需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

单细胞收集围植入期人类胚胎中的滋养层细胞

6.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61476

⸱

2020年6月12日

 ,  ,  ,  , 
1Colorado Center for Reproductive Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种方法，用于解冻玻璃化保存的人类囊胚，将其在体外培养至着床时期，消化为单细胞，并收集早期滋养层细胞以供进一步研究。

摘要

人类着床是指胚泡与子宫表面上皮细胞相互靠近并黏附，随后侵入母体蜕膜的过程，这一关键但神秘的生物学事件由于技术和伦理限制，历史上一直难以研究。着床过程始于滋养外胚层发育为早期滋养层细胞，并进一步分化为不同的滋养层亚群。早期滋养层细胞的异常分化可能导致着床失败、胎盘病理、胎儿畸形以及流产。近年来，已有方法被开发出来，可在无母体组织的情况下将人类胚胎体外培养至受精后第13天，这一时间段涵盖了人类着床期。这使得研究人员能够在排除母体干扰并避免体内研究早期胚胎分化事件固有障碍的前提下，探索人类着床过程，并重现这一关键时期滋养层分化的动态变化。为了在着床期间对不同滋养层亚群进行表征，我们采用了现有的二维（2D）延时培养方法，并建立了一种通过酶消化分离不同类型滋养层细胞以用于后续检测的实验流程。在二维条件下培养的胚胎形态相对扁平，可能在模拟体内三维（3D）胚胎结构方面存在不足。然而，延时培养过程中观察到的形态学特征及基因表达变化表明，滋养层分化过程受影响较小。包括细胞滋养层、合体滋养层和迁移性滋养层在内的不同滋养层亚群，可根据其大小、位置和出现时间加以区分，并用于进一步的表征或实验。对这些早期滋养层细胞的研究可能有助于理解人类着床机制、治疗常见胎盘疾病，并降低妊娠丢失的发生率。

引言

人类着床过程及早期胎盘的形成历来难以研究，很大程度上仍不明确，因为在此阶段妊娠尚无法临床检测，人类组织样本无法获取。动物模型也不足以替代，因为人类胎盘形成具有其他真兽类哺乳动物所不具备的独特特征。例如，人类胎盘会深入侵入蜕膜，部分滋养层细胞可到达子宫肌层的内三分之一区域，同时另一些细胞则重塑子宫螺旋动脉。即便是与我们亲缘关系最近的非人灵长类动物，在胎盘形态以及滋养层细胞与母体蜕膜组织相互作用方面也存在差异1,2,3。在20世纪80年代之前，体外获取着床前人类胚胎是不可能的；直到临床人类体外受精（IVF）成为治疗不孕症的常规手段后，才得以实现4。如今，人类囊胚可在体外培养，用于筛选更具活力的胚胎进行移植，并实现安全的遗传学检测。随着胚胎培养技术的进步以及体外受精的广泛应用，产生了大量患者治疗周期结束后剩余的囊胚。在获得患者知情同意、通过机构审查委员会（IRB）批准并符合特定限制条件的前提下，这些囊胚可用于科学研究。它们已成为极为宝贵的研究资源，曾被用于建立人类胚胎干细胞系5，研究内细胞团向胚胎干细胞转变的过程6,7，以及最近成功地将人类囊胚体外培养至第13天（D13），以模拟人类着床过程8,9。通过应用近年来发展的单细胞组学技术，研究者得以接触这些着床阶段的人类胚胎组织，前所未有地揭示调控这一高度动态的细胞分化过程的分子机制10,11,12,13。

