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水生甲虫中RNA干扰作为在特定发育时间点操控基因表达的有力工具

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DOI：

10.3791/61477

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2020年5月29日

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1Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, 2Department of Biology, Miami University, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute

本文内容

摘要

RNA干扰是一种广泛应用且强大的技术，可用于在特定发育阶段调控基因表达。本文中，我们描述了在水生潜水甲虫Thermonectus marmoratus中实施该技术所需的各个步骤，从基因序列的获取到影响结构或行为的基因敲低。

摘要

RNA干扰（RNAi）是一种强大的技术，可通过降解mRNA实现对基因表达的靶向抑制。该技术适用于多种生物，在物种丰富的鞘翅目（甲虫）中效率尤为显著。本文总结了在新物种中建立该技术所需的步骤，并以水生龙虱Thermonectus marmoratus的不同发育阶段为例，展示其具体应用。目标基因序列可通过转录组测序并比对近缘物种的已知基因组数据，或通过从头组装的方式经济高效地获得。候选基因的克隆采用特定的克隆载体（pCR4-TOPO质粒），该载体允许利用单一通用引物合成任意基因的双链RNA（dsRNA）。合成的dsRNA可注射至胚胎以研究早期发育过程，或注射至幼虫以研究后期发育过程。我们进一步展示了如何通过琼脂糖固定法将RNAi试剂注射到水生幼虫体内。为演示该技术的应用，我们提供了多个RNAi实验示例，成功实现了特定基因的敲低并获得了可预测的表型。具体而言，对鞣化基因laccase2进行RNAi处理会导致幼虫和成虫表皮颜色变浅；对眼色素基因white进行RNAi处理则导致眼管色素减少或缺失。此外，关键晶状体蛋白基因的敲低会导致幼虫出现光学缺陷，并降低其捕食能力。综上所述，这些结果充分体现了RNAi技术在仅具备转录组数据库的生物中，用于研究形态发育模式和行为特征的强大潜力。

引言

特定基因如何促进多样表型的演化是生物学中一个引人入胜的研究课题。在过去的几十年中，科学家已在少数模式生物（如线虫Caenorhabditis elegans、果蝇Drosophila melanogaster和家鼠Mus musculus）的发育过程遗传基础解析方面取得了显著进展1。近年来，随着CRISPR/Cas9等高效基因编辑技术的出现2，研究者已能够对非模式生物的遗传密码进行改造（例如见3,4）。因此，针对此前难以应用分子技术的多种生物，遗传学研究迎来了快速增长。考虑到动物界极其丰富的多样性，许多有趣的性状或性状变异仅存在于特定物种中，这一进展为进化发育生物学（“evo-devo”）相关研究带来了前所未有的机遇。然而，目前适用于非模式生物的基因组编辑技术在可应用的发育时间点方面仍相对受限，使得揭示特定基因在性状形成过程中所起作用的时间动态特性变得困难。此外，转基因技术通常仅限于对生存非必需的基因（即敲除后不会导致致死的基因）。因此，尽管基因编辑技术正逐渐普及，但仍亟需发展适用于多种生物在特定发育阶段操作、并能实现部分基因表达抑制（而非完全功能缺失）的有效技术。本文重点介绍RNA干扰（RNAi）技术——一种虽已有一定历史但依然强大的基因敲低方法5，其作为基因编辑的协同手段具有重要价值。具体而言，我们建立了一套适用于水生龙虱的RNAi操作流程，作为该技术实施的范例，涵盖从获取必要分子序列到成功将双链RNA（dsRNA）注射至卵和幼虫的全过程。

基于RNA干扰（RNAi）的基因敲低技术利用了生物体的一种天然防御机制，即双链RNA（dsRNA）分子可介导对外来核酸序列（如病毒和转座子）的沉默作用6。简而言之，dsRNA被细胞摄取后，由Dicer酶将其切割为20–25个核苷酸长度的小片段。这些片段随后激活RNA诱导的沉默复合体（RISC）的形成，该复合体通过引导链与靶标mRNA上的特定位点结合，从而抑制其表达。此过程最终导致mRNA降解，进而阻断mRNA向相应蛋白质的翻译6。本文所介绍的基于RNAi的基因敲低技术依赖于向生物体内注射dsRNA。该技术最初在C. elegans7和D. melanogaster8等动物模型中建立，现已成为非模式生物中一种强大的功能遗传学工具9,10。由于RNAi在某些昆虫中具有高效性，该技术甚至可应用于害虫防治11。

作为一种研究工具，RNAi已被用于研究关键的分子发育通路在非传统昆虫模型中的功能。例如，在赤拟谷盗（Tribolium castaneum）中应用RNAi，对于揭示高度保守基因如何影响该甲虫特定性状起到了关键作用，典型案例如特异性翅形12,13,14和眼发育15,16的研究。在T. castaneum中所采用的操作技术已有详尽描述17，其核心在于能够将相对干燥的卵和幼虫固定在粘性表面上。然而，这种固定方法不适用于水生生物湿润的发育阶段，例如日光潜水甲虫（Thermonectus marmoratus）。与许多非传统模式生物一样，该物种尚无注释完整的基因组。在缺乏基因组信息的情况下，对任何生物进行基因表达操控的一个合理且成本较低的初步步骤是：构建转录组，并基于与亲缘关系较近但更为成熟的模式生物（在此主要是赤拟谷盗（Tribolium，鞘翅目）和果蝇（Drosophila）基因）的序列相似性，鉴定目标基因的潜在核苷酸序列。

