MCF7细胞单层中细胞基质粘附面积和细胞形状分布的定量

摘要

本文描述了1）焦点粘附的大小和数量，2）细胞形状指数及其分布从MCF7细胞的汇合单层共聚焦图像。

摘要

此处介绍的方法从多个适当染色的共聚焦图像中量化了汇合粘附细胞单层之间的一些参数:粘附到基底，作为焦粘附数和大小的函数，以及以细胞形状索引和其他形状描述符为特征的细胞形状。焦粘附物通过paxillin染色和细胞边界以结球蛋白和行动素为标志。细胞培养和染色的方法是标准的;图像代表单个焦点平面;使用公开提供的图像处理软件进行图像分析。提出的协议用于量化焦点粘附的数量和大小以及单层中细胞形状分布的差异，但它们可以重新用于量化任何其他可染色的不同细胞结构（例如线粒体或核）的大小和形状。评估这些参数对于粘附细胞层中动态力的表征非常重要，包括影响细胞形状的细胞粘附和运动素收缩性。

引言

上皮细胞单层作为一个整体，其中细胞和细胞基板粘附以及收缩力和张力代表重要的参数^,，其适当的平衡有助于^{单元1，2，3,2的整体完整性}。因此，评估这些参数是建立细胞层的当前状态的一种方式。

此处描述的两种方法表示对粘附的上皮细胞（本例中为 MCF7 乳腺癌细胞系）的汇合单层进行二维分析。使用 Z 轴上不同区域的共和图像（单个 Z 切片）执行分析;基座附近的基底区域，用于焦粘附 （FA） 测量，用于细胞形状测量的平面区域。提出的方法相对简单，需要标准的实验室技术和开源软件。共体显微镜足以满足此协议，因此无需采用更专业的 TIRF（总内部反射荧光）显微镜即可执行。因此，该议定书可以在相对标准的实验室环境中实施。虽然方法的准确性有限，但它们可以区分焦粘附和细胞形状的基本差异。

此处描述的两种方法都包括使用 ImageJ 执行的标准实验程序，如细胞培养、免疫污染、共体成像和图像分析。但是，可以使用任何具有适当功能的图像处理软件。提出的方法可以跟踪和比较药理治疗或最小的基因改造带来的变化。由于这些方法的精度有限，不建议获取确定值。包括两个自动宏，以方便测量许多图像。

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方案

1. 准备步骤

1. 细胞播种，以获得汇合单层
   1. 播种前，用胶原蛋白 I（或选择的其他 ECM 组件）涂覆 4 孔室滑轨的孔。对于胶原蛋白 I 涂层，请遵循https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html:浓度为 8 μg/cm²。
   2. 种子400，000细胞到一个井的4井室幻灯片。
   3. 染色前培养细胞24小时（或更长，取决于实验终点），在37°C的培养箱中，5%CO_2。此步骤允许细胞接触的成熟和单层的形成。
   4. 使用光学倒置显微镜验证汇合（约 90% 需要）和单层一般条件。如果单元格是浮动的或看起来有压力，请勿继续。
2. 免疫荧光染色
   注:细胞可以染色与选择的协议。在这里，免疫荧光执行如前所述^4。
   1. 对于焦粘附分析，用选择的焦点粘附蛋白（在此协议中）染色细胞。用于细胞形状分析染色与细胞结蛋白的选择（在此协议中脱烟蛋白蛋白蛋白）。
   2. 对于该过程，除非另有说明，否则请使用 0.5 mL 的指定解决方案。
   3. 在PBS中修复4%甲醛中的细胞，在冰上30分钟。
   4. 用0.1 M 氯化铵（PBS）孵育10分....

结果

聚焦粘附分析
HAX1基因的敲击先前被证明会影响焦点粘附^6。细胞在胶原蛋白 I 涂层表面培养 48 小时。MCF7 控制细胞和 MCF7 细胞的图像与HAX1击倒（HAX1 KD） 从三个独立的实验染色的焦点粘附蛋白 paxillin 获得使用共聚焦显微镜 （图像从单焦平面/Z 切片从基础区域）.使用所述协议对来自每个细胞系中的大约 2，000-2，500 个细胞的 FA 进行量化。最小焦粘附的均值设置为 50（像素²）。图 3A 上的两个单元格行都显示了使用 ImageJ 计算 FAs 的代表性图像，包括最终的、编号的轮廓和 FAs 轮廓与原始图像的叠加。图3B中显示两个单元行中FA的数量和大小的差异。

细胞形状分析
手.......

讨论

细胞细胞和细胞基质粘附构成上皮细胞的固有属性，在组织形态生成和痛苦中起关键作用。在成人组织中，适当调节细胞层的机械特性对于维持平衡和预防肿瘤进展和转移等病理反应至关重要。焦点粘附的大小和数量取决于细胞基质粘附的强度，而细胞形状取决于收缩力，并且与细胞-细胞接触的状态有关。

在这里，我们描述了两个简单的定量分析方法，即由免疫荧光染色的细胞结构的数量和形状，在这种情况下，焦点粘附和细胞层中的整个细胞。但是，建议的工具可以重新用于任何选定的结构的定量。这些分析的关键问题是免疫荧光染色和共体成像的质量。这些方法可以在配备细胞培养装置和共合显微镜的任何标准实验室中实施。它们旨在比较细胞系，特别是当测量参数中的差异（自然或由特定处理引起的）很大时。不建议它们测量分钟差异或建立绝对测量值，因为它们对初始任意设置中的最小变化敏感，尤其是在焦点粘附的情况下。这种 FAs 定量方法不如更先进、更具体的方法（如 TIRF 显微镜），但它的优点是不需要精密的设备。

类似的焦粘附测量方法在^,7、.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	山羊抗兔，1：500
氯化铵	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
来自小牛皮肤的胶原蛋白	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1：10000（在 H2O 中储备 1 mg/mL），核酸染色
DMEM + GlutaMAX、1 g/L D-葡萄糖、丙酮酸	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
连接 噬红蛋白	细胞信号传导	2309S	兔子，1：400
层流柜 2 类	Alpina		标准设备
MCF7 基于 HAX1KD 细胞系	在华沙国家肿瘤研究所建立的细胞系，在 Balcerak 等人描述，2019		MCF7 细胞系与 HAX1敲低
MCF7 细胞系（对照）	ATCC	ATCC HTB-22	上皮、贴壁乳腺癌细胞系
Olympus CK2 光学显微镜	Olympus
Paxillin	Abcam	ab32084	兔子，1：250，Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
鬼笔环肽-TRITC 偶联物	Sigma	P1951	1：400（DMSO 中原液 5 mg/mL），肌动蛋白标记
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST –氯化钠	Sigma	S9888
TBST –Trizma 底座	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
蔡司 LSM800 共聚焦显微镜	蔡