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方法文章

使用环介导等温扩增法检测灌溉水中的Phytophthora capsici

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DOI：

10.3791/61478

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2020年6月25日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, Coastal Plain Experiment Station, University of Georgia, 2University of Georgia Cooperative Extension, 3Department of Plant Pathology, Tropical Research & Education Center, University of Florida, 4Department of Agricultural and Environmental Sciences, Otis L. Floyd Nursery Research Center, Tennessee State University

本文内容

摘要

我们开发了一种利用滤纸DNA提取法结合环介导等温扩增（LAMP）检测技术来检测水源中Phytophthora capsici游动孢子的方法，该方法可在野外或实验室中进行分析。

摘要

Phytophthora capsici 是一种破坏性极强的卵菌病原体，可侵染多种重要的茄科和葫芦科作物，每年在蔬菜生产中造成严重的经济损失。Phytophthora capsici 通过土壤传播，因其具有长期存活的休眠结构（卵孢子和厚垣孢子），能够抵抗环境风化和降解，因此在蔬菜田中成为持续性问题。该病原菌主要通过产生游动孢子进行传播，游动孢子为单细胞、具鞭毛的孢子，可在地表或土壤孔隙积水形成的水膜中游动，并在水坑和池塘中聚集。因此，灌溉池塘可能成为病原菌的来源以及病害暴发的初始点。使用传统的基于培养的方法检测灌溉水中的 P. capsici 十分困难，因为环境中存在的其他微生物（如 Pythium 属物种）通常会过度生长并掩盖 P. capsici，导致其无法被检测。为了确定水源（灌溉水、径流水等）中是否存在 P. capsici 孢子，我们开发了一种基于手动泵的滤纸（8–10 µm）过滤方法，可有效捕获病原菌的孢子（游动孢子），随后利用一种新型环介导等温扩增（LAMP）检测技术对病原菌 DNA 进行扩增，该 LAMP 方法专为特异性扩增 P. capsici 而设计。该方法可检测低至 1.2 × 102 个游动孢子/毫升浓度的 DNA，灵敏度是传统 PCR 的 40 倍。在检测近缘物种时未出现交叉扩增。此外，LAMP 检测使用了比色型 LAMP 预混染料，结果可通过肉眼直接观察，适用于现场快速检测。本方案可进一步调整，用于检测其他通过受污染灌溉系统生存、聚集或传播的病原体。

引言

由于用水成本上升以及对水资源使用的环境问题日益关注，农场和苗圃中循环利用水的做法正变得越来越普遍。为减少植物病害的传播和发生，种植者已开发出多种灌溉方法。无论水源来自灌溉还是降水，都会产生径流，许多蔬菜和苗木种植者设有池塘来收集并循环利用这些径流1。然而，这会形成潜在病原物的蓄积库，当回收水用于作物灌溉时，反而有利于病原物的传播2,3,4。卵菌类植物病原物尤其能从这种做法中获益，因为其游动孢子会在水中聚集，而其主要的传播孢子虽具有自主运动能力，但需要依赖地表水进行扩散5,6,7。Phytophthora capsici 是一种卵菌病原物，以多种不同方式侵染多种茄科和葫芦科作物8。常见症状包括幼苗猝倒、根部和茎基腐烂；但在黄瓜、西葫芦、甜瓜、南瓜、西瓜、茄子和辣椒等作物上，果实腐烂可导致整季收成完全丧失9。尽管目前已有一些检测该植物病原物的方法，但大多数方法需在感染已发生后才能检测，此时再使用预防性杀菌剂已难以产生显著效果10。

当速度和灵敏度对成功和盈利性作物生产至关重要时，传统的检测灌溉水中目标微生物的方法是一种过时的技术11,12。该方法将易感目标病原菌的植物组织（例如，用于检测P. capsici的茄子）连接到改良的捕获装置上，然后将装置长期悬挂在灌溉池中，之后取出并检查是否发生感染。随后将植物组织样本接种于半选择性培养基（PARPH）上，培养以获得菌落，再通过复合显微镜进行形态学鉴定13。还有其他类似的方法用于检测其他植物病原体，例如使用选择性培养基，将少量污染水样涂布于平板上，随后进行转接培养14,15。这些方法通常需要2至6周时间，需经过多轮转接培养以分离目标生物，并且要求操作者具备Phytophthora病原诊断经验，才能识别各个物种的关键形态特征。由于水源中存在其他微生物的干扰，这些传统方法在检测被P. capsici污染的灌溉水时效果不佳。一些生长迅速的微生物，如Pythium spp. 和水生细菌，可能在培养基上过度生长，导致P. capsici无法被检测到16,17。