在此，为了展示RNA干扰（RNAi）技术如何应用于水生生物，我们首先讨论用于RNA提取以及转录组生成与组装的实验方案和软件，这些方法可用于鉴定特定的目标基因序列。随后，我们总结合成基因特异性双链RNA（dsRNA）所需的各个步骤。接下来，我们说明如何在水生环境中对卵进行显微注射，并展示培养发育中胚胎的孵育方案。此外，我们展示了如何利用琼脂糖凝胶在注射过程中完全固定幼虫，该技术在多种实验操作中均具有普遍适用性，可推广至多种节肢动物。为了说明RNAi技术可应用于不同发育阶段，我们提供了一个实例，即在胚胎中沉默眼色素基因white。另外，我们描述了一个实例，其中在二龄幼虫期（以影响三龄幼虫）和三龄幼虫期（以影响成虫）均对鞣化基因laccase2(lac2)进行了沉默。最后，我们证明，注射较低浓度的dsRNA可导致部分基因表达下调，表明该技术也可用于那些已知功能缺失会导致致死效应的基因研究。

方案

1. RNA 提取与从头转录组组装

  1. 使用专为脂质含量高的组织设计的RNA提取试剂盒（参见材料表），从三龄晚期龙虱幼虫的视小管和成虫中提取总RNA。提取T. marmoratus的总RNA，并按照先前描述的方法进行测序18。
  2. 从头转录组组装
    注意：为进行从头转录组组装，可使用多种生物信息学平台（参见材料表）。这些平台为商业产品，在某些情况下以基于Unix的命令行脚本形式存在。由于是进行从头组装，建议在两个不同平台上独立组装转录组，并比较结果，以排除假阳性或假阴性结果。
    1. 开始组装转录组时，将原始测序数据上传至相应的生物信息学平台。
      注意：这些文件通常为压缩格式，文件类型为FASTQSANGER.GZ。无需解压，因该格式可在下一步中直接使用。
    2. 使用Trimmomatic命令行工具对原始测序数据进行修剪，去除接头序列或低于默认阈值的短序列。对修剪后的原始数据进行解压，文件将变为FASTQ格式。将每个样本的FASTQ原始数据合并，获得可用于从头组装的文件。
    3. 使用能够进行从头转录组组装的任意命令行脚本，对合并后的原始测序数据进行从头组装。将组装完成的转录组保存为FASTA文件，其中包含一系列contig及其对应的序列。为提高组装的覆盖度，可合并并组装同一物种的多个转录组数据。
      注意：该过程可提高生成更准确contig的可能性，尤其在关注低拷贝数基因时尤为重要。
    4. 组装完成后，通过计算覆盖度评分评估转录组的完整性（覆盖度评估软件可免费获取，参见材料表）。
      注意：覆盖度评分>75%的转录组被视为良好。然而，该评分的相关性取决于转录组构建的目的。例如，若转录组用于鉴定低拷贝数基因，则覆盖度评分>85%更佳，因其代表更高的覆盖度。
    5. 使用基础局部比对搜索工具（BLAST；参见材料表）对从头组装的转录组进行注释。
      注意：本实验中，转录组主要比对至已知的Drosophila蛋白数据库和已知的甲虫蛋白数据库。注释结果列表可下载为电子表格文件，与其它生物蛋白序列具有相似性的contig或contigs可下载为FASTA文件。
    6. 确定目标蛋白对应的contig编号，并提取其核苷酸序列。使用BLAST分析目标注释核苷酸序列中是否存在蛋白特异的保守区域（如同源异型盒结构域）。检查具有相同注释的其他contig是否存在核苷酸序列重叠，以拼接获得基因特异的转录本序列。
      注意：并非所有基因都能找到具有序列重叠的contig，尤其是低拷贝数基因。
    7. 若需要获得基因的全长序列，应以序列相似性最高的contig为起点，采用cDNA末端快速扩增技术（如3′和5′ RACE19），鉴定完整成熟转录本的核苷酸序列。
    8. 对第二个平台获得的组装结果，按照步骤1.2.4–1.2.7进行注释。
      注意：理想情况下，目标蛋白的结果应相似；但不同平台之间的覆盖度可能存在一定程度的差异。
    9. 利用组装完成的转录组，按照第2节所述方法合成物种特异的dsRNA。

