本文介绍了一种方法，用于解冻玻璃化保存的人类囊胚，将其在体外培养至着床时期，消化为单细胞，并收集早期滋养层细胞以供进一步研究。
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本文内容
摘要
摘要
人类着床是指胚泡与子宫表面上皮细胞相互靠近并黏附，随后侵入母体蜕膜的过程，这一关键但神秘的生物学事件由于技术和伦理限制，历史上一直难以研究。着床过程始于滋养外胚层发育为早期滋养层细胞，并进一步分化为不同的滋养层亚群。早期滋养层细胞的异常分化可能导致着床失败、胎盘病理、胎儿畸形以及流产。近年来，已有方法被开发出来，可在无母体组织的情况下将人类胚胎体外培养至受精后第13天，这一时间段涵盖了人类着床期。这使得研究人员能够在排除母体干扰并避免体内研究早期胚胎分化事件固有障碍的前提下，探索人类着床过程，并重现这一关键时期滋养层分化的动态变化。为了在着床期间对不同滋养层亚群进行表征，我们采用了现有的二维（2D）延时培养方法，并建立了一种通过酶消化分离不同类型滋养层细胞以用于后续检测的实验流程。在二维条件下培养的胚胎形态相对扁平，可能在模拟体内三维（3D）胚胎结构方面存在不足。然而，延时培养过程中观察到的形态学特征及基因表达变化表明，滋养层分化过程受影响较小。包括细胞滋养层、合体滋养层和迁移性滋养层在内的不同滋养层亚群，可根据其大小、位置和出现时间加以区分，并用于进一步的表征或实验。对这些早期滋养层细胞的研究可能有助于理解人类着床机制、治疗常见胎盘疾病，并降低妊娠丢失的发生率。
引言
人类着床过程及早期胎盘的形成历来难以研究，很大程度上仍不明确，因为在此阶段妊娠尚无法临床检测，人类组织样本无法获取。动物模型也不足以替代，因为人类胎盘形成具有其他真兽类哺乳动物所不具备的独特特征。例如，人类胎盘会深入侵入蜕膜，部分滋养层细胞可到达子宫肌层的内三分之一区域，同时另一些细胞则重塑子宫螺旋动脉。即便是与我们亲缘关系最近的非人灵长类动物，在胎盘形态以及滋养层细胞与母体蜕膜组织相互作用方面也存在差异1,2,3。在20世纪80年代之前，体外获取着床前人类胚胎是不可能的；直到临床人类体外受精（IVF）成为治疗不孕症的常规手段后，才得以实现4。如今，人类囊胚可在体外培养，用于筛选更具活力的胚胎进行移植，并实现安全的遗传学检测。随着胚胎培养技术的进步以及体外受精的广泛应用，产生了大量患者治疗周期结束后剩余的囊胚。在获得患者知情同意、通过机构审查委员会（IRB）批准并符合特定限制条件的前提下，这些囊胚可用于科学研究。它们已成为极为宝贵的研究资源，曾被用于建立人类胚胎干细胞系5，研究内细胞团向胚胎干细胞转变的过程6,7，以及最近成功地将人类囊....
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方案
所有人类胚胎均已获得捐赠者同意，可用于科学研究。扩展人类胚胎培养的方案已获得西方机构审查委员会（研究编号：1179872）批准，并遵循国际指南。任何对人类胚胎的使用，均须由采用本方案的研究机构相关的适当伦理与管理机构进行审查。
1. 准备
- 在胚胎复苏前一天，于无菌超净工作台中配制培养基并制备复苏培养板。
- 准备2 mL含10%（v/v）血清蛋白替代物（SPS）的囊胚培养基（BM）。
注意： 囊胚培养基可能含有或不含添加的蛋白质。本实验所用培养基需额外添加10%指定的白蛋白。请参照生产商说明，了解该添加成分的具体要求。所有培养基在平衡前均应使用连接无菌注射器的无菌0.22 μM滤器进行过滤。 - 在两个中心井器官培养洗涤皿中各加入500 μL含10%（v/v）SPS的BM，并覆盖500 μL胚胎培养级油。
- 在60 mm组织培养皿中，加入8 mL胚胎培养油，然后在培养皿底部固定含有10%（v/v）SPS的20 μL BM液滴。每个复苏的胚胎对应一个液滴。
注意：可根据需要制备更多的培养基、液滴和洗涤皿。也可在加入油层之前将液滴添加至培养皿中。在油层下固定液滴有助于减少蒸发以及由此引起的渗透压变化。 - 用10% v/v SPS平衡BM，并将洗涤板和回收板置于37 °C、6% CO₂的培养箱中2, 5% O₂
- 准备2 mL含10%（v/v）血清蛋白替代物（SPS）的囊胚培养基（BM）。
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结果
健康的胚胎在延长培养过程中表现出持续增殖（图2B）。异常胚胎则从其外缘开始回缩并逐渐解体（图2C）。根据我们的经验，约75%的胚胎在培养48小时时已贴附于纤连蛋白包被培养皿的底部，至72小时时贴附率上升至约90%。胚胎贴附的成功率在很大程度上受囊胚初始质量的影响。若胚胎在72小时时仍未贴附，则很可能无法存活。
受精后第8天（延长培养的第3天），胚胎中的大多数细胞均为表达滋养层标志物GATA3的细胞滋养层细胞（CTB）（图3A）。细胞滋养层细胞已在胚胎周边开始分化为多核的合体滋养层细胞（STB）（图2B，左图，虚线所示）。这些合体滋养层细胞呈片状结构，并对人绒毛膜促性腺激素β亚单位（hCGB）呈阳性染色（图3A，中图）。在D8至D10期间，胚胎迅速生长，提示此阶段细胞滋养层细胞快速增殖。到.......
