流式细胞术方法体外表征急性分离的成年小胶质细胞和脑巨噬细胞的吞噬特性

摘要

评估小胶质细胞和脑巨噬细胞的吞噬特性可为分子谱型研究提供重要的功能维度。本文描述了一种经过验证的实验方案，利用流式细胞术快速、可靠地定量检测从小鼠模型中急性分离的小胶质细胞和脑巨噬细胞对荧光微球及淀粉样蛋白β纤维的吞噬作用。

摘要

小胶质细胞与中枢神经系统（CNS）浸润的巨噬细胞统称为中枢神经系统单核吞噬细胞（CNS-MPs），在包括神经退行性疾病和脑卒中在内的多种神经系统疾病中发挥核心作用。CNS-MPs 参与病理性蛋白、细胞碎片以及神经元突触的吞噬清除过程，这些过程各自依赖不同的分子机制。对这些吞噬特性进行表征，可提供一种功能性读出手段，补充通过传统流式细胞术、转录组学和蛋白质组学方法对小胶质细胞进行的分子谱分析。目前对小胶质细胞吞噬功能的分析主要依赖显微镜观察或小鼠新生小胶质细胞的体外培养。前者取样范围有限，而后者则难以真实反映成年个体 CNS-MPs 在体内的实际状态。本文介绍了一种经优化的实验方案，利用流式细胞术对急性分离的小鼠 CNS-MPs 的吞噬特性进行表型分析。该方法通过机械解离结合密度梯度离心技术，从成年小鼠脑组织中急性分离 CNS-MPs，随后将其与荧光微球或荧光标记的 Aβ 纤维共孵育，洗涤后使用针对表面标志物（CD11b、CD45）的抗体组合进行染色标记。利用该方法，可比较脑内常驻小胶质细胞与 CNS 浸润巨噬细胞的吞噬特性，并进一步评估衰老及疾病病理状态对这些吞噬表型的影响。这一快速检测方法亦有望用于对死后或手术获取的人脑组织中急性分离的人源 CNS-MPs 进行功能性表型分析。此外，通过选择性抑制特定的吞噬通路，还可深入研究不同 CNS-MP 亚群介导吞噬作用的具体机制。

引言

中枢神经系统（CNS）的固有免疫细胞主要由小胶质细胞和浸润的单核细胞/巨噬细胞组成，统称为中枢神经系统单核吞噬细胞（CNS-MPs）¹。CNS-MPs 参与阿尔茨海默病（AD）、神经炎症性疾病以及脑卒中等多种神经退行性疾病的发生发展过程^2,3,4。CNS-MPs 与星形胶质细胞、周细胞和室管膜细胞共同具有吞噬功能^5,6。在稳态状态下，CNS-MPs 负责持续监测局部微环境，清除凋亡细胞碎片和异常蛋白，并通过突触修剪重塑神经元连接^7,8,9,10。在阿尔茨海默病等神经退行性病变中，CNS-MPs 会呈现出特定的疾病相关分子和功能表型，发挥包括清除聚集的β-淀粉样蛋白（Aβ）和神经元成分、释放炎症性细胞因子和介质等病理作用，从而表现出复杂的促炎性、有害性以及抗炎性、保护性双重功能¹¹

方案

所有小鼠实验均在获得埃默里大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准后进行，并严格遵守美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的规定。

1. 分离当天的准备工作

1. 准备一个冰桶，用于在整个分离过程中保持所有试剂、缓冲液和细胞悬液处于低温状态。
2. 在灌注前30分钟至1小时，将1×磷酸盐缓冲液（PBS）（至少1 L）置于4 °C预冷，并在灌注和分离过程中始终将1× PBS保持在冰上。
3. 配制密度梯度介质的工作浓度（称为35% SIP，参见材料表）。
4. 在细胞分离前，预先标记实验中使用的所有锥形管和流式细胞术管，以避免处理时间延误。此外，在灌注前还需准备好分离所需的其他所有耗材，例如40 µm细胞筛、注射器和针头。

2. 成年小鼠小胶质细胞的急性分离

1. 将成年小鼠置于含异氟烷（5 mL）的玻璃麻醉诱导舱内，直至小鼠停止呼吸且对后肢足垫夹捏无反应，以实现麻醉。
2. 使用26 G针头和10 mL注射器，以30 mL冰冷的1× PBS进行心脏灌注，直至无可见血液。
3. 使用手术剪将小鼠断头。用小剪刀剪开皮肤，暴露颅骨。按照文献²⁴所述方法去除颅骨，避免损伤脑组织。立即取出脑组织，并转移至置于50 mL锥....