2. 克隆与基因特异性dsRNA合成

注意：针对赤拟谷盗（T. castaneum）的基因特异性克隆和双链RNA合成已在文献中有详细描述20,21,22。以下步骤为简要概述。

  1. 克隆、细菌转化与质粒测序
    1. 从该生物体中分离总RNA（如步骤1.1所述），并使用逆转录试剂盒合成互补DNA（cDNA）（参见 材料表）。从重叠群中鉴定出一段或两段长度为100–1000 bp、特异性针对目标基因的核苷酸序列。
      1. 设计引物对以扩增整个已确定的核苷酸片段，并通过聚合酶链式反应（PCR）扩增该序列。在反应结束时额外增加一个30分钟的步骤，以在扩增的DNA产物中生成3′端腺苷酸突出端。使用PCR纯化试剂盒纯化该产物（参见 材料表).
    2. 将纯化产物克隆至pCR4-TOPO质粒载体中（参见 材料表）按照克隆试剂盒提供的说明书进行操作。采用热激法将克隆的质粒转化至感受态细菌细胞中（菌株： E.coli DH10B)，按照试剂盒供应商提供的感受态细胞操作说明（参见 材料表，并筛选成功转化的细胞。
      注意：长有菌落的平板可用石蜡膜封裹以保持湿度，并在4 °C下保存长达一个月。
    3. 使用10 µL移液枪头挑取转化细胞的单菌落，接种于含氨苄青霉素（50 µg/mL）的LB（Lysogeny Broth）培养基中，在37 °C、200 rpm条件下于摇床培养箱中培养24 h。
      注意：对于长期保存，可将培养的细胞与100%甘油按1:1比例稀释，于-80 °C冻存，制成甘油菌种。
    4. 使用质粒小提试剂盒从该培养物中分离含有目的基因的质粒（参见 材料表). 将分离得到的质粒（小量提取物）在分光光度法测定产量后于 -20 °C 保存。具体操作为：测定样品在 260 nm、280 nm 和 230 nm 处的吸光度，计算 A260/A280 用于定量DNA，以及A260/A230 用于定量DNA纯度。
      注意：260/280 比值为 1.8 通常被视为纯度足够的 DNA，比值低于 1.5 表明存在残留提取试剂（如苯酚）。260/230 比值应大于或等于 260/280 比值，较低的比值表明存在残留试剂污染。得率通常为 100 至 500 ng/µL。
    5. 对分离的质粒小提产物进行测序，以确认基因特异性片段已成功插入质粒中，并位于5′ T7和3′ T3启动子区域之间；可使用通用的T7和T3测序引物完成此步骤22使用含有目的基因特异性序列的质粒小提物制备双链RNA。
  2. PCR扩增与体外双链RNA合成
    1. PCR扩增与产物纯化
      1. 设计在5’端带有T7启动子序列的质粒特异性或基因特异性引物（参见参考文献）22 有关详细信息，请参见）以扩增插入基因的线性片段。通过设置至少10个每份20 µL的反应体系来优化产量。
        注意：最终产物的两端各有一个20 bp的T7聚合酶结合位点。
      2. 使用PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物（参见 材料表），按照供应商提供的基于层析柱的洗脱方案进行操作。为提高得率，可用相同的洗脱液重复最后的洗脱步骤最多3次。通过分光光度法测定得率。
        注意：产量通常为 100 至 700 ng/µL。纯化后的产物可于 -20 °C 保存，直至后续使用。
    2. 体外dsRNA合成与纯化
      1. 使用基因特异性的PCR纯化产物，按照所选双链RNA合成试剂盒的说明书在体外合成dsRNA。如有必要，可延长孵育时间以增加dsRNA产量。
      2. 根据反应混合物的浑浊程度评估反应进程（双链RNA产物越多，浊度越高）。孵育结束后，通过DNase处理终止反应。向反应混合物中加入1 µL浓度为2 U/µL的DNase储备液即可。将该处理延长至1–2 h，以确保模板DNA得到充分降解。
      3. 使用纯化试剂盒或按照以下步骤纯化dsRNA。
        1. 将所得产物用115 µL无核酸酶水稀释，加入15 µL 3 M乙酸钠。向该反应混合物中加入2倍体积的预冷100%乙醇，在-20 °C下过夜沉淀双链RNA。
          注意：此时，样品可安全储存，不会影响最终得率。
        2. 在 0 °C 下以 9000 x g 离心沉淀物 20 分钟 g 弃去上清液。用预冷的70%乙醇洗涤沉淀物一次，于13000 × g离心15分钟。 g.
        3. 移除上清液，将沉淀在空气中干燥5–15分钟。用最多40 µL无核酸酶水重悬沉淀（可根据所获沉淀的大小调整体积），并按照2.1.4节所述方法通过分光光度法测定产量和纯度。
        4. 将纯化的dsRNA储存于-20 °C，以备后续使用。在目标发育阶段使用纯化的dsRNA进行注射。

3. 用于dsRNA注射的早期阶段T. marmoratus胚胎的收集与制备

  1. 准备用于培养T. marmoratus胚胎的琼脂糖平板。
    1. 首先，将20 mg低熔点琼脂糖粉末溶于100 mL经高压灭菌的蒸馏水中（2%琼脂糖），然后在微波炉中加热至溶液澄清。操作热溶液时需小心，因气泡可能导致溶液溢出。
    2. 将该溶液分装至小型培养皿中。为在琼脂糖表面形成凹槽（用于固定胚胎），在琼脂糖凝固前，将三根宽约1–2 mm的塑料管（如塑料移液管的吸头）放置于液态琼脂糖表面。
    3. 待琼脂糖完全凝固后，用钝头镊子小心移除这些塑料管。使用P1000微量移液器加入500 µL高压灭菌的蒸馏水，以覆盖琼脂糖上的凹槽。
  2. 使用细软的天然毛制画笔，从盛有高压灭菌蒸馏水的玻璃凹面皿中，采集来自甲虫产卵点的5–8小时龄的T. marmoratus胚胎。需频繁观察产卵点，以确保所获取的卵处于合适发育阶段。
  3. 在体视显微镜下使用精细解剖镊对胚胎进行去壳处理。操作时，通过调整光源角度，在显微镜（设定所需放大倍数）下观察卵壳结构，然后用尖头镊子从两侧夹住卵壳，将其撕开，并轻柔地将胚胎滑出。由于卵壳分为两层，需确保两层均被完全去除。
  4. 使用细软的天然毛制画笔，在体视显微镜下小心地将胚胎从玻璃凹面皿转移至琼脂糖平板的凹槽中。操作过程中需格外谨慎，因去壳后的胚胎极为脆弱。制备好的胚胎可用于dsRNA注射。
    注意：较略厚的一端为胚胎将来发育出头部的一侧。