本文描述了我们近期发表的研究中所采用的方法，该研究旨在表征人类着床过程中滋养层细胞分化的动态过程12。本实验方案包括玻璃化冷冻囊胚的复苏、体外受精后长达第12天（D12）的胚胎延时培养、将胚胎通过酶消化法解离为单细胞，以及为后续检测收集细胞（图1）。该延时培养体系可在无母体输入的情况下支持围着床期人类胚胎的发育，并重现了滋养层细胞的分化过程，其结果与多年前基于组织学标本所观察到的现象一致14,15,16,17。在着床过程中，滋养层细胞群体至少包含两种细胞类型：具有类似前体细胞特征的单核细胞——细胞滋养层细胞（cytotrophoblast, CTB），以及终末分化、多核的合体滋养层细胞（syncytiotrophoblast, STB）。经胰蛋白酶消化后，CTB表现为体积较小、形态呈圆形的细胞，其形态学特征与其他细胞谱系难以区分（图2A，左图）。通过单细胞RNA测序揭示的不同转录组特征，可实现CTB与其他细胞谱系（如上胚层和原始内胚层）的有效分离。合体滋养层细胞则表现为形状不规则、体积显著大于其他细胞类型的结构，主要位于胚胎的外周区域，易于识别（图2A，中图；图2B，左图）。迁移性滋养层细胞（migratory trophoblast cells, MTB）是延时培养过程中发现的另一类滋养层亚谱系，其形态表现为似乎正从胚胎主体向外迁移（图2A，右图；图2B，右图）。尽管MTB表达许多与绒毛外滋养层细胞（extra villous trophoblast, EVT）相同的标志物，但由于在这一极早期发育阶段胎盘中的绒毛结构尚未形成，因此不应将其称为EVT。

实验上，我们能够在胚胎于第8天（D8）、第10天（D10）和第12天（D12）被消化为单细胞后，收集到易于区分的小型CTB和大型STB（图2A,B）。迁移型滋养层细胞（MTB）出现在胚胎延时培养的较晚阶段，可在第12天全胚胎酶消化前进行收集（图2A,B）。通过在单细胞分析前根据表型分离这三种滋养层亚群，我们能够鉴定每种细胞类型的特异性转录组标志物，并明确其各自的生物学功能。细胞滋养层细胞（CTB）具有高度增殖性，作为前体细胞为STB和MTB分化谱系提供来源10,11,12,13。合体滋养层细胞（STB）参与胎盘激素的产生以维持妊娠，可能还介导胚胎向子宫内膜的植入10,11,12,13。迁移型滋养层细胞则表现出更强的侵袭性和迁移性表型，可能负责对子宫内膜进行更深入且更广泛的定植10,11,12,13。在定义了每种细胞类型的转录组特征后，聚类分析还揭示出另外两个细胞亚群，它们在形态上与CTB无法区分，但其转录组分别具有STB和MTB的特征12。这些处于中间阶段的细胞很可能正处于从CTB向MTB或STB谱系分化的进程中；若仅将胚胎盲目消化并单纯依据转录组进行细胞分离，则这些细胞将被遗漏。

本文所述方案采用二维（2D）培养系统，可能并非支持三维（3D）结构发育的最佳选择，这一点已由近期一篇描述新开发的3D培养系统的出版物所指出13。然而，在该2D系统中，早期滋养层细胞的分化情况与体内样本的观察结果一致14,15,16,17。本方案也可轻松适用于近期报道的3D培养系统13，仅需极少修改。所有步骤均使用手持显微操作移液器配合 commercially available disposable tips，或使用连接橡胶管、滤器和吹管嘴的细拉玻璃毛细管制成的口吸移液器完成。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有人类胚胎均已获得捐赠者同意，可用于科学研究。扩展人类胚胎培养的方案已获得西方机构审查委员会（研究编号：1179872）批准，并遵循国际指南。任何对人类胚胎的使用，均须由采用本方案的研究机构相关的适当伦理与管理机构进行审查。