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讨论
建立人类胚胎植入后培养的实验方案，使科学家能够探索发育过程中此前未被研究过的关键时期8,9。在此，我们采用延时培养系统对人类胚胎进行体外培养，并在绒毛胎盘形成之前研究早期滋养层细胞的分化过程。本文所述方法使我们能够获取不同的滋养层（TB）亚群细胞，用于后续的单细胞分析。本研究为科学界深入了解人类发育这一关键而神秘的阶段提供了契机，并可能为流产或子痫前期等胎盘相关疾病的治疗开辟新的途径，同时为人类早期发育机制提供新的见解。
本方案要求在胚胎复温、透明带去除和铺板过程中熟练快速地操作胚胎，以尽量减少胚胎在长期培养前受到的应激。在换液过程中尽量缩短暴露时间，以减少培养基蒸发，从而避免培养基渗透压升高，这是至关重要的。在更换培养基和移动培养皿时，注意采用规范的无菌操作技术，有助于最大限度地降低污染风险。当胚胎贴壁后，使用时应固定培养皿，以尽量减少机械扰动，这一点也十分重要。受到应激的胚胎会开始回缩其合胞体突起，并启动凋亡。此外，必须避免培养基的弯月面接触胚胎表面，同时尽量减.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们谨向科罗拉多生殖医学中心（CCRM）众多慷慨捐赠胚胎用于研究的患者表示感谢。同时，我们还要感谢Karen Maruniak以及CCRM临床实验室在hCG样本处理方面的协助，感谢Sue McCormick及其CCRM临床IVF胚胎学团队在胚胎收集、保存、追踪和捐赠方面提供的帮助。本研究由CCRM提供内部资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NORM JECT 鲁尔锁式无菌注射器 | VWR | 53548-019 | 每包 100 支 |
| 3130 或 3110 Forma Series II 水套式 CO2 培养箱 | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria 组织培养皿 | VWR | 62406-038 | 每箱 500 个 |
| 5 mL 带卡扣盖离心管 | VWR | 60819-295 | 每包 25 个 |
| 60 mm Corning Primaria 组织培养皿 | VWR | 25382-687 | 每箱 200 个 |
| 6 孔板 | Agtech Inc. | D18 | 每包 1、10 或 50 个 |
| 酸性 Tyrode 溶液 | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL 移液器吸头 | VWR | 76322-156 | 每包 960 个 |
| Blast，囊胚培养基 | Origio | 83060010 | 10 mL |
| 稀释液 | Kitazato | VT802 | 1 × 4 mL |
| 一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德移液管 | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 英寸（146 mm）；每箱 720 支 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Millipore Sigma | D8537 | |
| 胚胎培养石蜡油 OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR 管 0.2 mL | VWR | 47730-598 | 每包 1,000 个 |
| Eppendorf PCR 管 0.5 mL | VWR | 89130-980 | 每箱 500 个 |
| 人血浆来源纤连蛋白，液体，0.1% 溶液 | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL 移液器 | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 个移液器 200–1000 µL |
| Gilson 20 µL 移液器 | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 个移液器 2–20 µL |
| Gilson 200 µL 移液器 | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 个移液器 50–200 µL |
| G-MOPS 操作培养基 | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| 操作培养基 | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 孔腔室盖玻片 | Ibidi | 80826 | 每盒 15 片 |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 每份 5 mL，共 5 份 |
| K System T47 加热板 | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex 带 Durapore PVDF 膜无菌注射式滤器 | Fisher Scientific | SLGVR33RS | 每包 50 个 |
| 吹嘴 | IVF Store | MP-001-Y | 100 个 |
| Oosafe 中心井培养皿 | Oosafe | OOPW-CW05-1 | 每箱 500 个 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12 × 12 mL |
| 吹嘴用橡胶乳胶管 | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 英尺 |
| 体视显微镜 | Nikon | SMZ1270 | |
| 剥离吸头 | Cooper Surgical | MXL3-275 | 每包 20 个，275 µm |
| 解冻液 | Kitazato | VT802 | 2 × 4 mL |
| Stripper 微量移液器 | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express 酶（1X），无酚红 | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 × 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL 瓶装 |
| VWR 1–20 µL 移液器吸头 | VWR | 76322-134 | 每包 960 个 |
| VWR 1–200 µL 移液器吸头 | VWR | 89174-526 | 每包 960 个 |
| 洗涤液 | Kitazato | VT802 | 1 × 4 mL |
参考文献
- Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnen....
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