4. 早期阶段T. marmoratus胚胎的dsRNA显微注射

  1. 为了向早期胚胎注射基因特异性的 dsRNA，使用显微注射针拉制仪制备显微注射针（参见材料表）。在体视显微镜下观察针尖，使用精细镊子折断针尖以形成锋利的边缘。理想情况下，应斜向折断针尖，使一侧保留更锐利的边缘，以便针头能够顺利进入胚胎并造成最小损伤。
  2. 将纯化的 dsRNA 储存液置于冰上解冻，加入 1 µL 的 10× 注射缓冲液，并用双蒸水补足至 10 µL，配制成注射溶液。通常，dsRNA 浓度为 1 µg/µL 即可满足注射需求，但可根据所获得动物表型的严重程度进行调整。
    注意：通过加入 10 µL 的 0.1 M 磷酸钠缓冲液（由 8.5 mL 的 1 M Na2HPO4 与 1.5 mL 的 1 M NaH2PO4 混合，并用 100 µL 的 0.5 M KCl 调节至 25 °C 时 pH 7.6）、100 µL 食用染料和 790 μL 双蒸水，配制 1 mL 的 10× 注射缓冲液22。
    1. 使用 P10 移液器将工作浓度的 dsRNA 溶液从针尾注入显微注射针。当溶液充满针尖后，将注射针连接至与显微注射系统相连的微针夹持器上，该系统采用压力喷射技术（参见材料表）。
  3. 打开显微注射系统及加压空气供应。通过显微注射系统上的微阀调节注射压力至 15 psi。使用时间调节旋钮调整注射持续时间（设置为“秒”模式）。
    1. 由于注射持续时间取决于所需注射体积，必要时应在每次注射前在显微注射系统上调整此参数。对早期阶段的 T. marmoratus 胚胎，使用 1–2 nL 的注射体积。
      注意：较大的注射体积往往会影响胚胎存活率。
  4. 为测量显微注射系统释放的注射液体积，可通过在空气中注射并观察针尖形成的液泡体积来校准注射针。对于 T. marmoratus 胚胎，最佳液泡大小为 100–200 µm。若在 15 psi 压力下、注射持续时间约为 3 秒时即可达到该液泡大小，则表明注射针质量良好。
  5. 在体视显微镜下对齐注射针与含有胚胎的琼脂糖板，使注射针以 45° 至 60° 的角度接近胚胎。
  6. 使用显微操作器，在体视显微镜下观察并缓慢移动微针。当针尖接触胚胎表面时，小心地向前推进针头，直至刺穿胚胎表面。切勿将针尖深入穿刺胚胎，以免影响胚胎存活。为减少实验变异性，应在胚胎中部进行注射。
  7. 当针头进入胚胎内部后，小心按下显微注射仪的注射按钮，将 dsRNA 注入胚胎。注射 1–2 nL dsRNA 后，缓慢将针头从胚胎中撤出，避免导致胚胎破裂。
    1. 以类似方式注射其余胚胎。若在操作过程中显微注射针发生堵塞，可通过提高注射压力和延长注射时间来疏通。由于注射缓冲液中含有食用染料，可通过观察注射部位是否出现着色斑点来肉眼识别成功注射的胚胎。
  8. 将含有已注射胚胎的培养皿小心放入湿度培养箱中。
    1. 构建此类培养箱时，可选用任何带盖的塑料盒，用 70% 乙醇灭菌后晾干，并在底部放置浸有高压灭菌水的纸巾以提供湿润环境。将该湿度培养箱置于适宜温度（本实验为 25 °C）及光照周期（14 小时光照、10 小时黑暗）的培养箱中。
  9. 让注射后的胚胎发育至一龄幼虫阶段，此过程需 4–5 天。每日使用体视显微镜监测胚胎发育进程，识别如图 2所示的形态学上可见的基因沉默表型。
  10. 使用高分辨率相机拍摄数字图像以记录发育进程。在培养期间每日清除死亡胚胎，并更换琼脂糖板上的水，以防止脱水以及微生物污染向其他存活胚胎扩散。
  11. 为 dsRNA 注射设置适当的对照，包括缓冲液注射、针对目标基因正义链合成的 dsRNA 注射，以及针对目标生物基因组中不存在序列合成的 dsRNA 注射。使用其他分子生物学方法验证 RNA 干扰（RNAi）的基因沉默效果22。

5. 准备用于注射dsRNA的T. marmoratus幼虫

注意：与早期胚胎不同，T. marmoratus 幼虫相对强健，可注射较大体积的溶液。例如，二龄幼虫最多可注射 2 µL 的 dsRNA 工作液，三龄幼虫至少可注射 3 µL，且对存活率无明显不良影响。注射 dsRNA 时，可通过将幼虫包埋在琼脂糖中以固定其位置，便于操作。

