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方法文章

MCF7细胞单层中细胞-基质黏附面积与细胞形态分布的量化分析

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DOI：

10.3791/61461

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2020年6月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Maria Sklodowska-Curie National Research Institute of Oncology

本文内容

摘要

本文描述了从MCF7细胞融合单层的共聚焦图像中定量分析1）黏着斑的大小和数量，以及2）细胞形态指数及其分布。

摘要

本文所述方法可基于多张适当染色的共聚焦图像，定量分析汇合贴壁细胞单层的若干参数：包括细胞与基底的黏附性（以黏着斑的数量和大小为指标）以及细胞形态（以细胞形态指数及其他形态描述符为特征）。黏着斑通过paxillin染色显示，细胞间边界则通过连接斑珠蛋白（junction plakoglobin）和肌动蛋白标记。细胞培养与染色方法为常规标准操作；图像代表单个焦平面；图像分析使用公开可用的图像处理软件完成。所介绍的实验方案可用于定量单层细胞中黏着斑的数量和大小，以及细胞形态分布的差异，但也可调整用于定量其他任何可染色的明确细胞结构（如线粒体或细胞核）的大小和形态。评估这些参数对于表征贴壁细胞层内的动态力学（包括细胞黏附及影响细胞形态的肌球蛋白收缩力）具有重要意义。

引言

上皮细胞单层作为一个整体发挥作用，其中细胞间黏附、细胞与基质的黏附以及收缩力和张力是重要的参数，这些参数的适当平衡有助于维持该结构的整体完整性1,2,3。因此，评估这些参数是判断细胞层当前状态的一种方法。

本文所述的两种方法可用于对贴壁的上皮细胞（此处为 MCF7 乳腺癌细胞系）融合单层进行二维分析。该分析利用共聚焦显微镜在 Z 轴不同位置获取的图像（单个 Z 层切片）进行，其中基底区域靠近基质，用于黏着斑（FA）的测量，顶端区域则用于细胞形态的测量。所介绍的方法相对简单，仅需常规实验技术及开源软件。本方案使用共聚焦显微镜即可完成，无需采用更为专业的全内反射荧光显微镜（TIRF）。因此，该方案可在相对标准的实验室条件下实施。尽管该方法的精确度有限，但能够区分黏着斑和细胞形态的基本差异。

本文所述的两种方法均包含标准实验流程，如细胞培养、免疫染色、共聚焦成像以及使用ImageJ进行的图像分析。然而，任何具备相应功能的图像处理软件均可用于此目的。所介绍的方法可用于追踪和比较药物处理或轻微基因修饰所引起的变化。由于这些方法的精确度有限，不建议获取绝对定量数值。为便于对大量图像进行测量，本文提供了两个自动化的宏程序。