1. 准备

  1. 在胚胎复苏前一天，于无菌超净工作台中配制培养基并制备复苏培养板。
    1. 准备2 mL含10%（v/v）血清蛋白替代物（SPS）的囊胚培养基（BM）。
      注意： 囊胚培养基可能含有或不含添加的蛋白质。本实验所用培养基需额外添加10%指定的白蛋白。请参照生产商说明，了解该添加成分的具体要求。所有培养基在平衡前均应使用连接无菌注射器的无菌0.22 μM滤器进行过滤。
    2. 在两个中心井器官培养洗涤皿中各加入500 μL含10%（v/v）SPS的BM，并覆盖500 μL胚胎培养级油。
    3. 在60 mm组织培养皿中，加入8 mL胚胎培养油，然后在培养皿底部固定含有10%（v/v）SPS的20 μL BM液滴。每个复苏的胚胎对应一个液滴。
      注意：可根据需要制备更多的培养基、液滴和洗涤皿。也可在加入油层之前将液滴添加至培养皿中。在油层下固定液滴有助于减少蒸发以及由此引起的渗透压变化。
    4. 用10% v/v SPS平衡BM，并将洗涤板和回收板置于37 °C、6% CO₂的培养箱中2, 5% O₂2 至少 4 小时。
    5. 将一瓶扩展培养基的第一步培养液（IVC1）在4 °C或室温下解冻。
    6. 准备一个含有500 μL IVC1且无油覆盖的洗涤皿。将约4 mL IVC1分装至一个5 mL螺口管中。
    7. 将IVC1洗涤皿和装有IVC1的小螺帽管在37 °C、6% CO₂条件下预平衡2, 和大气中的 O₂2 至少 4 小时。
  2. 在无菌超净工作台中，于胚胎复温前一天制备延长培养板。
    1. 将人血清中的纤连蛋白用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至 30 μg/mL。每个胚胎所需的包被液为 250 μL，浓度为 30 μg/mL 纤连蛋白。
    2. 在超净台内打开8孔板盖玻片包装，注意不要触碰孔壁。轻柔地将250 μL浓度为30 μg/mL的纤连蛋白溶液加入每个孔中。
    3. 将盖玻片放回腔室并置于 4 °C 环境中孵育 20–24 小时。
  3. 在胚胎复温当天早晨准备延长培养板。
    1. 取出带有纤连蛋白的带孔盖玻片，放入超净工作台中。用1 mL移液器吸除纤连蛋白混合液，并弃入废液容器中。
    2. 从小的5 mL旋盖管中取出已预热并平衡的IVC1培养基。
    3. 将300 μL平衡后的IVC1加入每孔中。注意避免液体接触盖子，以免增加污染风险。
    4. 将带腔室的盖玻片连同IVC1放回培养箱，在37 °C、6% CO₂条件下孵育2, 和大气中的 O₂2 直至第4步去除透明带。

2. 复温玻璃化冷冻的D5人类胚胎

注意：其他生产商可能根据其自身的玻璃化冷冻技术采用略有不同的操作流程。若适用，请参阅生产商提供的使用说明。

  1. 将 3.0 mL 复苏液（TS）置于 35 mm 培养皿中，预热至 37 °C。将 300 μL 稀释液（DS）以及 6 孔板中的两个含 300 μL 洗涤液（WS）的孔恢复至室温。
  2. 使用镊子小心移除冷冻装置的保护套管，同时确保玻璃化冷冻胚胎始终浸没于液氮中。
  3. 迅速将冷冻装置从液氮中取出，并将其尖端浸入 37 °C 的复苏液（TS）中。启动计时器计时 1 分钟，保持冷冻装置完全浸没，直至胚胎脱离并落入复苏液中。
    注意：每次仅复温一个胚胎，以便追踪胚胎身份信息，这些信息可能与后续分析中的患者人口统计学数据相关。
  4. 在复苏液（TS）中孵育的 1 分钟期间，小心取出冷冻装置，轻柔拾取胚胎并将其转移至复苏液培养皿的对侧。
    注意：若同时培养多个胚胎，务必保持各胚胎彼此分离，以确保其身份信息准确无误。
  5. 1 分钟后，用移液器吸取少量复苏液（TS）（约 2 μL）轻柔拾取胚胎，并将其转移至含 300 μL 稀释液（DS）的孔底部，同时用移液器中的少量 TS 在胚胎上方覆盖一层薄液。设定计时器为 3 分钟，并将 6 孔板置于室温台面上。
  6. 3 分钟后，用少量稀释液（DS）（约 2 μL）拾取胚胎，并将其转移至下一个含 300 μL 洗涤液（WS）的孔底部。再次轻柔地将少量 DS 从移液器中覆盖于胚胎上方。设定计时器为 5 分钟，并将 6 孔板放回室温台面。
  7. 5 分钟后，用极小体积的洗涤液（WS）拾取胚胎，并将其转移至最后一个含 300 μL WS 的孔顶部。胚胎将缓慢下沉并通过洗涤液沉降至孔底。将移液器中残留的 WS 排入一个空孔中。
  8. 用最小体积拾取胚胎，并再次将其转移至同一 300 μL WS 孔的顶部。胚胎将再次缓慢沉降至孔底。设定计时器为 1 分钟，并将 6 孔板放回室温台面。