  1. 在收集幼虫之前，将2%琼脂糖融化并置于60–70 °C水浴中以保持液态。将融化的2%琼脂糖倒入小型培养皿中，冷却至凝固，制备固定用培养皿。使用钝头镊子在琼脂糖平板上为每只待注射的节肢动物制作一条浅槽（大小约为待包埋生物体的尺寸）。
  2. 在适当的发育阶段（即目标分析阶段的前一个阶段）收集幼龄幼虫。为此，小心地将含有幼虫的培养杯中的水吸除，并按以下步骤操作。
  3. 将幼虫置于冰上进行麻醉（小心地用镊子将幼虫从盛水容器中取出并轻柔地放置于冰上），直至幼虫无明显活动。使用钝头、柔软尖端的镊子小心地将幼虫从冰上提起，将其颈部和身体置于琼脂糖槽内，尾部则位于琼脂糖表面之上，避免覆盖，以便幼虫可通过尾部气门继续呼吸。
  4. 用一层仍处于液态但不烫手的厚琼脂糖覆盖幼虫。若不慎将尾部覆盖，需立即用镊子将尾部及其下方两个体节从琼脂糖中释放出来。待琼脂糖凝固后，即可对幼虫进行dsRNA注射。

6. 在T. marmoratus幼虫中进行dsRNA显微注射

  1. 准备并用所需量的基因特异性dsRNA工作溶液回填显微注射针（如步骤4.1–4.2所述）。将注射针连接至与手动控制显微注射器相连的针夹上。在安装针头前，将注射器活塞完全拉出，以避免在操作过程中因压力不足而中断注射。
  2. 调整固定好的幼虫位置，使其注射部位（位于第三和第四体节背侧之间）与显微注射针的进针轨迹对齐，并保持相对平缓的角度（几乎与载物台平行）。
    注意：将注射针和幼虫调整至此位置至关重要，因为这可使针尖以最小阻力穿刺幼虫组织，从而将损伤降至最低。
  3. 当注射针和幼虫定位完成后，通过体视显微镜观察，在显微操作器的控制下小心地将针尖插入幼虫体内。
  4. 当针尖穿透组织后，缓慢而谨慎地对注射器施加压力。通过显微镜下观察注射液（带颜色）在针内的流动情况，调节注射压力。
  5. 注射完成后，小心地将针头撤出。使用软镊子剥离琼脂糖，使幼虫脱离固定，并将其转移回盛有室温水的容器中，随后在25‒28 °C、光照周期为14小时光照和10小时黑暗的培养箱或培养室内继续培养发育。
  6. 按照步骤4.10中所述，进行适当的对照注射和基因敲低效果的定量分析。

结果

利用上述方案，我们在日光潜水甲虫T. marmoratus的不同发育阶段敲低了三个不同的基因，分别为white、laccase2（lac2）和Lens3（表1）。我们通过在胚胎发育的极早期注射dsRNA，在T. marmoratus中实施RNA干扰（图1A）。由于部分胚胎无法耐受该操作并发生坏死（图1B），需将其移除以保证其余胚胎的健康。此处以针对white基因的dsRNA注射为例进行说明。该基因在果蝇Drosophila中已被广泛研究，是参与眼色素前体摄取与储存的三种ATP结合盒（ABC）转运蛋白之一23。因此，其功能缺失会导致眼色素缺失，表现为白眼表型。我们的结果显示，在T. marmoratus胚胎中注射靶向同源white基因的dsRNA，可导致新孵化幼虫眼色素的缺失。野生型幼虫具有深色素的眼睛，而white基因的RNAi敲低则导致不同程度的眼色素减少，甚至完全消失。总体而言，在存活的胚胎中，有34%（n = 35）表现出至少一定程度的眼色变浅。图2A展示了对照个体与眼色略浅个体的对比。图2B展示了一个敲低程度更严重的个体，其复眼中较腹侧的眼（眼2–5）完全无色素，而背侧眼仍保留部分色素。这些差异凸显了敲低效率在不同区域的不均一性，可能与dsRNA在致密组织中渗透效率的差异有关。另一只个体则几乎在所有眼中均完全丧失色素（图2C）。

为了研究RNAi在幼虫阶段的作用效果 T. marmoratus，我们注射了靶向 tannic 基因的 dsRNA lac2 进入三龄幼虫前数天，将其从二龄幼虫阶段转移（图3）并评估了其对三龄幼虫表皮着色的影响。Lac2 是一种酚氧化酶，可通过氧化交联蛋白质使其不溶、变硬并加深颜色。在赤拟谷盗中进行基因敲低 T. castaneum 低剂量时可导致个体体色变浅，但高剂量则被认为具有致死性24. 图4 结果表明，该处理还导致阳光 diving beetle 幼虫体色变浅。具体而言，在本实验中，75%的存活注射幼虫（n = 12）色素沉着减少，而对照组为0%。 图 4A 显示一名色素脱失相对较轻的个体，而 图 4C 展示了一个头部的 T. marmoratus 幼虫表皮的深色几乎完全缺失。与对照组注射个体中仍清晰可见的典型中部深色斑纹相比，该斑纹的脱色现象尤为明显。图4B）。此外，观察到尾部气管出现变亮现象，如图所示 图 4D. 在以下情况下 lac2 将dsRNA注射至三龄幼虫，获得体型较轻的成虫个体（图5）。请注意，敲低甲虫的翅膀有些变形，可能是由于其异常柔软所致。

除了改变形态特征外，还可利用RNAi靶向影响行为的基因。为证明这一点，我们对一个关键的晶状体蛋白编码基因进行了RNAi。 Lens318，并将其注入二龄幼虫体内，以影响三龄幼虫眼睛的光学特性。此处观察到的晶状体变化可能是因为幼虫眼睛的 T. marmoratus 幼虫在此转变过程中发生显著的眼部生长，同时也伴随着晶状体的重大光学变化25本实验中RNAi基因敲低效率非常高。通过qPCR验证，成功率达到100%；在检测的13个个体中，有12个个体的基因表达水平降至对照个体的10%以下，剩余1个个体的表达水平为对照水平的17%（未发表观察结果）。在表型水平上，仅有部分个体表现出严重缺陷或丧失捕食能力，如图所示 图6 对于一个反复从极近距离接近猎物却始终超过目标的个体。

