进行焦粘附分析。
      2. 使用具有最高数值孔径的目标的 1.4。最好使用 63 倍 N.A.: 1.4。
         注:FA的形状非常具体，易于识别。因此，建议从细胞下方的焦点平面开始扫描，然后缓慢地朝它们扫描，直到 FAs 清晰可见。图像分析将更准确，从较小的视野领域，这往往更均匀，但这意味着在单个视野中计算的单元格更少。
   3. 细胞触点成像
      1. 使用 40 倍或 63 倍目标。
      2. 选择核染色和首选结蛋白染色的通道。
      3. 从单层的单面区域选择 Z 切片进行单元格形状分析。
      4. 为至少 3 个不同的视觉领域（200-400 个细胞）拍照。

2. 图像分析

注:如果宏在 ImageJ 版本 1.50f 或更高版本上以最佳方式工作。仅用于对具有高信噪比且无不足或过饱和像素的图像进行量化。所述方法包括需要手动参数调整的步骤。因此，建议进行盲分析/盲实验设置。对于加密图像文件名，可以使用 ImageJ 插件，如"盲分析工具"（https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools提供）。

1. 聚焦粘附分析
   注:以下方法的建议输入文件是:以 .tiff 格式保存的 8 位灰度表示的 FA 图像。
   1. 使用 ImageJ 打开图像。
   2. 将图像比例设置为像素（分析 |设置比例;删除"缩放"并选中"全局"选项）。
   3. 在测量选项中包括文件名和 ROI 区域（分析 |设置测量...）;选中"区域"和"显示"标签选项。
   4. 减去背景（过程 |减去背景;将滚球半径参数设置为 50 像素;检查滑动抛物线选项）。在伪彩色 RGB 图像的情况下:拆分 RGB 通道，打开 FAs 时离开通道，关闭剩余通道（图像 |颜色 |拆分通道）。
   5. 确定最小感兴趣区域 （ROI） 的区域。使用徒手或多边形选择勾勒出最小的单个焦点附着力并测量其面积（分析|测量）。对来自几个随机选择的图像（总共 20 个 20 个 20 个 PI）的不同 PI （9） 重复此步骤。计算并保存获得的结果的均值。
      注:仅在第一次分析给定图像集时（特定单元系、具有特定细胞外矩阵组件的涂层幻灯片、不同的培养条件），才需要此步骤。
   6. 使用以下方法之一将图像转换为二进制:
      1. 设置全局阈值（图像 |调整 |阈值;选中默认、B&W 和深色背景选项，手动调整阈值或自动设置阈值）。
      2. 设置本地阈值（图像 |调整 |自动本地阈值...;将方法设置为 Phansalkar 并检查黑色背景选项上的白色对象。接下来，反转图像（编辑|反转）。
   7. 测量 ROIS 的数量和面积。选择分析 |分析粒子;检查像素单位、显示结果、清除结果和汇总选项，设置"大小"参数，作为下边界使用步骤 2.1.5 中最小 PI 的均值。上部边界可以设置为典型单元格区域的 25%。
   8. 从"摘要"窗口传输到所选的数据管理程序，将数据（包括图像名称、FA 数量、FA 的总面积和平均面积;分别切片、计数、总面积、平均大小）传输。
   9. 通过计算 DAPI 染色的核来确定每个图像的细胞数。计数可以手动完成（插件 |分析 |单元格计数器）或可用协议中，如:https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation。
   10. 或者，为了便于 FAS 计数，请使用附加的 ImageJ 宏 （FAs.ijm）。
       1. 将 .ijm 文件与宏移动到位于 ImageJ 源文件文件夹中的插件或宏文件夹。
       2. 确定步骤 2.1.4 中描述的最小 ROI 区域。
       3. 打开宏文件（插件 |宏 |编辑...。