3. 复温胚胎的回收

  1. 依次将已预热的胚胎转移至中心凹孔的组织培养皿中，皿内含有500 µL已平衡的BM培养基，其中添加10% v/v SPS，并覆盖500 µL已平衡的胚胎培养级油。
  2. 通过吸取每个胚胎并在培养皿的不同区域移动，同时在移动间隙吹出旧培养基，以洗涤胚胎。随后吸取胚胎并将其转移至单独的20 µL培养液滴中，该液滴为含10% v/v SPS的已平衡BM培养基，并置于油下。
  3. 将预热的胚胎置于37 °C、6% CO2、5% O2的培养箱中恢复培养2小时。

4. 透明带去除

  1. 经过2小时恢复后，评估胚胎的重新扩张情况，并对每个胚胎拍照。
  2. 将胚胎逐个转移至含有5%（v/v）胎牛血清（FCS）的500 µL MOPS缓冲操作培养基中，用于后续酸性Tyrode's溶液处理。
  3. 将一个胚胎迅速通过300 μL预温的酸性Tyrode's溶液，同时在显微镜下持续观察。透明带将开始出现溶解现象，此过程约需5秒。
  4. 立即将透明带正在溶解的胚胎转移至300 μL预温的MOPS缓冲培养基中，以中和酸性Tyrode's溶液。
  5. 用最小体积的MOPS缓冲培养基将胚胎转移至中心井组织培养皿中，该培养皿含有500 µL已平衡的BM培养基和10% v/v SPS，并覆盖500 µL已平衡的胚胎培养级油，用于洗涤。
  6. 将胚胎返回至步骤3.2中的20 μL恢复液滴中。
    注意：在去除透明带后通过肉眼检查，若发现仍有残留透明带的胚胎，可根据需要重复步骤4.2–4.6，进一步使用酸性Tyrode's溶液处理。应尽量减少胚胎对Tyrode's溶液的暴露时间。

5. 囊胚延长培养

  1. 将胚胎逐个从步骤1.1.6中已平衡的IVC1培养基转移至清洗皿中，再小心地将一个胚胎转移至腔室盖玻片的一个孔中，使用已平衡的IVC1培养基，并保持对胚胎的识别。
    注意：此步骤应尽快完成，以尽量减少培养基蒸发。
  2. 将腔室盖玻片放回设定为37 °C、6% CO2、大气O2的培养箱中培养2天。
    注意：请确保提前4小时在37 °C、6% CO2、大气O2条件下解冻并平衡用于换液的培养基。
  3. 在出胚第2天（受精后第7天），在显微镜下仔细检查胚胎的贴附情况，并进行培养基更换。
    1. 在更换培养基前，记录哪些胚胎已贴壁。轻轻敲击培养板，在显微镜下观察胚胎是否已牢固贴附于板上。
    2. 打开盖子，小心移除150 μL IVC1培养基并弃去，注意不要扰动已贴壁的胚胎。如果胚胎尚未贴壁，则不要更换培养基，因为IVC1中的血清有助于胚胎贴附。
    3. 用移液器缓慢向每个孔中加入150 μL已平衡的延长培养培养基IVC2，然后盖上腔室盖玻片的盖子。
      注意：应尽量减少打开腔室盖玻片盖子的时间，以避免培养基蒸发。
  4. 小心地将腔室盖玻片放回培养箱，避免培养基溅到盖子上。在延长培养期间每天重复进行培养基更换和贴附情况检查，直至胚胎准备好用于固定或单细胞消化。

6. 可选的用尽培养基收集

  1. 可选：在第7天或之后任何一天更换培养基时收集用过的培养基。在步骤5.3.2中，不要丢弃培养基，而是将移除的150 μL IVC1迅速冷冻，放入无菌低吸附的0.5 mL离心管中，以备后续分析。