本研究的目的是开发一种灵敏且特异的分子检测方法，可用于田间和实验室条件下检测灌溉水中的P. capsici游动孢子。该方案包括基于P. capsici的一个1121个碱基对（bp）片段设计新型环介导等温扩增（LAMP）引物组，该片段具有高度特异性，可特异性扩增P. capsici18,19。同时，将本研究开发的检测方法与Dong等人（2015年）先前开发的LAMP引物进行比较20。

LAMP 检测是一种相对较新的分子检测方法，已被证明比传统的聚合酶链式反应（PCR）更快速、更灵敏且更具特异性21。通常情况下，传统 PCR 检测的灵敏度低于 500 拷贝（1.25 pg/µL）时无法检出；相比之下，先前的研究表明，LAMP 的灵敏度可比传统 PCR 高出 10 至 1,000 倍，甚至可轻松检测到低至 1 fg/µL 的基因组 DNA22,23。此外，该检测可在便携式加热模块上快速（通常在 30 分钟内）并现场（田间）完成，并通过显色染料在阳性样本中产生颜色变化（无需电泳分析）。在本研究中，我们采用滤膜提取法比较了 PCR 与 LAMP 检测的灵敏度。所提出的检测方法使研究人员和农业推广人员能够在两小时内轻松检测不同水源中 P. capsici 的孢子。该检测方法已被证实比传统 PCR 更为灵敏，并通过检测种植户所用灌溉水中的病原体实现了原位验证。该检测技术将使种植户能够评估用于灌溉的各种水源中病原体的存在情况及其种群密度，从而预防严重的病害暴发和经济损失。