表1：白色、lac2和Lens3蛋白的引物序列及扩增子。 请点击此处下载该表格。

植物胚胎发育实验；培养皿结果，显示存活与死亡的胚胎样本。
图1：胚胎显微注射示意图。（A）去绒毛膜胚胎排列在琼脂糖平板上，使用充满dsRNA及含食用染料的注射缓冲液的显微注射针在其近中心位置进行注射。比例尺为500 μm。（B）一名表型更严重的基因敲低个体。注射后的胚胎置于湿度恒定的培养室中，并每日观察以记录表型并移除死亡个体（死亡个体变为棕色）。比例尺为5 mm。请点击此处查看该图的高清版本。

RNAi效应示意图；white基因表达，对照组与RNAi处理样本的显微镜分析。
图2：注射针对white基因的dsRNA后完全发育的胚胎示例。(A) 眼部色素减少的个体（左）与对照注射个体（右）的比较。E1–E6代表第1至第6只眼。(B) 具有更严重敲低表型的个体，说明有时眼簇中的某些眼受到敲低的影响比其他眼更严重。(C) 几乎完全丧失眼部色素的个体。比例尺为200 μm；B和C图采用相同的比例尺。 请点击此处查看该图的放大版本。

斑马鱼胚胎显微注射过程；染料注射过程；实验细节示意图。
图3：幼虫注射示意图。（A）多条幼虫通过包埋于2%琼脂糖中固定，尾部气孔暴露，不接触琼脂糖。（B）含有注射溶液的微电极置于合适位置，使其尖端可穿透两个体节之间的薄膜。（C）注射后，可见蓝色注射染料滞留在注射部位。比例尺为1 cm。请点击此处查看该图的放大版本。

RNAi对昆虫幼虫的影响；显微镜图像比较对照组与lac2沉默对生长和形态的影响。
图4：对二龄幼虫施加laccase2的RNAi，导致三龄幼虫体壁着色减少。（A）与注射对照的个体（上）相比，lac2 RNAi个体（下）表现出相对较轻的着色缺失。比例尺为5 mm。（B）对照个体的头部，显示头部中央典型的深色斑纹。（C）lac2基因较严重敲低，导致头部中央着色几乎完全消失。（D）与注射对照的个体（上）相比，lac2 RNAi个体（下）尾部主要体壁着色缺失。B‒D中的比例尺代表1 mm。请点击此处查看此图的高清版本。

RNAi 对昆虫表型的影响，Lac2 RNAi 处理组与对照组，基因表达实验。
图 5：对三龄幼虫施加 laccase2 的 RNAi 干扰，导致成虫体壁着色减弱。与对照组（右侧）相比，基因敲低个体（左侧）的鞘翅也极为柔软。比例尺为 5 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

RNAi行为分析，照片系列显示C. elegans的接近、超调和恢复行为。
图6：主要晶状体蛋白的敲低导致捕食能力缺陷。（A–C）三个实例显示，通过RNAi诱导产生视觉缺陷的星斑潜水甲虫幼虫无法捕获猎物（蚊子幼虫）。代表性静态图像选自典型捕食行为的视频记录。（D）正常对照幼虫成功捕获猎物。所有比例尺均为2 cm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

我们的目标是使这一系列方法能够广泛推广RNAi技术的应用，特别是因为该工具仍然是CRISPR/Cas9基因编辑技术的有力协同手段，其优势在于可应用于所研究生物的特定发育阶段。为展示这一优势，我们分别向胚胎和不同幼虫阶段注射了dsRNA。向卵中注射会影响胚胎发育（图2），向第二龄幼虫注射对第三龄幼虫阶段产生明显影响（图4 和 图6），而向第三龄幼虫注射则在成虫中表现出效应（图5）。尽管确切的时间需通过实验确定，但通常情况下，注射后数天内即可产生效应。该过程的成功与否可能受到dsRNA序列长度的影响。本文所展示的示例中，序列长度从略超过200 bp到超过800 bp不等。一般而言，为减少脱靶效应，优选100至600 bp之间的序列，但长度达1000 bp的序列也能获得良好效果22。关于RNAi的一个问题是该技术所能实现的基因沉默持续时间。由于各阶段的表型均为终末性，我们无法根据本文结果对此问题作出评价。然而，先前已有报道指出，RNAi效应通常持续时间相对较长，且较高浓度可导致更持久的基因沉默20。

该技术的一个局限性在于，其效果在不同生物体之间的表现存在差异，且目前似乎尚无直接方法可预先预测其应用效果。然而，研究发现该技术在多种不同的生物体中均能有效应用。在节肢动物中，这包括蛛形纲动物26，甲壳类动物27，以及多种昆虫，尤其在甲虫中成功率较高28一个更复杂的问题是，尽管施加了相同剂量的dsRNA，个体之间表型严重程度的差异仍经常出现。如图所示 图2B，个体内部甚至也可能出现变异。在我们针对不同基因的RNAi研究中 T. marmoratus 幼虫眼睛发育过程中，我们经常发现某些眼睛受到的影响比其他眼睛更严重。这一现象可能与眼簇组织相对致密有关，导致dsRNA更易到达其中部分单元。