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方案

1. 准备步骤

  1. 细胞接种以获得融合单层
    1. 接种前，用 I 型胶原蛋白（或其他选定的细胞外基质成分）包被 4 孔板的孔。对于 I 型胶原蛋白包被，请按照商业说明书操作：https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html，浓度为 8 μg/cm2。
    2. 将 400,000 个细胞接种至 4 孔板的一个孔中。
    3. 在 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 24 小时（或根据实验终点决定更长时间），然后进行染色。此步骤有助于细胞间连接的成熟和单层结构的形成。
    4. 使用倒置光学显微镜检查细胞融合度（要求约 90% 融合）以及单层细胞的一般状态。若细胞漂浮或呈现应激状态，则不应继续实验。
  2. 免疫荧光染色
    注意：可使用任意选择的染色方案进行细胞染色。本实验中免疫荧光染色方法如先前所述4。
    1. 对于黏着斑分析，使用选定的黏着斑蛋白进行染色（本方案中为 paxillin）；对于细胞形态分析，使用选定的细胞间连接蛋白进行染色（本方案中为桥粒蛋白 plakoglobin）。
    2. 除非另有说明，操作中均使用 0.5 mL 指定溶液。
    3. 在冰上用含 4% 甲醛的 PBS 固定细胞 30 分钟。
    4. 用含 0.1 M 氯化铵的 PBS 孵育 10 分钟，以淬灭自发荧光。
    5. 加入含 0.5% Triton X-100 的 PBS 处理 30 分钟（透化处理）。
    6. 用含 5% 脱脂奶粉（或 1% BSA）的 TBS-T 封闭 1 小时。
    7. 4 °C 下与一抗孵育过夜（抗 paxillin：兔源，1:250；抗 plakoglobin：兔源，1:400）。
    8. 与二抗孵育 30 分钟（Alexa Fluor 594 标记的山羊抗兔 IgG，1:500）。
    9. 用 300 nM DAPI 染色 1–5 分钟，避光操作。
      注意：可选地，可同时使用荧光标记的鬼笔环肽结合物对肌动蛋白进行额外染色（浓度 1:400）；鬼笔环肽应在与二抗孵育的步骤中加入。
  3. 共聚焦成像
    1. 使用共聚焦显微镜（例如 Zeiss LSM800）采集单个 Z 层图像。
      注意：可选的肌动蛋白染色有助于确定正确的焦平面。皮层肌动蛋白染色位于顶端区域，而肌动蛋白应力纤维则位于靠近基底的底部区域，如图 1所示。
    2. 黏着斑成像
      1. 选择靠近基底区域的 Z 层用于黏着斑分析。
      2. 使用数值孔径最高的物镜（推荐 63x，N.A.：1.4）。
        注意：黏着斑（FA）的形态非常特异且易于识别。建议从细胞下方的焦平面开始扫描，然后缓慢向细胞方向移动，直至黏着斑清晰可见。较小的视野通常更均匀，图像分析结果更准确，但单个视野中包含的细胞数量较少。
    3. 细胞间连接成像
      1. 使用 40x 或 63x 物镜。
      2. 选择细胞核染色和目标连接蛋白染色的通道。
      3. 选择单层细胞顶端区域的 Z 层用于细胞形态分析。
      4. 至少采集 3 个不同视野的图像（200–400 个细胞）。

2. 图像分析

注意：所提供的宏在 ImageJ 1.50f 或更高版本上运行效果最佳。仅适用于信噪比较高且无欠饱和或过饱和像素的图像进行定量分析。所述方法包含需要手动调整参数的步骤，因此建议采用盲法分析或盲法实验设计。如需加密图像文件名，可使用 ImageJ 插件（如“Blind Analysis Tool”，可从以下网址获取：https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools）。