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方案

1. 利用便携式环介导等温扩增技术对灌溉水中的Phytophthora capsici进行现场检测

  1. 安装泵和过滤器
    1. 将抽滤瓶连接到与手动泵相连的管路上，使得启动泵时空气能从抽滤瓶口被吸入。
    2. 将布氏漏斗插入抽滤瓶口的橡胶塞中，并将适当大小的滤纸放入布氏漏斗内，确保空气能通过滤纸。滤纸的截留粒径应为 15 µm。
      注意：滤纸必须紧贴布氏漏斗边缘，以尽量减少水从滤纸周围流过。
  2. 水样采集与过滤
    1. 从目标水源采集水样。水样中可含有少量碎屑，但不应含有大量沉积物或土壤。
    2. 在使用手动泵（或真空泵）产生负压抽吸的同时，将最多 1,000 mL（1 升） 测试水样缓慢倒入布氏漏斗中的滤纸上，速度应足够慢以防止溢出。
      注意：本方法对检测水样的最小体积无严格要求，建议至少使用 50 mL，最大体积为 1000 mL。
    3. 使用镊子将滤纸从布氏漏斗中取出，并用无菌剪刀剪成小片。将尽可能多的滤纸片（8–12 片）加入 1.5 mL 离心管中，使其完全浸没于提取缓冲液（磁珠法提取时为 400 µL）中。剩余滤纸片保留，待第一批次提取完成后继续处理。
    4. 将滤纸片与提取缓冲液在涡旋振荡器上或通过其他方式每分钟振荡 10 秒，持续 5 分钟。然后用镊子取出滤纸片，尽可能减少提取 缓冲液的损失。对剩余滤纸片重复此步骤，直至所有滤纸片均经过涡旋/振荡并充分浸泡于提取 缓冲液中。
  3. 基于磁珠的滤纸上 DNA 提取
    1. 向 1.5 mL 离心管（现含有约 200–300 µL 提取 缓冲液）中加入 20 µL 蛋白酶 K 和 10 µL 浓度为 10 ng/µL 的 RNase。
    2. 室温孵育 15 分钟，每 3 分钟涡旋或振荡一次。
    3. 向样品中加入 500 µL 含结合缓冲液的磁珠，并通过振荡充分混匀。然后在室温下孵育 5 分钟。
    4. 将离心管置于磁力架上 2 分钟，直至所有磁珠被吸附至磁铁一侧。移除并弃去上清液。
    5. 将离心管从磁力架上取下，加入 500 µL 洗涤缓冲液 1，并通过剧烈振荡重新悬浮磁珠。静置 30 秒后，将离心管放回磁力架。等待 2 分钟，待所有磁珠被吸附至磁铁一侧后，移除并弃去上清液。
      注意：在等待磁珠被磁力吸附时，建议将离心管倒置，以使粘附在管盖和管壁上的磁珠脱落，从而提高回收率。
    6. 使用 500 µL 洗涤缓冲液 2 重复步骤 1.3.5。
    7. 使用 500 µL 80% 乙醇重复步骤 1.3.5。
    8. 在室温（18–27 °C）下开盖晾干磁珠沉淀 15 分钟。若环境温度不适宜，可将离心管置于戴手套的手掌中并开盖孵育 15 分钟。
    9. 将离心管从磁力架上取下，加入 50 µL 洗脱缓冲液，并通过上下吹打 1 分钟重新悬浮磁珠。
    10. 将离心管放回磁力架，等待 2 分钟后，小心转移上清液至另一离心管中用于 DNA 储存，避免扰动磁珠。
      注意：此时实验可暂停。提取的 DNA 应保存在冰上或 -20 °C 冰箱中。
  4. 新型 LAMP 检测方法的应用
    1. 使用 0.2 µM 的 F3 和 B3 引物、0.8 µM 的 Loop-F 和 Loop-B 引物，以及 1.6 µM 的 FIP 和 BIP 引物配制 LAMP 引物混合液（表 2）。
    2. 向单个 PCR 管或 8 联管中的每个管加入以下 LAMP 反应液：2.5 µL 引物混合液（步骤 1.4.1）、12.5 µL LAVA LAMP 预混液、1 µL 提取的 DNA 和 9 µL ddH2O。总体积为 25 µL。
      注意：若使用便携式扩增仪（如 Genie III）并添加显色染料（如 Warmstart），请参见第 2.4.2–2.4.3 节。
    3. 设定两个反应管作为阳性和阴性对照。阳性对照使用 LAVA LAMP 试剂盒提供的对照样品或已知阳性的 DNA 样品；阴性对照使用 ddH2O。两者均以 1 µL 阳性对照或 ddH2O 替代 1 µL 提取的 DNA。
    4. 将样品放入设定为 64 °C 的金属浴（或便携式扩增仪）中反应 45 分钟。
      注意：此处可使用其他 DNA 提取方法替代磁珠法。CTAB 法和商用 DNA 提取试剂盒均已在标准操作流程下测试成功，仅将植物样品替换为滤纸片24,25。结果见表 2。若可定量 DNA 浓度，建议使用 1–10 ng 基因组 DNA。
  5. 结果观察
    1. 若在实验室条件下进行，取每份样品 5 µL 加样至 1% 琼脂糖凝胶中，使用凝胶电泳仪运行后，在紫外成像系统中观察扩增产物。
    2. 若使用了显色染料（如 Warmstart），通过观察颜色变化判断结果为阳性或阴性。
    3. 若使用了便携式扩增仪（如 Genie III），通过仪器屏幕上的扩增曲线判断结果。
  6. 已有 PCR 检测方法的应用
    注意：若使用常规 PCR 检测方法，步骤 1–3 保持不变，以下步骤应替代步骤 1.4 和 1.5。
    1. 向各含有以下组分的 PCR 管中分别加入 1 µL DNA 提取物：12.5 µL Green PCR 预混液、9.5 µL ddH2O，以及各 1 µL 的正向和反向引物（表 2）。
    2. 使用微量离心机短暂离心收集液体，并将 PCR 管放入热循环仪中。
    3. 按照先前发表文献中的程序设置热循环仪参数：94 °C 预变性 5 分钟；94 °C 变性 30 秒、54 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸 1 分钟，共 30 个循环；最后 72 °C 延伸 10 分钟。
    4. 将扩增产物在 1% 琼脂糖凝胶中电泳，通过紫外灯观察条带。阳性反应应出现约 508 bp 的条带。
  7. 传统检测方法
    注意：病原体检测的可选选择性平板培养方法有多种，以下是针对P. capsici的一般操作流程。
    1. 首先获取健康的茄子果实（P. capsici的易感寄主），并用 70% 异丙醇对果实表面进行表面灭菌。
    2. 将茄子果实放入装有漂浮装置（聚乙烯泡沫或其他材料）的牛奶箱中，部署至灌溉池中。将每个诱饵陷阱固定于单一位置，并在水源（循环使用的灌溉水）中放置至少 7 天，或直至观察到果实腐烂症状。收集果实并运送至实验室。
    3. 在无菌操作台中清洗并干燥果实，切取少量感染组织，接种于添加了 25 mg/L 五氯硝基苯、0.0005% 匹马菌素、250 mg/L 氨苄青霉素、10 mg/L 利福平和 50 mg/L 嘧菌酯的 PARPH 培养基平板上。于 25 °C 培养 5 天。
    4. 接种后第 4 天，在复合显微镜下观察菌落，进行传统的形态学鉴定。