为了成功开展RNAi实验，必须针对目标基因优化多个参数。例如，dsRNA的浓度以及目标基因的长度会显著影响实验结果20。另一个关键参数是注射操作的方式，因为该过程会显著影响存活率。对于胚胎，我们发现将注射针定位在胚胎中心区域时效果最佳。使用排列有序的载片，可在单次操作中完成100个或更多胚胎的注射。对于幼虫，关键是要将注射针插入体节之间的间隙。此类注射需要更多的dsRNA，且受限于幼虫的可获得性，我们通常每次仅对少量个体进行注射。所有注射操作均需注意防止空气进入生物体内。

在某些情况下，基因调控网络的反馈回路和遗传冗余可能会影响RNAi表型的外显率，即使基因敲低效果一致。我们对幼虫行为的观察似乎就属于这种情况，这些幼虫中一种主要晶状体蛋白Lens3的敲低效果非常成功18。尽管我们通过qPCR验证了这些敲低的高效性，但相关表型仍表现出显著变异。该结果凸显了对RNAi敲低效果进行适当定量的必要性（有关具体方法详见22）。如果对预期表型没有明确的先验假设，一种控制RNAi脱靶效应的有效方法是使用两段不重叠的dsRNA序列靶向同一基因，并评估其共同的表型结果。

与基因编辑技术不同，RNAi 也是研究致死基因的有力工具，有两种方法可以实现。例如，如果研究者关注某个基因的功能贡献，而已知该基因在发育早期功能丧失会导致死亡，则可以通过让动物正常发育，随后在发育后期（即成体阶段）利用 RNAi 沉默该基因，从而实现对该基因的功能性研究。另一种方法是，对于已知完全功能丧失会导致死亡的基因，可通过部分沉默的方式进行研究，这可以通过注射不同浓度的 dsRNA 来实现。我们的部分结果展示了 lac2 的沉默效果，已知当昆虫表皮变得过于柔软时，lac2 的功能缺失会导致死亡24。即使如 图5 所示的 lac2 RNAi 甲虫，在实验室以外的环境中也难以存活。另一个致死基因为 cut，其编码一种转录因子，在节肢动物多种器官系统的细胞命运决定中起关键作用，并且已被证实与果蝇视觉系统中胶质细胞的发育相关29。根据我们在 T. marmoratus 胚胎中进行 cut RNAi 的经验，我们能够在完成胚胎期眼发育的个体中诱导出具有信息量的眼表型（未发表观察结果）。在此过程中，较高剂量似乎会导致更高的致死率，而较低剂量则产生可观察且具有信息量的表型。