7. 免疫荧光的可选固定步骤

  1. 使用 200 μL 移液器，用 PBS 进行 3 次 ½ 培养基更换，清洗胚胎，以去除任何细胞外碎片。洗去多余的碎片和蛋白质有助于提高成像清晰度，并减少免疫荧光图像中的背景信号。
  2. 移除所有培养基，缓慢向孔中加入 200 μL 含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS。胚胎容易附着在液体表面。在完全移除液体前，使用 200 μL 含 4% PFA 的溶液进行多次 150 μL 清洗，有助于最大限度减少对胚胎的损伤。
  3. 将胚胎在 4% PFA 中孵育 20 分钟以完成固定。
  4. 用 200 μL 新鲜 PBS 中含 0.1% v/v 吐温-20（polysorbate 20）的溶液，每次 10 分钟，清洗胚胎 3 次。
  5. 固定后的胚胎可保存在含 0.1% v/v 吐温-20 的 PBS 中，置于 4 °C，待进行免疫荧光实验时使用。

8. 使用胰蛋白酶进行单细胞消化

注意：单细胞消化使用新鲜（未固定）胚胎。

  1. 用 200 μL PBS 将胚胎洗涤一次，并向每个孔中加入 200 μL 胰蛋白酶溶液。将带孔盖玻片放回培养箱中孵育 5 分钟。
  2. 从培养箱中取出带孔盖玻片，在体视显微镜下观察胚胎。胚胎边缘的细胞将开始回缩，而磁导向细菌（MTB）应仍附着在培养板上，远离胚胎的位置。
  3. 使用小型移液器或精细拉制的口吸管，在解离整个胚胎之前吸取单个 MTB。跳至步骤 9.1 以保存 MTB，然后在完成步骤 9.3 后返回步骤 8.4。
  4. 使用手持显微操作移液器或口吸管，通过反复吹打轻柔地解离胚胎。
  5. 细胞将开始从整个胚胎中分离。继续使用更小直径的移液器吸头或口吸管轻柔且反复地吹打胚胎，直至胚胎在胰蛋白酶中总孵育时间达到 10 分钟。

9. 单细胞挑选与样品收集

  1. 使用极少量的胰蛋白酶，小心地将解离的细胞通过三滴20 μL含0.1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的PBS，在胚胎培养油下进行洗涤，注意避免丢失任何细胞。
  2. 洗涤细胞后，用拉制精细的玻璃移液管挑选一个单细胞，并小心地将该单细胞连同极少量PBS+0.1% PVP移入无菌的0.2 mL低吸附离心管中。
  3. 将单细胞在液氮（LN2）中速冻，并于-80 °C保存以备后续使用。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

健康的胚胎在延长培养过程中表现出持续增殖（图2B）。异常胚胎则从其外缘开始回缩并逐渐解体（图2C）。根据我们的经验，约75%的胚胎在培养48小时时已贴附于纤连蛋白包被培养皿的底部，至72小时时贴附率上升至约90%。胚胎贴附的成功率在很大程度上受囊胚初始质量的影响。若胚胎在72小时时仍未贴附，则很可能无法存活。

受精后第8天（延长培养的第3天），胚胎中的大多数细胞均为表达滋养层标志物GATA3的细胞滋养层细胞（CTB）（图3A）。细胞滋养层细胞已在胚胎周边开始分化为多核的合体滋养层细胞（STB）（图2B，左图，虚线所示）。这些合体滋养层细胞呈片状结构，并对人绒毛膜促性腺激素β亚单位（hCGB）呈阳性染色（图3A，中图）。在D8至D10期间，胚胎迅速生长，提示此阶段细胞滋养层细胞快速增殖。到...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

建立人类胚胎植入后培养的实验方案，使科学家能够探索发育过程中此前未被研究过的关键时期8,9。在此，我们采用延时培养系统对人类胚胎进行体外培养，并在绒毛胎盘形成之前研究早期滋养层细胞的分化过程。本文所述方法使我们能够获取不同的滋养层（TB）亚群细胞，用于后续的单细胞分析。本研究为科学界深入了解人类发育这一关键而神秘的阶段提供了契机，并可能为流产或子痫前期等胎盘相关疾病的治疗开辟新的途径，同时为人类早期发育机制提供新的见解。