2. 确定游动孢子浓度的检测限

  1. 制备游动孢子悬浮液
    1. 将P. capsici接种于V8琼脂培养基（100 mL V8果汁，900 mL ddH2O，1 g CaCO3）平板中，在26 °C条件下培养1周。可使用多个平板以获得更多的游动孢子悬浮液。
    2. 将平板置于室温下连续光照环境中孵育3天，以诱导产孢。
    3. 向每个平板中加入15 mL ddH2O淹没表面，随后将平板置于4 °C冰箱中25分钟，然后取出恢复至室温30分钟。
    4. 轻轻振荡平板以释放游动孢子，将所有平板中的悬浮液用移液器收集至一个50 mL离心管中。
    5. 为准确估算游动孢子浓度，取10 µL孢子悬浮液滴加到血细胞计数板上，在显微镜下观察并计数游动孢子，计算平均浓度。
  2. 系列稀释
    1. 取1 mL孢子悬浮液与9 mL ddH2O加入另一离心管中混合。根据需要重复此步骤进行多次10倍梯度稀释。
    2. 将上述孢子溶液按照先前基于过滤法的DNA提取方案提交用于DNA提取。
      注：若需要更大体积的悬浮液，可将体积加倍，即2 mL孢子悬浮液与18 mL ddH2O混合。
  3. 检测游动孢子浓度检测限
    1. 通过逐个运行各梯度稀释样品的检测反应，评估孢子的最低检出限，直至不再出现明确的阳性结果。当获得最终稀释度后，再进行2倍稀释（例如从4.8稀释至2.4），再次运行检测，以获得更精确的检测限。
  4. LAMP方法的建立与优化
    注：LAMP引物基于P. capsici的一段1121个碱基对（bp）的片段设计（Li等19），如补充图2所示。
    1. 若使用显色染料（如Warmstart），反应体系如下：2.5 µL引物混合液，12.5 µL显色染料，0.5 µL Green荧光染料，1 µL提取的DNA，以及8.5 µL ddH2O，总体积为25 µL。
    2. 使用便携式扩增仪配合LAVALAMP预混液时，可按照制造商建议设置95 °C预变性3分钟，但此步骤非必需。观察颜色变化或扩增曲线时无需进行最终退火步骤。若使用商用显色染料，则不应运行warmstart步骤。
    3. 可通过以下任一方式观察LAMP检测结果：将样品在1%琼脂糖凝胶上电泳，或使用紫外成像仪肉眼观察，或在Genie III实时扩增仪屏幕上直接读取结果。
    4. 利用便携式扩增仪并通过实时扩增曲线分析，优化LAMP检测的反应温度，以评估反应速度和灵敏度。在不同温度下运行样品，确定具有最高灵敏度且扩增最快的条件。
    5. 通过将提取的DNA进行系列稀释（方法同步骤2.2.1中的孢子悬浮液稀释），并在前述LAMP反应条件下对每个稀释度进行检测，以确定所建立LAMP方法的检测限。
  5. 检测限的确定及与常规PCR方法的比较
    1. 使用第1.3节中提取的DNA，比较常规PCR与LAMP检测方法的检测灵敏度。
    2. 在PCR管中加入1 µL DNA，以及正向和反向PCR引物各1 µL（表2），12.5 µL Green PCR Mastermix，和9.5 µL ddH2O，总体积为25 µL。
    3. 在PCR仪中进行扩增，反应条件如下：94 °C预变性5分钟；随后进行30个循环：94 °C变性30秒，54 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟；最后72 °C终延伸10分钟。
    4. 将PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，并在紫外成像仪上观察。预期扩增条带大小为508 bp。