       4. 在运行宏之前，设置三个变量的值:填充area_of_the_smallest_region_of_interest步骤 2.1.4 期间获取的数字。将threshold_type设置为手动或自动。
       5. 保存更改（宏应已准备就绪）。
       6. 从 ImageJ 面板调用宏或创建快捷方式。宏从标准打开对话框窗口开始。选择要处理的图像。
          注:在手动阈值调整的情况下，需要手动确认阈值（避免使用"阈值"对话框窗口上的"应用"按钮接受更改，而是使用"需要操作的自定义"对话框窗口）。使用宏获得的结果与步骤 2.1.8 中描述的结果相同（包含在摘要对话框窗口中）。此外，在手动阈值调整的情况下，日志对话框窗口中将显示较低的阈值级别，因为此值允许将来根据需要重现获得的结果。补充图 S1 和 S2包含在 FAs.ijm 宏的培训数据集中。
2. 细胞形状分析
   1. 手动
      1. 在 ImageJ 或其他具有类似功能的图像处理软件中打开图像（有关 ImageJ 的进一步说明）。从菜单分析中选择要测量的参数 |在显示框中设置"测量"和"形状"描述符。
      2. 使用"手绘选择"图标手动划定细胞边界，以所选的结蛋白标记。自动计算每个单元格的所选参数。单击"编辑" + 来概述每个单元格后存储结果选择 |添加到管理器。只有完全可见的单元格，具有不间断的边界，才应计数。
      3. 当对视点字段中的所有单元格进行轮廓时，通过标记 ROI 管理器左侧框中显示的所有数字（对应于单元格）并单击"测量结果"结果显示在"结果"框中，并可以传输到首选电子表格进行测量。
   2. 自动化
      注:为了便于对细胞形状描述符（CSI、纵横比、圆度、固体度）进行量化，本文（CSI.ijm）编写了一个 ImageJ 宏并附着在其中。宏主要基于名为MorphoLibJ（https://imagej.net/MorphoLibJ5的^ImageJ插件。宏执行以下步骤:1） 将图像的每个边框扩展 10 个黑色像素 [MorpholibJ];2） 膨胀和侵蚀的圆 - 形态过滤器 [MorpholibJ];3） 通过形态分割生成细胞边界的二进制图像 [MorpholibJ];4） 细胞边界的扩展;5） 像素值的反转;6） 生成图像上细胞面积和周长的选择和测量;7） 使用轮廓单元格和 ImageJ ROI 选项将图像保存到新文件中。
      1. 将带宏的 .ijm 文件移动到位于 ImageJ 源文件文件夹中的插件或宏文件夹。从 ImageJ 面板调用宏或创建该宏的快捷方式。
      2. 在量化新数据集之前，确定最小和最大感兴趣区域的值。轮廓（手绘或多边形选择）图像上最小和最大单元格的一些 （3-10） 示例，然后测量其面积（分析 |测量）。
      3. 或者，使用默认设置运行宏（下限设置为 0，上限设置为无穷大），等待宏完成并选择"设置单元格大小边界"选项。通过单击最小单元格和最大单元格的标签，然后在 ImageJ ROI 管理器中按"测量"来测量最小单元格和最大单元格的面积。设置变量the_smallest_cellthe_biggest_cell值。保存更改，关闭所有宏对话框窗口并再次运行宏。
         注:宏可以在不设置 ROI 大小边界的情况下使用，但不建议使用宏，因为它显著增加了测量不当单元片段或细胞群集的机会。
      4. 使用标准"打开"对话框窗口启动宏。选择要处理的图像（灰度）。
      5. 分析结果。宏提供的输出包括:结果表（单元格标签、图像标签、单元格区域 [像素^2]、单元格周长^{[像素 2]、}圆周 [CSI]、纵横比、圆度、实心度）、带轮廓单元格的图像和 ROI 选择列表（也将保存在"结果"子文件夹中的新文件中）。结果表将自动复制到用户的剪贴板。
         注:补充图 S3 和 S4包含在 CSI.ijm 宏的培训数据集中。

