使用 循环介质等温扩 增检测灌溉水中的植物浮肿

摘要

我们开发了一种 利用 滤纸DNA提取方法检测水源中植物性浮肿的方法，并结合循环中等温扩增（LAMP）测定法，可现场或实验室进行分析。

摘要

植物性浮肿是一 种毁灭性的奥米妥特病原体，它影响许多重要的冬虫夏菜和库伯特作物，每年给蔬菜生产造成重大经济损失。 植物浮游生物是 土壤传播的，由于其长期生存结构（卵源和衣原体）能够抵抗风化和降解，在菜地中是一个长期存在的问题。分散的主要方法是通过生产动物孔，这是单细胞的，旗状孢子，可以游过表面或充满水的土壤毛孔的薄膜，可以积累在水坑和池塘。因此，灌溉池可能是病原体和疾病爆发的最初点源。在 灌溉水中检测P. 辣椒很难使用基于传统文化的方法，因为环境中存在的其他微生物， 如Pythium spp.，通常过度生长 P.辣椒 ，使其检测不到。为了确定水源 （灌溉 水、径流等）中是否存在P.辣椒孢子，我们开发了一种基于手泵的滤纸（8-10μm）方法，该方法捕获病原体的孢子（zoospore），后来用于通过一种新型的循环调节等温（LAMP）分析来放大病原体的DNA，该测定法旨在对 P. 这种方法可以放大和检测低浓度为1.2×10² 的DNA，其灵敏度是传统PCR的40倍。在测试密切相关的物种时，没有获得交叉放大。LAMP 还使用色度 LAMP 主混合染料进行，显示可用肉眼读取的结果，以便现场快速检测。该协议可适用于通过受污染的灌溉系统居住、积累或分散的其他病原体。

引言

由于水成本增加和用水背后的环境问题，农场和托儿所的回收用水正变得越来越受欢迎。为种植者开发了许多灌溉方法，以减少植物病的传播和发生。无论水源（灌溉或降水），径流都会产生，许多蔬菜和苗圃种植者都有一个池塘来收集和回收径^流1。这创造了一个水库，为可能的病原体积累有利于病原体的传播，当再生水被用来灌溉作物^{2，3，4。,3,4}Oomycete植物病原体特别受益于这种做法，因为动物孔会积聚在水中，主要分散孢子是自动的，但需要地表水^{5，6，7。,6,7}植物性植物素是一种异种病原体，以不同的方式影响大量的多叶和库伯特^作物。通常，症状是阻尼幼苗，根和冠腐烂;然而，在黄瓜，南瓜，甜瓜，南瓜，西瓜，茄子和胡椒等作物，整个收成可能会因为水果腐烂^而损失。虽然已知有检测这种植物病原体的方法，但大多数都要求已经发生感染，这为时已晚，任何预防性杀菌剂都不能产生显著^{的影响10。}

传统的灌溉水测试方法，用于检测和诊断目标微生物是一种过时的方法，当速度和敏感性是成功的关键和有利可图的作物^{生产11，12。,12}易受靶向病原体影响的植物组织（例如，P. 辣椒茄子）附着在经过改良的陷阱上，该陷阱在被移除和检查感染之前被悬浮在灌溉池中较长时间。然后将植物组织的样品镀在半选择性介质（PARPH）上，并孵育成培养，然后使用复合显微镜¹³进行形态识别。其他植物病原体有其它类似的检测方法，使用选择性培养，并在分培养^14、15之前，先将少量^{受污染的水电镀}。这些方法需要2到6周，几轮亚培养来分离生物体，并体验植物预防诊断，以便能够识别每个物种的关键形态特征。由于水源中其他微生物的干扰等因素，这些传统方法对受P.辣椒污染的灌溉水检测不成功。一些快速生长的微生物，如Pythium spp.和水传播的细菌，可以在盘子里过度生长，使P. capsici无法检测^{到16，17。,17}