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结果

LAMP 方法的优化
本研究采用便携式环介导等温扩增（LAMP）检测方法，检测灌溉水中是否存在Phytophthora capsici。首先，通过测试不同的 LAMP 引物浓度 [F3、B3（各 0.1–0.5 µM）；LF、LB（各 0.5–1.0 µM）和 FIP、BIP（各 0.8–2.4 µM）]、反应时间（30–70 分钟）以及反应温度（55–70 °C），对所建立的 LAMP 检测方法进行优化。本研究最终采用的 LAMP 引物混合物组成为：F3 和 B3 引物各 0.2 µM，Loop-F 和 Loop-B 引物各 0.8 µM，FIP 和 BIP 引物各 1.6 µM。通过便携式扩增仪（例如 Genie III）确定在无非特异性扩增的前提下反应速度最快的温度，以优化反应温度。最终确认最佳反应温度为 64 °C（数据未显示）。在 64 °C 下运行检测的最佳时间为 45 分钟，因为最低检出浓度（1.2 × 102 孢子/mL）在 40 分钟时已可扩增，而较高浓度样本在 20 分钟时即可完成扩增（图 2D...

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讨论

对灌溉水中的植物病原体进行检测，是使用灌溉池塘和循环用水的种植者至关重要的一步27。灌溉池塘为多种植物病原体提供了储水和繁殖的场所，因为过量的灌溉水会从田间流入池塘，并携带可能存在的任何病原体16,27。传统上，在大型水源中检测植物病原体的方法是使用易感寄主组织（例如果实、叶片）作为诱饵，将其悬挂在池塘中，等待感染发生后取出果实或叶片，并通过显微镜观察或分子方法确认诊断结果13,14。这些方法存在局限性，主要体现在检测所需时间较长（2周或更久），以及对人力和设备的高需求。此外，准确的检测结果依赖于操作人员在肉眼诊断、病原体形态学和分类学方面具备丰富的经验与知识。相比之下，PCR、qPCR和DNA杂交等分子技术所需的检测时间显著缩短（3–4小时），但需要昂贵的仪器和实验室环境。此外，这些技术无法处理大量体积的水样。血清学检测方法在检测能力方面也存在不足，因其易...

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披露

作者无任何披露内容或利益冲突。

致谢

本工作获得了佐治亚州蔬菜商品委员会项目（项目编号：FP00016659）的经费支持。作者感谢佐治亚大学的Pingsheng Ji博士和俄亥俄州立大学的Anne Dorrance博士提供Phytophthora spp. 的纯培养物。同时感谢Li Wang和Deloris Veney在本研究过程中提供的技术协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖凝胶粉末Thomas ScientificC997J85
布氏漏斗Southern LabwareJBF003
子弹式混匀仪Next AdvanceBBX24
离心机 5430Eppendorf22620509
氯仿Fischer ScientificC298-500
CTAB 溶液Biosciences786-565
Dneasy 提取试剂盒Qiagen69104
抽滤瓶UnitedFHFL1000
滤纸United Scientific SuppliesFPR009
核酸染料 Gel Green 10000XThomas ScientificB003B68 (1/EA)
Genie IIIOptiGene
手动泵Thomas Scientific1163B06
异戊醇Fischer ScientificBP1150-500
LAVA LAMP 预混液Lucigen30086-1
磁珠 DNA 提取试剂GenesiggenesigEASY-EK
磁力分离架GenesiggenesigEASY-MR
聚乙烯吡咯烷酮Sigma AldrichPVP40-500G
引物Sigma Aldrich
Prism 小型离心机LabnetC1801
热循环仪 T100Bio-Rad1861096
紫外凝胶成像系统Analytik Jena849-00502-2
Warmstart 显色染料LucigenE1800m
宽型小型 ReadySub-Cell GT 电泳槽Bio-Rad1704489EDU
70% 异丙醇Fischer ScientificA451-1

参考文献

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