3. 量化

1. FAs 的量化
   1. 计算每个细胞/核的平均 FA 数和平均 FA 大小。
      注:对于某些单元格行，可以分别在不同单元格中计算 FA。对于具有强细胞接触并成长为单层（如 MCF7）的细胞系，可以通过除以整个图像中的核数来计算每个单元的 FA 数量和大小。
   2. 评估种群之间潜在差异的统计意义（实验组）。根据数据的分布和方差，对于两个不同组的比较，请使用学生 t 检验（正态分布）或非参数 U 检验（曼-惠特尼）。对于多个组的比较，请使用双向 ANOVA 或 Kruskal-Wallis 以及适当的后期测试。
2. 细胞形状分析
   1. 形状描述符的计算
      1. 手动分析:使用公式在选择的每个测量单元格的电子表格中计算单元格形状索引（CSI，也称为圆形或单元格形状）
         
         注:CSI 假定值介于 1（圆形）和 0（拉长）之间。图 2 中介绍了各种单元格形状（具有相同的区域）及其各自的CPI 的示例。在自动分析中，形状描述符的值（在下面登记和定义）会自动计算并显示在结果框中:
         （1） CSI = 4°*面积/（周边）²
         （2） AR = 主轴/次要轴
         （3） 圆度 = 4*面积/*（主轴）²
         （4） 固体 = 面积/凸面面积
   2. 单元格形状分布的直方图
      1. 将单元格形状分布绘制为圆形 （CSI） 的直方图。根据单元格的 CSI 值（为最小 200–400 个单元格计算）将单元格分类为十个统一间隔之一（范围:0-1，箱宽:0.1）。直方图显示每个类别中的单元格数。
         注:显示典型 MCF7 细胞层形状分布的直方图显示大约 0.7-0.8 CSI 的峰值。如果细胞的形状被某种因素扭曲（例如，帕利塔塞尔治疗，这会导致G2/M相位性，结果更多的细胞是圆形的），它应该反映在直方图上。
   3. 累计分布图
      1. 比较每个细胞系的累积 CSI 分布，因为它是评估细胞形状变化（或分布中任何其他变化）中具有统计意义的差异的最佳方法。例如，它可以应用于跟踪 FA 不断变化的分布。
      2. 计算累积分布函数 （CDF） 以比较分布。CDF 为给定的 CSI 值（在 X 轴上绘制）分配所有值小于或等于此 CSI 值（在 Y 轴上绘制）的百分比（或相对计数）。因此，当 CSI 值变高时，小于或等于此值的值集的百分比也会变高。CDF 可以通过选择的统计软件进行计算，也可以手动计算。
      3. 对于统计分析，请使用科尔戈莫罗夫-斯米尔诺夫非参数测试。

Results

聚焦粘附分析
HAX1基因的敲击先前被证明会影响焦点粘附^6。细胞在胶原蛋白 I 涂层表面培养 48 小时。MCF7 控制细胞和 MCF7 细胞的图像与HAX1击倒（HAX1 KD） 从三个独立的实验染色的焦点粘附蛋白 paxillin 获得使用共聚焦显微镜 （图像从单焦平面/Z 切片从基础区域）.使用所述协议对来自每个细胞系中的大约 2，000-2，500 个细胞的 FA 进行量化。最小焦粘附的均值设置为 50（像素²）。图 3A 上的两个单元格行都显示了使用 ImageJ 计算 FAs 的代表性图像，包括最终的、编号的轮廓和 FAs 轮廓与原始图像的叠加。图3B中显示两个单元行中FA的数量和大小的差异。

细胞形状分析
手...

Discussion

细胞细胞和细胞基质粘附构成上皮细胞的固有属性，在组织形态生成和痛苦中起关键作用。在成人组织中，适当调节细胞层的机械特性对于维持平衡和预防肿瘤进展和转移等病理反应至关重要。焦点粘附的大小和数量取决于细胞基质粘附的强度，而细胞形状取决于收缩力，并且与细胞-细胞接触的状态有关。

在这里，我们描述了两个简单的定量分析方法，即由免疫荧光染色的细胞结构的数量和形状，在这种情况下，焦点粘附和细胞层中的整个细胞。但是，建议的工具可以重新用于任何选定的结构的定量。这些分析的关键问题是免疫荧光染色和共体成像的质量。这些方法可以在配备细胞培养装置和共合显微镜的任何标准实验室中实施。它们旨在比较细胞系，特别是当测量参数中的差异（自然或由特定处理引起的）很大时。不建议它们测量分钟差异或建立绝对测量值，因为它们对初始任意设置中的最小变化敏感，尤其是在焦点粘附的情况下。这种 FAs 定量方法不如更先进、更具体的方法（如 TIRF 显微镜），但它的优点是不需要精密的设备。

类似的焦粘附测量方法在^,7、...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	山羊抗兔，1：500
氯化铵	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
来自小牛皮肤的胶原蛋白	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1：10000（在 H2O 中储备 1 mg/mL），核酸染色
DMEM + GlutaMAX、1 g/L D-葡萄糖、丙酮酸	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
连接 噬红蛋白	细胞信号传导	2309S	兔子，1：400
层流柜 2 类	Alpina		标准设备
MCF7 基于 HAX1KD 细胞系	在华沙国家肿瘤研究所建立的细胞系，在 Balcerak 等人描述，2019		MCF7 细胞系与 HAX1敲低
MCF7 细胞系（对照）	ATCC	ATCC HTB-22	上皮、贴壁乳腺癌细胞系
Olympus CK2 光学显微镜	Olympus
Paxillin	Abcam	ab32084	兔子，1：250，Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
鬼笔环肽-TRITC 偶联物	Sigma	P1951	1：400（DMSO 中原液 5 mg/mL），肌动蛋白标记
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST –氯化钠	Sigma	S9888
TBST –Trizma 底座	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
蔡司 LSM800 共聚焦显微镜	蔡