本研究的目的是开发一种敏感和特定的分子方法，可用于田间和实验室设置，以检测灌溉水中的P.辣椒动物孔。该协议包括开发一个新的循环介质等温放大（LAMP）底像集，能够特别放大P.卡普西奇，基于1121基对（bp）片段的P.capsici^{18，19。,19}与为这项研究开发²⁰的测定相比，使用了由董等人（2015年）开发的LAMP底像。

LAMP检测是一种相对较新的分子检测形式，已被证明比常规聚合酶链反应（PCR）21更快速、^{更灵敏、更特异性}。一般来说，传统的PCR测定不能检测低于500份（1.25皮克/μL）;相比之下，先前的研究表明，LAMP的灵敏度可以比传统PCR高10至1，000倍，并且能够轻松检测出1 fg/μL的基因组^{DNA22，23。,23}此外，通过使用便携式加热块进行放大和色度染料改变阳性样品的颜色（无需电泳），可以快速（通常 30 分钟内）和现场（现场）进行测定。本研究中，我们利用滤波器提取方法比较了PCR和LAMP测定的灵敏度。拟议的检测方法使研究人员和推广剂能够在不到两个小时的时间轻松检测不同水源中P.辣椒孢子的存在。该测定方法证明比传统的PCR更敏感，通过检测种植者使用的灌溉水中的病原体存在，得到了原地验证。这种检测方法将使种植者能够估计用于灌溉的各种水源中病原体的存在和种群密度，防止破坏性爆发和经济损失。