  1. 黏着斑分析
    注意：以下方法推荐的输入文件为以8位灰度格式保存为.tiff文件的黏着斑（FAs）图像。
    1. 使用 ImageJ 打开图像。
    2. 将图像的尺度设置为像素（分析 | 设置比例尺; 去除刻度并检查 全球 选项）。
    3. 在测量选项中包含文件名和感兴趣区域（ROI）的面积分析 | 设置测量…）；检查 面积 和 显示标签 选项
    4. 减去背景（过程 | 减去背景 设置 滚动球半径 参数设置为 50 像素；检查 滑动抛物面 选项）。对于伪彩RGB图像：拆分RGB通道，保留显示脂肪酸（FAs）的通道打开，关闭其余通道（图像 | 颜色 | 分离通道).
    5. 确定最小感兴趣区域（ROI）的面积。使用徒手或多边形选区勾勒出最小的单个黏着斑，并测量其面积（分析 | 测量）。对几张随机选择的图像中的不同 ROI（FAs）重复此步骤（共 20 个 ROI）。计算并保存所得结果的平均值。
      注意：仅当首次分析特定图像集时（如特定细胞系、使用特定细胞外基质成分包被的载玻片、不同的培养条件）才需要执行此步骤。
    6. 将图像转换为 二元的 通过以下方法之一：
      1. 设置全局阈值（图像 | 调整 | 阈值 检查 默认，B&W 和 暗背景 选项，手动调整阈值或自动设置阈值。
      2. 设置局部阈值（图像 | 调整 | 自动局部阈值…； 设置 方法 向 Phansalkar 核实 黑色背景上的白色物体 选项。接下来，翻转图像（编辑 | 反转).
    7. 测量 ROI 的数量和面积。选择 分析 | 分析颗粒；检查 像素单位，显示结果，清除结果 和 总结选项，设定 尺寸参数，下限使用步骤2.1.5中最小ROIs的平均值，上限可设置为典型细胞面积的25%。
    8. 转移数据（包括图像名称、粘着斑数量、粘着斑总面积和平均面积） 切片、计数、总面积、平均大小）来自 摘要 选择合适的数据管理程序窗口。
    9. 通过计数DAPI染色的细胞核来确定每张图像中的细胞数量。计数可手动进行（插件 | 分析 | 细胞计数器）或参见现有实验方案，例如：https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation。
    10. 或者，为便于黏着斑（FAs）计数，可使用附带的 ImageJ 宏（FAs.ijm）。
      1. 将包含宏的 .ijm 文件移至 ImageJ 源文件目录中的 plugins 或 macros 文件夹。
      2. 确定步骤 2.1.4 中所述的最小 ROI 区域。
      3. 打开宏文件（插件 | 宏 | 编辑...).
      4. 在运行宏之前，设置三个变量的值：填充值 最小感兴趣区域的面积 在步骤 2.1.4 中获取编号后设置 阈值类型 值 手动 或 自动.
      5. 保存更改（该宏应已可使用）。
      6. 从 ImageJ 面板调用该宏，或为其创建快捷方式。该宏以标准步骤开始 开放 对话框窗口。选择要处理的图像。
        注意：如果进行手动阈值调整，则需要手动确认阈值数值（避免使用接受更改功能） 应用 按钮开启 阈值 对话框窗口，使用 操作要求 自定义对话框窗口）。使用该宏所获得的结果与步骤 2.1.8 中所述结果相同（包含在 摘要 对话框窗口）。此外，在手动调整阈值的情况下 较低阈值水平 显示在 日志 对话框窗口，因为该数值可在需要时用于日后重现实验结果。 补充图 S1 和 S2 被纳入FAs.ijm宏的训练数据集。
  2. 细胞形态分析
    1. 手动
      1. 在 ImageJ 或具有类似功能的其他图像处理软件中打开图像（以下说明针对 ImageJ）。通过从菜单中选择来设定待测量的参数 分析 | 设置测量参数 并发出滴答声 形状描述符 在弹出的对话框中。
      2. 手动勾画由所选连接蛋白标记的细胞边界 徒手选择 图标。选定的参数将自动计算每个细胞。在勾画每个细胞后，单击以保存结果 编辑 | 选择 | 添加到管理器仅计数完整且完全可见、边界连续无中断的细胞。
      3. 当视野中所有细胞均被勾画出轮廓后，通过标记 ROI 管理器左侧框中出现的所有编号（对应细胞）并点击 测量 结果出现在 结果 盒子中，并可转移至选定的电子表格。
    2. 自动化
      注意：为便于量化细胞形态描述符（CSI、长宽比、圆度、实度），本文附带了一个 ImageJ 宏（CSI.ijm）。该宏主要基于名为 MorphoLibJ 的 ImageJ 插件（https://imagej.net/MorphoLibJ）开发。5该宏执行以下步骤：1）使用10个黑色像素扩展图像的每个边界［MorpholibJ］；2）进行多轮膨胀和腐蚀操作——形态学滤波［MorpholibJ］；3）通过形态学分割生成细胞边界的二值图像［MorpholibJ］；4）膨胀细胞边界；5）反转像素值；6）生成选区，并测量图像上细胞的面积和周长；7）将标注出细胞边界的图像及ImageJ的ROI选区保存为新文件。
      1. 将包含宏的 .ijm 文件移至 ImageJ 源文件目录中的 plugins 或 macros 文件夹。通过 ImageJ 面板调用该宏，或为其创建快捷方式。
      2. 在对新数据集进行定量分析之前，需确定最小和最大感兴趣区域的数值。在图像上勾画出若干个（3-10个）最小和最大细胞的轮廓（可使用手绘或多边形选区工具），然后测量其面积分析 | 测量).
      3. 或者，使用默认设置运行宏（下限设为 0，上限设为无穷大），等待宏执行完成，然后选择 设置细胞大小边界 选项。通过点击最小和最大细胞的标签来测量其面积，然后按 测量 在 ImageJ 的 ROI Manager 中。设置值为 最小的细胞与最大的细胞 变量。保存更改，关闭所有宏对话框窗口，然后再次运行宏。
        注意：虽然可以不设置 ROI 尺寸边界而使用该宏，但不推荐这样做，因为它会显著增加测量到不适当的细胞碎片或细胞簇的可能性。
      4. 启动宏，使用标准方法 开放 对话框窗口。选择要处理的图像（灰度图）。
      5. 分析结果。宏程序提供的输出包括：结果表格（细胞标签、图像标签、细胞面积 [像素]2]，细胞周长［像素］2]、圆度 [CSI]、长宽比、圆形度、实度）、带有轮廓标记的细胞图像以及 ROI 选择列表（该列表也将保存在一个新文件中） 结果 子文件夹）。结果表格将自动复制到用户的剪贴板中。
        注意： 补充图 S3 和 S4 被纳入 CSI.ijm 宏的训练数据集。

