量化原代小鼠中脑神经元中自发性 Ca2+ 流及其下游效应

摘要

本文介绍了一种利用原代小鼠中脑神经元培养物，在体外检测中脑神经元内Ca²⁺流及其对caspase-3下游效应的方法。该模型可用于研究与中脑神经元Ca²⁺活动异常相关的病理生理变化，并用于筛选具有抗凋亡特性的新型治疗药物。

摘要

帕金森病（PD）是一种由多巴胺能（DA）神经元变性引起的严重神经退行性疾病。由于谷氨酸受体异常激活导致过量的Ca²⁺内流，引发DA神经元兴奋性毒性，已被确认为DA神经元丢失的重要机制。在本研究中，我们从ED14小鼠胚胎的腹侧中脑（VM）分离、解离并培养中脑神经元。随后，我们用一种腺相关病毒（AAV）感染长期培养的原代小鼠中脑神经元，该病毒在人神经元特异性突触素启动子（hSyn）调控下表达基因编码的钙指示蛋白GCaMP6f。通过活细胞共聚焦成像，我们显示，由AAV-hSyn-GCaMP6f检测到培养的小鼠中脑神经元存在自发性Ca²⁺波动。向中脑培养物中施加谷氨酸会引起神经元内Ca²⁺浓度异常升高，并伴随DA神经元中caspase-3的激活，免疫染色结果证实了这一点。鉴定谷氨酸介导的原代小鼠DA神经元凋亡的技术，在筛选保护DA神经元健康的高通量药物方面具有重要应用价值。

引言

帕金森病（Parkinson’s Disease, PD）是全球第二常见的神经退行性疾病，目前尚无已知的治愈方法。据估计，帕金森病的患病率将持续上升，仅在美国，到2030年预计确诊人数将超过100万¹。由于目前可用于对抗帕金森病的有效治疗手段有限，迫切需要开发更有效的疗法。帕金森病的特征是中脑多巴胺（DA）神经元迅速且进行性地丧失²。帕金森病中神经退行性变的潜在机制尚不明确。现有证据表明，多种机制可能共同作用，例如氧化应激和 线粒体功能障碍等，这些因素可引发凋亡信号级联反应，最终导致细胞死亡³。

一种类似的汇聚机制——谷氨酸介导的兴奋性毒性，已被认为与多种神经退行性疾病相关，包括帕金森病（PD）⁴尽管谷氨酸介导的兴奋性毒性主要被认为通过过度激活NMDA受体导致细胞内Ca²⁺浓度异常升高而发挥作用²⁺ 浓度升高并最终启动细胞凋亡，Ca²⁺通透性AMPA受体也已被证实在兴奋性毒性反应中发挥作用^5,6,7因此，研究AMPA受体在帕金森病模型中对谷氨酸介导的细胞凋亡的贡献具有重要意义。可通过使用NBQX（一种AMPA和海人藻酸受体阻断剂）实现该目的，NBQX在微摩尔浓度下对AMPA受体具有选择性 受体⁸谷氨酸介导的兴奋性毒性及凋亡信号级联反应是衡量细胞死亡程度的理想下游靶点，也是潜在的治疗干预靶点。因此，建立一种高内涵方法，用于评估谷氨酸介导的原代腹侧中脑（VM）神经元钙活性及其相关下游信号通路的调控作用，将有助于筛选能够保护神经元健康的新治疗方法。

在此，我们建立了一种实验方案，利用AAV2/5载体并结合人源突触素（hSyn）启动子表达遗传编码的钙离子指示剂（GECI）GCaMP6f，以检测小鼠中脑（VM）原代神经元在谷氨酸刺激下产生的Ca²⁺活性，该活性可在生理学和分子水平上进行测量。该高内涵筛选方法可用于发现能够调节Ca²⁺活性、从而保护VM神经元健康的药物或治疗手段。我们提出，该原代培养模型是一种有效的筛选新干预策略的方法，可用于评估其保护VM神经元健康及延缓帕金森病（PD）进展的能力。

方案

所有涉及动物实验的操作均已获得德克萨斯农工大学（Texas A&M University）机构动物护理与使用委员会的批准。&M大学机构动物护理与使用委员会（25^th 2019年11月；动物使用方案编号# 2019-0346