方案

1. 使用便携式循环 介质 等温扩增从灌溉水中对植物浮游水进行现场检测

1. 设置泵和过滤器
   1. 将滤瓶连接到连接到手泵的管子上，以便当泵激活时，空气会通过过滤瓶口拉进。
   2. 将 Buchner 漏斗放入滤瓶口的橡胶塞中，并将适当大小的滤纸放入布赫纳漏斗中，以便空气通过滤纸输送。滤纸的保留尺寸应为 15 μm。
      注:滤纸必须适合布赫纳漏斗的边缘，以便最少的水会流经滤纸。
2. 水采样和过滤
   1. 从目标水源中采集水样。水可能有少量的碎屑，但沉淀物或土壤不显著。
   2. 将高达 1，000 mL （1 升） 的试水倒在布赫纳漏斗内的滤纸上，以防止溢出，同时使用手泵（或真空泵）进行吸水，以将水拉过。
      注:没有可以使用此方法测试的最低水量，虽然建议至少 50 mL，但 1000 mL 是此方法的最大量。
   3. 使用钳子，从布赫纳漏斗中取出滤纸，用无菌剪刀将其切成小块。将协议要求的萃取缓冲液（400 μL 用于磁珠萃取）中尽可能多的片（8-12）添加到 1.5 mL 管中。提取第一套后，保存剩余的滤纸件进行处理。
   4. 漩涡或以其他方式搅拌滤纸片和萃取缓冲液，每分钟10秒，5分钟。然后，使用钳子，尽可能少地取出滤纸的提取缓冲液。用剩余的滤纸重复此步骤，直到所有碎片都涡旋/搅拌并浸泡在萃取缓冲液中。
3. 基于磁珠从滤纸中提取DNA
   1. 到 1.5 mL 管（现在含有约 200-300 μL 的萃取缓冲液），加入 20 μL 的蛋白酶 K 和 10 μL 的 10 ng/μL RNase。
   2. 在室温下孵育15分钟，每3分钟一次旋转或摇动管子。
   3. 将500μL的磁珠与结合缓冲液加入样品中，通过摇动混合。然后在室温下孵育5分钟。
   4. 将管子放在磁性分离器机架中 2 分钟，直到所有磁珠都拉到磁铁上。取出并丢弃上一液。
   5. 从磁性分离器上拆下管子。加入 500 μL 的洗涤缓冲液 1，通过大力摇动管重新悬挂珠子。等待 30 s，然后将管放回磁性分离器中。等待 2 分钟，直到所有磁珠被拉向磁铁，然后取出并丢弃上一液。
      注:在等待磁珠磁化到分离器时，我们建议反转管，因为磁珠可以反转粘在磁珠盖和管的两侧，导致更多的磁珠被连接。
   6. 使用 500 μL 的洗涤缓冲液 2 重复步骤 1.3.5。
   7. 使用 500 μL 的 80% 乙醇重复步骤 1.3.5。
   8. 在室温（18-27 °C）下，在盖子打开时将磁珠颗粒通风15分钟。如果温度不允许，在戴手套的手孵育，盖打开15分钟。
   9. 从磁性分离器上拆下管子。加入 50 μL 洗脱缓冲液，通过上下移液 1 分钟重新悬浮珠子。
   10. 将管放回磁性分离器中。等待 2 分钟，然后将上一液转移到单独的管中，而不干扰珠子进行 DNA 存储。
       注意:在这里，实验可以暂停，然后再继续。提取的DNA应储存在冰上或-20°C的冰柜中。
4. 新开发的LAMS测定的应用
   1. 使用每个 F3 和 B3 底项的 0.2 μM、每个环路 F 和环-B 底向的 0.8 μM 以及每个 FIP 和 BIP 底向的 1.6 μM 准备 LAMP 底金组合（表 2）。
   2. 将以下 LAMP 溶液添加到单个 PCR 管中，或添加到 8 管条中的每个单独管中:2.5 μL 的底材混合（步骤 1.4.1）、12.5 μL 的 LAVA LAMP 主混合、1 μL 提取的 DNA 和 9 μL 的 ddH₂O。总体积为 25 μL。
      注:如果使用带色度染料（如暖启动）的便携式放大仪器（例如精灵 III），请参阅第 2.4.2-2.4.3 节。
   3. 将两个管指定为正向和负对控。对于阳性控制，请使用 LAVA LAMP 套件提供的控件或已知的阳性 DNA 样本。对于负控制，请使用 ddH₂O。对于两者，将提取的脱氧核糖核酸的1μL替换为阳性对照的1μL或ddH₂O。
   4. 将样品放入热块（或便携式放大仪器）中，设置为 64°C 45 分钟。
      注:此处可以使用其他萃取方法，而不是基于磁珠的萃取。CTAB和一个商业DNA提取试剂盒都成功地测试了使用标准协议和替代过滤纸片植物样品^{24，25。24,}表2中比较了结果。如果DNA的浓度可以量化，使用1-10ng基因组DNA之间。
5. 结果可视化
   1. 如果在实验室环境中执行，通过将每个样品的 5 μL 加载到 1% 的 agarose 凝胶中，在凝胶电泳机中运行，并在 UV 成像机中成像，查看放大产品。
   2. 如果使用色度染料（例如，暖启动），则查看颜色变化以确定结果为正或负。
   3. 如果使用便携式放大仪器（例如精灵 III），请查看屏幕上的放大图以确定结果。
6. 以前开发的PCR测定的应用
   注:如果使用传统的 PCR 测定，步骤 1-3 保持不变，应应用以下步骤来代替步骤 1.4 和 1.5。
   1. 将每个 DNA 提取的 1 μL 添加到包含以下成分的单个管中:12.5 μL 的绿色 PCR 主混合物、9.5 μL 的 ddH₂O 和 1 μL 的前进和反向底向（表 2）。
   2. 使用微离心器将每个样品旋转下来，然后将管放入热循环器中。
   3. 根据以前的出版物使用以下热循环器设置:94 °C 5 分钟，30 个周期变性在 94 °C 30 s，退火在 54 °C 30 s，延长在 72 °C 1 分钟，最后延长在 72 °C 10 分钟。
   4. 在 1% 的加糖凝胶中运行产品。观察紫外光下是否存在带，其中阳性反应的波段大小为 ±508 bp。
7. 传统的检测方法
   注:有多种选择性电镀方法用于病原体检测，以下是 P.capsici的一般协议。
   1. 首先，获得一个健康的茄子水果 （P. capsici的易感宿主），并用70%的异丙醇清洗果面进行表面消毒。
   2. 将茄子果放入牛奶箱中，用浮选装置（聚乙烯泡沫或其他）放入灌溉池中。将每个诱饵陷阱固定到一个点，将陷阱留在水库（再生灌溉水）中至少 7 天，或直到观察到水果腐烂症状。收集水果并运到实验室。
   3. 在取出小块受感染的组织之前，将水果冲洗并干燥，并把它们放在一盘用25毫克/L五氯苯、0.0005%皮马里辛、250毫克/L安皮西林、10毫克/L利芬和50毫克/L催眠剂修正的PARPH介质上。在25°C下孵育板5天。
   4. 在分离后4天在复合显微镜下查看板材，进行传统形态鉴定。