3. 定量分析

  1. 黏着斑（FAs）的定量分析
    1. 计算每个细胞/细胞核的平均黏着斑数量及平均黏着斑大小。
      注：对于某些细胞系，可分别对单个细胞中的黏着斑进行计数。而对于具有较强细胞间连接、以单层形式生长的细胞系（如 MCF7），可通过将整张图像中黏着斑计数所得数值除以细胞核总数，来计算每个细胞的黏着斑数量和大小。
    2. 评估不同群体（实验组）之间潜在差异的统计学显著性。根据数据的分布和方差情况，若比较两个不同组别，可选用 Student t 检验（正态分布）或非参数 U 检验（Mann-Whitney 检验）；若比较多个组别，则使用单因素方差分析（one-way ANOVA）或 Kruskal–Wallis 检验，并结合适当的事后检验（post-hoc tests）。
  2. 细胞形态分析
    1. 形态参数的计算
      1. 手动分析：在所选电子表格软件中，利用以下公式，根据每个被测细胞的相应面积和周长计算细胞形态指数（CSI，也称为圆形度或细胞形状）：
        CSI 公式：CSI = 4π × 面积/(周长)²，公式图示，圆形度指数计算。
        注：CSI 的取值范围为 1（圆形）到 0（细长形）。不同细胞形态（面积相同）及其对应的 CSI 值示例见图 2。在自动分析中，形态参数（如下所列并定义）将自动计算，并显示在结果框中：
        (1) CSI = 4π*面积/(周长)2
        (2) AR = 长轴/短轴
        (3) 圆形度 = 4*面积/π*(长轴)2
        (4) 实心度 = 面积/凸包面积
    2. 细胞形态分布直方图
      1. 以圆形度（CSI）的直方图形式绘制细胞形态分布。根据每个细胞的 CSI 值（至少测量 200–400 个细胞）将其归入十个等宽区间之一（范围：0–1，区间宽度：0.1）。直方图显示每个类别中的细胞数量。
        注：典型的 MCF7 细胞层形态分布直方图在 CSI 约 0.7–0.8 处出现峰值。若细胞形态受到某些因素影响而发生改变（例如紫杉醇处理导致 G2/M 期阻滞，从而使更多细胞呈圆形），这种变化应在直方图中有所体现。
    3. 累积分布图
      1. 比较各细胞系的累积 CSI 分布，因为这是评估细胞形态变化（或其他分布变化）统计学差异的最佳方法。例如，该方法也可用于追踪黏着斑分布的变化。
      2. 计算累积分布函数（CDF）以比较分布情况。CDF 将给定的 CSI 值（X 轴）对应于所有小于或等于该 CSI 值的样本所占的百分比（或相对计数，Y 轴）。因此，随着 CSI 值的增加，小于或等于该值的样本百分比也随之增加。CDF 可通过所选统计软件计算，也可手动计算。
      3. 进行统计分析时，使用 Kolmogorov-Smirnov 非参数检验。