我们的实验方案不仅列出了研究人员开展T. marmoratus RNAi实验所需的必要步骤（如图所示），而且通常也适用于其他生物，尤其是水生生物。在水生生物中，甲壳类动物已有多个成功案例，例如水蚤Daphnia30和虾类（近期综述见参考文献31）。水生昆虫也具有广阔的研究前景，据估计其种类约占所有昆虫多样性的6%，可能超过20万种32。此外，已有针对常栖息于水体表面的水黾进行RNAi实验的成功报道33。即使缺乏基因组数据，也可通过从头组装转录组来实现。只要该过程能够获得长度为数百个核苷酸的重叠群（contig），即可设计针对特定基因的dsRNA。我们用于在琼脂糖中固定昆虫的实验方案，也可能适用于其他操作，特别是针对柔软、易变形以及水生生物的实验。综上所述，即使在缺乏其他分子与遗传工具的情况下，RNAi仍是一种在多种生物中调控基因表达的强大技术。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Josh Benoit 博士在生物信息学方面的协助，Hailey Tobler 在培育日光潜甲虫养殖方面的帮助，以及 Tamara Pace 提供的编辑支持。本研究得到了美国国家科学基金会的资助，项目编号分别为 IOS-1456757 和 IOS-1856341（授予 EKB）以及 IOS1557936（授予 YT）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>1. RNA 提取与从头转录组组装
液氮大学储藏室通常可在研究机构本地获取
移液器吸头Fisher Scientific尺寸依赖性其他供应商的产品同样适用
RNeasy脂质组织小量提取试剂盒（RNA提取试剂盒）Qiagen74804试剂盒中提供了详细的特定实验方案
分光光度计（NnanoDrop）赛默飞世尔科技9836674其他模型同样适用
<强>1.2. 从头转录组组装
BUSCO.v3https://busco.ezlab.org/任何可免费获取的用于评估转录组完整性的软件均可使用。
CLC Genomics WorkbenchQiagen832021其他等效的软件包也可获取
Galaxy 工作台https://usegalaxy.org/一个开源的在线转录组组装平台 &和注释流程
NCBI BLASTxhttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&&PAGE_TYPE=BlastSearch&&程序=blastx一个开源的在线比对与注释流程
<强>2. cDNA 合成，克隆 &和小量质粒提取分离
氨苄青霉素钠盐Gibco11593-027其他供应商的产品效果同样良好
甘油Fisher ScientificG33-500其他供应商的产品同样适用
LB肉汤Fisher ScientificBP1426-500其他供应商的产品同样适用
Omniscript RT（逆转录）试剂盒Qiagen205111试剂盒中提供了详细的特定实验方案
一次转化法™ TOP10 化学感受态 E. coliInvitrogenC404010试剂盒中提供了详细的特定实验方案
培养皿Fisher ScientificFB0875713其他供应商的产品同样适用
PureLink 快速质粒小提试剂盒ThermoFischer771471试剂盒中提供了详细的特定实验方案
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104试剂盒中提供了详细的特定操作步骤
摇床培养箱Labnet211DS其他模型同样适用
分光光度计（NnanoDrop）赛默飞世尔科技9836674其他模型同样适用
PCR用热循环仪BioRadT100其他模型同样适用
TOPO TA 克隆试剂盒Invitrogen1845069试剂盒中提供了详细的特定实验方案
X-Gal 溶液赛默飞世尔科技R0941其他供应商的产品同样适用
<强>2.2 PCR 扩增 &以及体外dsRNA合成
离心Fisher ScientificaccuSpin Micro 17R其他模型同样适用
乙醇Fisher ScientificA4094其他供应商的产品同样适用
FastTaq DNA 聚合酶，dNTP混合物罗氏13873432该试剂盒包含进行PCR所需的所有试剂
MEGAclear 转录纯化试剂盒ThermoFischerAM1908试剂盒中提供了详细的特定操作步骤
MEGAscript T7 转录试剂盒ThermoFischerAM1334试剂盒中提供了详细的特定实验方案
无核酸酶水Fisher ScientificAM9932其他供应商的产品同样适用
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104试剂盒中提供了详细的特定实验方案
乙酸钠Fisher ScientificBP333-500配制3M工作液
分光光度计（NnanoDrop）赛默飞世尔科技9836674其他模型同样适用
<强>3. 收集与制备早期阶段的T. marmoratus胚胎用于dsRNA注射
琼脂糖Fisher Scientific9012-36-6其他供应商的产品同样适用
蒸馏水Fisher Scientific9180其他供应商的产品效果同样良好
镊子（Dumon #4 生物学用）精细科学工具11242-40其他供应商的产品同样适用
玻璃腔室培养皿（三孔皿）Fisher Scientific50-243-43其他供应商的产品同样适用
微波Welbilt转台其他模型同样适用
天然毛发画笔亚马逊任何细毛刷均可使用
P1000 微量移液器GilsonF123602其他模型同样适用
培养皿Fisher ScientificFB0875713其他供应商的产品同样适用
体视显微镜显微镜中心10446293任何性能良好的体视显微镜均可使用
移液管Fisher Scientific21-200-109其他供应商的产品同样适用
<强>4. 早期 T. marmoratus 胚胎的 dsRNA 显微注射
数码相机Edmund optics（Qimaging）Retiga 2000R其他模型同样适用
乙醇Fisher ScientificA4094其他供应商的产品同样适用
食用色素克罗格任何可用的食用色素均可有效使用
湿度培养箱取一个带盖的塑料盒，用70%乙醇灭菌后晾干
培养箱实验室线路203其他模型同样适用
注射缓冲液参照文献22准备1 mL：混合10 µ0.1 M 磷酸钠缓冲液，100 L µ0.5 M 氯化钾溶液，100 L µL 食用染料和 790 µ升双蒸水。4℃保存 °C.
细胞内显微注射系统（Picospritzer）Parker052-0500-900目前可使用 III 型模型，但旧型号同样适用
微针持针器A-M Systems672441其他产品同样适用
显微注射针（1.2 mm × 0.68 mm，4 英寸）A-M Systems603000其他模型同样适用
显微操作仪Drummond Scientific Company3-000-024-R任何高质量的显微操作器均可使用
磷酸二氢钠Fischer Scientific7558-80-7配制10 mL 1 M工作液：将1.2 g磷酸二氢钠粉末加入10 mL双蒸水中，搅拌至形成澄清溶液
P-1000 微量移液器拉制仪Sutter InstrumentP-1000拉制仪参数设置：加热 575，拉力 60，速度 75，延迟 110，气压 700。
P10 微量移液器GilsonF144802其他模型同样适用
P1000 微量移液器GilsonF123602其他模型同样适用
氯化钾Fischer Scientific7447-40-7配制 100 mL 0.5 M 氯化钾溶液：将 3.73 g 氯化钾晶体加入 100 mL 双蒸水中，搅拌至形成澄清溶液。
0.1 M 磷酸钠缓冲液配制10 mL 0.1 M该缓冲液：取8.5 mL 1 M磷酸氢二钠溶液与1.5 mL 1 M磷酸二氢钠溶液混合。使用pH计检测pH值，并在室温下调节至pH 7.6。
磷酸氢二钠Fischer Scientific7558-79-4配制10 mL 1 M工作液：将1.42 g磷酸氢二钠粉末加入10 mL双蒸水中，搅拌至形成澄清溶液
体视显微镜显微镜中心10446293任何性能良好的体视显微镜均可使用
<强>5. 准备大理石纹螯虾幼体用于dsRNA注射
琼脂糖Fisher Scientific9012-36-6其他供应商的产品同样适用
镊子（Dumon #4 生物学用）Fine Science Tools11242-40其他供应商的产品同样适用
培养皿Fisher ScientificFB0875713其他供应商的产品同样适用
<强>6. 在 T. marmoratus 幼虫中进行 dsRNA 微注射
注射缓冲液（10倍浓度）参见第4节
显微注射针（1.2 mm × 0.68 mm，4 英寸）A-M Systems603000其他模型同样适用
显微注射器A-M Systems603000其他模型同样适用
微针持针器A-M Systems672441其他产品同样适用
P-1000 微量移液器拉制仪Sutter InstrumentP-1000拉制仪参数设置：加热 575，拉力 60，速度 75，延迟 110，气压 700。
体视显微镜显微镜中心10446293任何性能良好的体视显微镜均可使用

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RNA
水生甲虫中RNA干扰作为在特定发育时间点操控基因表达的有力工具
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