2. 确定动物孔浓度的检测限值

1. 使动物园孔悬浮
   1. 在V8 琼脂 （100 mL的V8果汁，900 mL的ddH₂O，1克的CaCO_3）板上孵育P. 辣椒，在26°C下孵育1周。 多个板可用于获得更大的动物园孔悬浮液。
   2. 在室温下连续光下孵育板3天，以刺激孢子。
   3. 将 15 mL 的 ddH₂O 添加到每个盘子中，将它们放入 4°C 冰箱中 25 分钟，使盘子充水。然后返回室温30分钟。
   4. 搅拌板，将动物园孔和移液溶液移液到一个单一的50 mL 管从所有板。
   5. 为了获得对动物孔浓度的准确估计，在血细胞计上加入10μL的孢子悬浮液，并在显微镜下观察以计算动物孔，估计平均浓度。
2. 串行稀释
   1. 将 1 mL 的孢子悬浮液和 9 mL 的 ddH₂O 添加到单独的管中。根据需要重复此步骤，进行多达 10 倍的稀释。
   2. 然后，根据使用过滤方法的先前协议，将孢子溶液提交DNA提取。
      注:如果需要更大的悬浮量，则将容积翻倍:2 mL 的孢子悬浮液和 18 mL 的 ddH₂O。
3. 动物孔浓度极限的检测
   1. 通过检测单独运行每个序列稀释，以评估孢子检测限值，直到不再观察到明显阳性结果。获得最终稀释后，稀释 2 倍（本例中为 4.8 至 2.4），然后再次运行检测以获得更精确的检测限值。
4. LAMP 方法的开发和优化
   注:LAMP底向器的设计基于 P.capsici（Li 等人^{，第19条）的1121}基对（bp）片段，如补充 图2所示。
   1. 如果使用色度染料（例如暖启动），请使用以下溶液:2.5 μL 的底注混合物、12.5 μL 的色度染料、0.5 μL 的绿色荧光染料、1 μL 提取的 DNA 和 8.5 μL ddH₂O。总体积为 25 μL。
   2. 当使用带LAVALAMP主混料的便携式放大仪器时，按照制造商的建议，初始步骤为95°C，为3分钟，但不需要这样做。观察颜色变化或放大图不需要最后的退火步骤。如果要使用商业色度染料，请勿运行暖启动步骤。
   3. 查看 LAMP 检测结果采用以下方法之一:在 1% 的 agarose 凝胶上运行样品，或使用带肉眼的 UV 成像机查看，或在 Genie III 实时放大屏幕上查看。
   4. 使用便携式放大仪器优化 LAMP 测定温度，并使用实时放大图分析速度和灵敏度水平。运行具有独特温度的样品，以确定具有最高灵敏度的最快放大速度。
   5. 通过连续稀释提取的DNA（如步骤2.2.1中的孢子悬浮液）并保持前面所述的每次稀释的LAMS反应反应条件，确定LAMS开发的检测限值。
5. 检测极限测定与常规PCR方法的比较
   1. 使用第 1.3 节中的步骤提取的 DNA 将常规 PCR 的检测水平与 LAMP 测定的检测水平进行比较。
   2. 将 1 μL DNA 添加到包含 1 μL 的前进和反向 PCR 底转（表2），12.5μL 的绿色 PCR 母体混合和 9.5 μL 的 ddH₂O，共 25 μL。
   3. 使用以下条件在热循环器中放大样品:94 °C 5分钟，30个周期变性，30°C，30秒，54°C退火30秒，72°C延长1分钟，最终延长72°C10分钟。
   4. 在电泳机中运行 1% 的 agarose 凝胶上的样品，并在 UV 成像机器上查看。外带大小为508个基点。