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结果

黏着斑分析
先前研究表明，HAX1 基因的敲低会影响黏着斑的形成6。将细胞培养于I型胶原蛋白包被的表面48小时。通过共聚焦显微镜获取了来自三次独立实验的对照MCF7细胞及HAX1基因敲低（HAX1 KD）MCF7细胞的图像，细胞经黏着斑蛋白paxillin染色（图像来自基底区域的单个焦平面/Z切片）。采用所述方案对每种细胞系约2,000–2,500个细胞的黏着斑进行定量分析。最小黏着斑的平均值设定为50（像素2）。使用ImageJ进行黏着斑计数的代表性图像显示于图3A，包括最终的编号轮廓以及黏着斑轮廓与原始图像的叠加结果。两种细胞系中黏着斑的数量和大小差异见图3B。

细胞形态分析
人工评估：将 MCF...

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讨论

细胞间黏附和细胞-基质黏附是上皮细胞的固有特性，在组织形态发生和胚胎发育过程中发挥关键作用。在成体组织中，细胞层力学特性的适当调控对于维持稳态以及防止肿瘤进展和转移等病理反应至关重要。黏着斑的大小和数量取决于细胞-基质黏附的强度，而细胞形态则依赖于收缩力，并与细胞-细胞连接的状态相关。

本文介绍了两种简单的定量分析方法，用于分析免疫荧光染色的细胞结构（本例中为细胞层中的黏着斑和整个细胞）的面积、数量和形态。然而，所提出的方法也可用于其他任意选定结构的定量分析。这些分析的关键在于免疫荧光染色和共聚焦成像的质量。这些方法可在配备细胞培养装置和共聚焦显微镜的任何标准实验室中实施。它们适用于比较不同细胞系，尤其是在所测参数存在显著差异（由自然因素或特定处理诱导产生）的情况下。由于这些方法对初始人为设定参数的微小变化较为敏感，特别是对于黏着斑的分析，因此不建议用于检测细微差异或获取绝对测量值。该黏着斑定量方法在精度上逊于更先进和特异的技术（如全内反射荧光显微镜，TIRF），但其优势在于无需复杂的仪器设备。

此前已有文献描述过类似的黏着斑...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由波兰国家科学中心资助，项目编号为 2014/14/M/NZ1/00437。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA32740山羊抗兔，1:500
氯化铵SigmaA9434
BSABioShopALB001.500
小牛皮胶原蛋白SigmaC9791-10MG
DAPISigmaD95421:10000（储存液为1 mg/mL溶于H2O），用于核酸染色
DMEM + GlutaMAX，1 g/L D-葡萄糖，丙酮酸ThermoFisher Scientific21885-025
FBSThermoFisher Scientific10270-136
连接斑珠蛋白（Junction plakoglobin）Cell Signaling2309S兔源抗体，1:400
II级层流柜Alpina标准设备
MCF7-basedHAX1KD细胞系由华沙国家肿瘤研究所建立的细胞系，详见Balcerak等，2019MCF7细胞系中HAX1基因敲低
MCF7细胞系（对照）ATCCATCC HTB-22上皮来源、贴壁生长的乳腺癌细胞系
Olympus CK2光学显微镜Olympus
PaxillinAbcamab32084兔源抗体，1:250，Y113位点
PBSThermoFisher Scientific10010023
鬼笔环肽-TRITC偶联物SigmaP19511:400（储存液为5 mg/mL溶于DMSO），用于肌动蛋白标记
PTXSigmaT7402-1MG
TBST – NaClSigmaS9888
TBST – Trizma baseSigmaT1503
Triton X-100Sigma9002-93-11
Zeiss LSM800共聚焦显微镜Zeiss

参考文献

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MCF7细胞单层中细胞-基质黏附面积与细胞形态分布的量化分析
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