结果

为了说明急性分离的中枢神经系统髓系细胞（CNS-MPs）吞噬微球和Aβ42纤维的典型结果，本研究从短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）后同侧半球急性分离获得CNS-MPs⁸。关于MCAO模型中CNS-MPs吞噬特性的详细信息，请参见先前发表的研究⁸。简言之，在72小时恢复期后，采用机械解离结合密度梯度离心法从新鲜脑组织中急性分离CNS-MPs，并将其与荧光标记的微球或Aβ纤维共同孵育（图1）。随后，使用针对两种表面标志物CD11b和CD45的荧光标记抗体对CNS-MPs进行染色，并通过流式细胞术分析其对微球或Aβ纤维的吞噬摄取情况（图1）。该方案已被用于研究衰老、进行性神经病理变化以及缺血性脑损伤^8,9,26过程中吞噬功能的改变，同时也可用于评.......

讨论

流式细胞术是一种利用荧光标记探针（通常是抗体）来检测细胞表面或细胞内区室中目标蛋白或标志物表达情况的技术。细胞表面或细胞内抗体通常与可被激光激发的荧光染料偶联，这些荧光染料具有独特的发射光谱。通过与这些抗体孵育的细胞，可根据这些标志物的表达模式被分为多个亚群。中枢神经系统单核吞噬细胞（CNS-MPs）主要包括小胶质细胞和浸润中枢神经系统的单核细胞/巨噬细胞。小胶质细胞与中枢神经系统单核细胞/巨噬细胞具有不同的功能和分子特征，且在阿尔茨海默病等疾病状态下这些特性可能进一步发生改变。利用流式细胞术方法，可在最大程度上减少对这些细胞在中枢神经系统内代表性状态的干扰，从而有效表征它们之间的差异。本文描述了一种快速评估急性分离的CNS-MPs吞噬特性的实验方案，避免了传统方法中通常所需的长期培养步骤。

本文所述方法可用于表征中枢神经系统髓系细胞（CNS-MPs）吞噬较大颗粒（如微球）以及蛋白质聚集体（如Aβ纤维）的能力。这两种吞噬过程由不同的受体群介导，如先前研究所示⁹。此前的研究还证实，这两种底物的摄取均依赖于肌动蛋白，依据是使用细胞松弛素D.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10倍汉克斯平衡盐溶液（10x HBSS）	ThermoFisher	14065056	4 °C 保存。用于按照方案中所述配制 SIP
1倍汉克斯平衡盐溶液（1x HBSS）	ThermoFisher	14175095	4 °C 保存。用于按照方案中所述配制 35% SIP
1倍磷酸盐缓冲液（PBS）			https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html 10xPBS 室温保存。将 1 份 10xPBS 与 9 份 MilliQ dH2O 混合，新鲜配制 1xPBS，并在使用前于 4 °C 冷却 1 小时。冷藏前确保 1xPBS 的 pH 值为 7.0。
35% SIP			配制 20 mL 的 35% SIP，需使用 7 mL SIP 和 13 mL 冰冷的 1× HBSS。配制后置于冰上，待后续处理
APC-Cy7 标记大鼠抗 CD11b 抗体	BD Pharmingen	557657	4 °C 保存，使用时置于冰上，避光。流式细胞术稀释比例为 1:100
FITC 标记大鼠抗小鼠 CD145 抗体	BD Pharmingen	553080	4 °C 保存，使用时置于冰上，避光。流式细胞术稀释比例为 1:100
LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒	ThermoFisher	L34961	-20 °C 保存。向一管染料中加入 50 µL DMSO，充分涡旋混匀，并以最大转速离心 1 分钟。分装成每份 10µL，-20 °C 保存。每次实验使用新鲜分装的染料，按 1:500 稀释比例加入样品中。
OneComp eBeads 补偿微球	ThermoFisher	01-1111-42	4 °C 保存，使用前充分涡旋混匀，使用时置于冰上。
PE-Cy7 标记大鼠抗小鼠 CD145 抗体	BD Pharmingen	552848	4 °C 保存，使用时置于冰上，避光。流式细胞术稀释比例为 1:100
Percoll（pH 8.5–9.5）	Sigma	P1644	4 °C 保存。配制 10 mL 标准等渗 Percoll（SIP）：使用 9 mL 冷 Percoll 和 1 mL 冷 10× HBSS。
藻红蛋白偶联微球	ThermoFisher	F13083	4 °C 保存，或使用时置于冰上。
β-淀粉样蛋白（1–42），HiLyte Fluor 488 标记，人源	AnaSpec	AS-60479-01	Aβ 纤维的终浓度为 200µM，使用前需进行稀释。-20 °C 保存。每次实验均需新鲜配制工作液。