结果

LAMP 方法的优化
在这项研究中，我们利用便携式 循环介质等温 扩解（LAMP）测定，检测了灌溉水中存在植物浮肿。首先，通过测试不同的LAMB底因浓度[F3，B3（每个0.1±0.5μM），对拟议的LAMB测定进行了优化;LF、LB（每磅0.5~1.0 μM）和FIP、BIP（每片0.8~2.4 μM）、持续时间（30~70分钟）和温度（55~70 °C）。本研究使用的最终 LAMP 底木组合是:每个 F3 和 B3 底注的 0.2 μM，每个环路-F 和环路-B 底注的 0.8 μM，每个 FIP 和 BIP 底因的 1.6 μM。通过确定哪个温度执行最快的反应，而没有额外的负放大，在便携式扩增仪器（例如，Genie III）中对反应温度进行优化。最佳温度被确认为64°C（未显示数据）。在64°C下进行检测的最佳时间是45分钟，因为检测结果为阳性的最低浓度（1.2 x 10^孢 子/mL）仍放大40分钟，而较高浓度在20分钟放大（图2D）。在沾染核酸污渍的1%的气糖凝胶上进一步观察放大的LAMS产...

讨论

对植物病菌的灌溉水进行测试，是种植者使用灌溉池塘和再生水^{的关键一步}。灌溉池为一些植物病菌提供了一个水库和繁殖地，因为过量的灌溉水从田间流向池塘，携带任何可能存在^{16、27,的病原体}。在大型水源中检测植物病原体的传统方法是使用悬浮在池塘中的易感宿主组织（如水果、叶子）为病原体设置诱饵，等待感染发生，然后去除水果/叶子，然后用显微镜或分子方法^13、14,确认^诊断结果。由于运行检测测试（2 周或更长时间）所需时间以及所需的人工和设备，这些方法受到限制。此外，在视觉诊断、病原体形态和分类学方面需要丰富的经验和知识，才能获得准确的结果。与传统检测方法相比，PCR、qPCR和DNA杂交等分子技术需要的时间（3-4小时）明显减少;然而，他们需要昂贵的设备和实验室设置。此外，这些技术不允许处理大量的水。血清学分析也由于非靶向阳性反应而缺乏检测能力，并且尚未开发出针对植物特异...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖凝胶粉末	Thomas Scientific	C997J85
Buchner 漏斗	Southern Labware	JBF003
子弹头搅拌机	Next Advance	BBX24
离心机 5430	Eppendorf	22620509
氯仿	Fischer Scientific	C298-500
CTAB 解决方案	生物科学	786-565
Dneasy 提取套件	Qiagen	69104
过滤瓶	United	FHFL1000
滤纸	United Scientific Supplies	FPR009
凝胶绿色 10000X	Thomas Scientific	B003B68 （1/EA）
Genie III	OptiGene
手动泵	ThomasScientific	1163B06
异戊醇	Fischer Scientific	BP1150-500
LAVA LAMP 预混液	Lucigen	30086-1
磁珠 DNA 提取	Genesig	genesigEASY-EK
磁性分离器	Genesig	genesigEASY-MR
聚乙烯吡咯烷酮	Sigma Aldrich	PVP40-500G
引物	Sigma Aldrich
Prism 迷你离心机	Labnet	C1801
T100 热循环仪	Bio-Rad	1861096
紫外凝胶 Doc	Analytik 耶拿	849-00502-2
Warmstart 比色染料	Lucigen	E1800m
宽 Mini ReadySub-Cell GT Cell	Bio-Rad	1704489EDU
70% 异丙醇	Fischer Scientific	A451-1