本方案要求在胚胎复温、透明带去除和铺板过程中熟练快速地操作胚胎，以尽量减少胚胎在长期培养前受到的应激。在换液过程中尽量缩短暴露时间，以减少培养基蒸发，从而避免培养基渗透压升高，这是至关重要的。在更换培养基和移动培养皿时，注意采用规范的无菌操作技术，有助于最大限度地降低污染风险。当胚胎贴壁后，使用时应固定培养皿，以尽量减少机械扰动，这一点也十分重要。受到应激的胚胎会开始回缩其合胞体突起，并启动凋亡。此外，必须避免培养基的弯月面接触胚胎表面，同时尽量减...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们谨向科罗拉多生殖医学中心（CCRM）众多慷慨捐赠胚胎用于研究的患者表示感谢。同时，我们还要感谢Karen Maruniak以及CCRM临床实验室在hCG样本处理方面的协助，感谢Sue McCormick及其CCRM临床IVF胚胎学团队在胚胎收集、保存、追踪和捐赠方面提供的帮助。本研究由CCRM提供内部资金支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NORM JECT 鲁尔锁式无菌注射器VWR53548-019每包 100 支
3130 或 3110 Forma Series II 水套式 CO2 培养箱Thermo Fisher Scientific13-998-078
35 mm Corning Primaria 组织培养皿VWR62406-038每箱 500 个
5 mL 带卡扣盖离心管VWR60819-295每包 25 个
60 mm Corning Primaria 组织培养皿VWR25382-687每箱 200 个
6 孔板Agtech Inc.D18每包 1、10 或 50 个
酸性 Tyrode 溶液Millipore SigmaT1788100 mL
Biotix 1250 µL 移液器吸头VWR76322-156每包 960 个
Blast，囊胚培养基Origio8306001010 mL
稀释液KitazatoVT8021 × 4 mL
一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德移液管Thermo Fisher Scientific1367820D5.75 英寸（146 mm）；每箱 720 支
杜氏磷酸盐缓冲液Millipore SigmaD8537
胚胎培养石蜡油 OvOilVitrolife10029100 mL
Eppendorf PCR 管 0.2 mLVWR47730-598每包 1,000 个
Eppendorf PCR 管 0.5 mLVWR89130-980每箱 500 个
人血浆来源纤连蛋白，液体，0.1% 溶液Millipore SigmaF08951 mg
Gilson 1 mL 移液器Thermo Fisher ScientificF123602G1 个移液器 200–1000 µL
Gilson 20 µL 移液器Thermo Fisher ScientificF123602G1 个移液器 2–20 µL
Gilson 200 µL 移液器Thermo Fisher ScientificF123602G1 个移液器 50–200 µL
G-MOPS 操作培养基Vitrolife10129125 mL
操作培养基Origio8310006060 mL
Ibidi 8 孔腔室盖玻片Ibidi80826每盒 15 片
IVC1/IVC2Cell Guidance SystemsM11-25/ M12-25每份 5 mL，共 5 份
K System T47 加热板Cooper Surgical23054
MilliporeSigma Millex 带 Durapore PVDF 膜无菌注射式滤器Fisher ScientificSLGVR33RS每包 50 个
吹嘴IVF StoreMP-001-Y100 个
Oosafe 中心井培养皿OosafeOOPW-CW05-1每箱 500 个
Quinn's Advantage SPSOrigioART-301012 × 12 mL
吹嘴用橡胶乳胶管IVF StoreIVFS-NRL-B-55 英尺
体视显微镜NikonSMZ1270
剥离吸头Cooper SurgicalMXL3-275每包 20 个，275 µm
解冻液KitazatoVT8022 × 4 mL
Stripper 微量移液器Cooper SurgicalMXL3-STR
TrypLE Express 酶（1X），无酚红Thermo Fisher Scientific126040131 × 100 mL
Tween20Millipore SigmaP1379-25ML25 mL 瓶装
VWR 1–20 µL 移液器吸头VWR76322-134每包 960 个
VWR 1–200 µL 移液器吸头VWR89174-526每包 960 个
洗涤液KitazatoVT8021 × 4 mL

参考文献

  1. Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
  2. Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
  3. Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
  4. Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
  5. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  6. O'Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
  7. O'Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
  8. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
  9. Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
  10. Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
  11. Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187(2019).
  12. West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
  13. Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
  14. Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
  15. Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
  16. Carnegie Institution of Washington. Contributions to embryology. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1915).
  17. Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
  18. Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

长期培养滋养层细胞分化细胞滋养层细胞合体滋养层细胞迁移型滋养层细胞酶消化单细胞RNA测序
单细胞收集围植入期人类胚胎中的滋养层细胞
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。