注意：细胞培养溶液的配制应在生物安全柜中采用无菌操作进行，并通过0.2 µm滤膜过滤，以防止污染。

1. 溶液与培养基的制备

1. 通过将20 µL的1 mg/mL层粘连蛋白储备液稀释至2 mL无菌蒸馏H₂O中，制备层粘连蛋白包被溶液。应在解剖当天配制。
2. 通过将5 mL马血清（ES）加入45 mL 1×Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，制备10%马血清（ES）终止溶液。使用0.2 µm滤器系统或注射器滤头进行无菌过滤。4 °C保存。
3. 通过将2 g牛血清白蛋白（BSA）粉末加入1×磷酸盐缓冲液（PBS）并定容至45 mL，制备4%牛血清白蛋白（BSA）储备液。使用0.2 µm滤器系统或注射器滤头进行无菌过滤。4 °C保存。
4. 通过将木瓜蛋白酶以3 mg/mL浓度溶于1×HBSS中，制备木瓜蛋白酶储备液。使用0.2 µm滤器系统或注射器滤头进行无菌过滤。-20 °C保存。
5. 通过将20 mg脱氧核糖核酸酶（DNase）粉末加入无菌H₂O并定容至20 mL，制备脱氧核糖核酸酶（DNase）溶液。使用0.2 µm滤器系统或注射器滤头进行无菌过滤。-20 °C保存。
6. 通过将352 mg抗坏血酸加入无菌蒸馏H₂O并定容至20 mL，制备抗坏血酸储备液。如需溶解，可在37 °C水浴中加热。使用0.2 µm滤器系统或注射器滤头进行无菌过滤。-20 °C保存。
7. 在50 mL Neurobasal培养基中加入以下成分，制备细胞培养基：500 µL Glutamax（100×）、500 µL马血清、1 mL B-27、100 µL抗坏血酸、500 µL青霉素-链霉素、50 µL卡那霉素和50 µL氨苄青霉素。使用0.2 µm滤器系统进行无菌过滤。4 °C保存。
8. 通过将1 mL Triton X-100加入9 mL 1×PBS中配制成10%溶液，制备0.01% Triton X-100溶液。由于Triton X-100黏稠，应缓慢移液以确保吸头完全充满。如需溶解，可在37 °C水浴中加热。4 °C保存。
9. 将10% Triton X-100储备液稀释至0.01%，需进行三次连续的1:10稀释。取1 mL 10%储备液加入9 mL 1×PBS中制成1%溶液；取1 mL 1%溶液加入9 mL 1×PBS中制成0.1%溶液；取1 mL 0.1%溶液加入9 mL 1×PBS中制成0.01%溶液。
10. 通过将1 mL正常山羊血清（NGS）加入9 mL 1×PBS中配制10%溶液；将100 µL正常山羊血清（NGS）加入9.9 mL 1×PBS中配制1%溶液。
11. 通过将735 mg L(+)-谷氨酸溶于无菌蒸馏H₂O并定容至50 mL，制备谷氨酸储备液（100 mM）。该浓度下溶解度可能存在问题，加入少量（100 µL）1 M盐酸足以提高其溶解度。
12. 通过将50 mg NBQX溶于无菌蒸馏H₂O并定容至13 mL，制备NBQX储备液（10 mM）。

2. 培养皿和盖玻片的准备（在解剖前一天完成）

注意：我们发现，联合使用三种包被试剂——聚-L-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白，可实现理想的细胞贴附和存活率。

1. 在生物安全柜中放置10个35 mm的培养皿。每个培养皿中放入两个12 mm的圆形盖玻片，并加入70%乙醇浸泡10分钟。使用真空管线吸除每个培养皿中残留的乙醇，使其完全挥发。
2. 用移液器将约90–100 µL的0.1%多聚-L-赖氨酸溶液滴加到每个盖玻片上，确保盖玻片表面完全被多聚-L-赖氨酸溶液覆盖。盖上培养皿盖，置于37 °C培养箱中孵育1小时。
3. 吸除每个盖玻片上残留的多聚-L-赖氨酸溶液，并用无菌H₂O冲洗。
4. 用0.1%多聚-L-鸟氨酸溶液重复步骤2.2–2.3。
5. 再用0.01%层粘连蛋白溶液重复步骤2.2–2.3。将培养皿置于37 °C/5% CO₂培养箱中，直至次日进行细胞接种。

3. 小鼠胚胎解剖

注意：每次培养使用4至6只定时交配的怀孕小鼠。尽管大部分解剖操作在生物安全柜外进行，但仍需保持无菌操作。在解剖显微镜周围表面及手术器械上充分使用70%乙醇是理想的做法。解剖过程中也可佩戴口罩，以进一步防止污染。此外，我们在培养基中使用了4种不同的抗生素，因此污染的可能性较低。然而，如果抗生素的使用存在问题，可将此解剖操作移至无菌操作台内进行。为保持细胞活性，所有解剖用溶液均应在4 ˚C预冷，且解剖操作应尽快完成。我们不在冰上进行解剖。小鼠胚胎中脑神经元的解剖方法与先前报道的方法相同^9,10。

1. 在解剖显微镜附近的实验台上准备一个区域，放置吸水垫，并用70%乙醇充分喷洒消毒。
2. 用70%乙醇喷洒两个100 × 15 mm玻璃培养皿和一个50 × 10 mm玻璃培养皿，待乙醇完全挥发后，向每个100 × 15 mm培养皿中加入50 mL无菌1×HBSS。
3. 将手术剪刀、镊子和切片刀片浸入70%乙醇中至少10分钟以进行灭菌处理，随后将器械置于吸水垫上晾干。
4. 采用CO₂麻醉后行颈椎脱位法，处死妊娠时间明确、年龄为2–3个月、处于胚胎第14天的孕鼠。
5. 用70%乙醇喷洒已处死小鼠的腹部，用镊子夹住下腹部，使用手术剪刀切开腹腔。从镊子夹持部位开始剪切，向两侧横向剪开，直至可将腹壁向后翻折，使子宫清晰暴露。
6. 使用手术剪刀剪断子宫角的两端，取出子宫并放入盛有1×HBSS的培养皿中。
7. 用直头镊子小心地将胚胎从子宫中取出，整个操作过程中保持胚胎浸没于HBSS中。使用镊子或切片刀片迅速在颈部附近切断胚胎头部，切割时应尽量保持切面平整。
8. 在解剖显微镜下，将一个胚胎头部转移至干燥的50 mm培养皿中，腹侧朝上放置。用镊子夹住眼睛或吻部附近区域以固定头部，镊子应向下倾斜约45°，避免刺入中脑。
9. 用另一只手操作镊子，小心去除中脑明显脊状隆起前方的透明皮肤层和颅骨。从正中线附近开始，向尾侧剥离皮肤和颅骨，直至中脑完全暴露。
10. 将镊子垂直于暴露的中脑放置，一端置于皮层与中脑之间，另一端靠近小脑区域。向下按压并合拢镊子，以完整取出中脑组织，中脑片段厚度约为0.5 mm。将取出的中脑片段放入第二个盛有新鲜1×HBSS的培养皿中。对每个胚胎重复此操作。
11. 在解剖显微镜下，将脑组织片段腹侧朝上放置。若脑膜仍附着，用镊子轻轻夹起并将其从脑组织上剥离去除。
12. 脑组织片段应可见四个明显的象限。将片段摆放成两个较小的上部象限位于两个较大下部象限之上。上部两个（较小）象限与下部两个（较大）象限之间有一明显脊状分界。
13. 用镊子夹住并分离上部象限与下部象限，弃去上部象限。剩余的下部象限在背侧外侧存在多余组织，该组织透明度较腹侧组织更低。去除密度较低的背侧组织并弃去。最终保留的组织片段应包含黑质致密部（SNc）和腹侧被盖区（VTA）。
14. 用镊子将剩余的腹侧组织片段切成4个小块，使用1 mL宽口移液器将其转移至含有1×HBSS的15 mL锥形管中。整个操作过程中，将装有脑组织片段的锥形管置于冰上保存。
15. 对所有剩余的脑组织片段重复上述操作。

4. 细胞解离

1. 细胞的酶消化
   1. 小心吸除含有中脑节段的15 mL锥形管中的HBSS，使节段留在管底。
   2. 向管中加入约800 µL木瓜蛋白酶溶液，放入37 °C培养箱中孵育7分钟。轻弹管壁重悬细胞，再放回37 °C培养箱继续孵育7分钟。
   3. 用宽口1 mL移液器吸头将中脑节段转移至含有1 mL DNase的等分试样中。让节段沉降至等分试样底部，或暴露约1分钟。
   4. 用宽口1 mL移液器吸头将中脑节段转移至含有2 mL终止液的15 mL锥形管中。待节段沉降至管底后，再在另一装有终止液的锥形管中重复清洗一次。
2. 细胞悬液的机械吹打
   1. 在第二次使用终止液清洗的管中，用宽口1 mL移液器吸头将细胞上下吹打10次，直至肉眼不可见大块组织片段。注意避免过度吹打，以尽量减少细胞裂解。
   2. 缓慢将300 µL的4% BSA溶液沿含有脑节段的15 mL锥形管管壁加入到底部。小心取出移液器吸头以维持悬液分层。在0.4 x g 条件下离心3分钟。然后小心吸除上清液，并将细胞重悬于400 µL细胞培养基中。

5. 细胞接种

注意：根据经验，每个胚胎可收集约 100,000 个活细胞。2-3 月龄的定时交配孕鼠通常每窝产仔 8-10 个胚胎；因此，每只定时交配孕鼠的细胞总收获量粗略估计约为 100 万细胞。

1. 使用血细胞计数板进行细胞计数，然后用细胞培养基将细胞悬液稀释至 2,000 个细胞/µL。轻轻吹打混匀。
2. 从培养箱中取出步骤 2 中涂有层粘连蛋白溶液的盖玻片，用真空泵吸除涂层盖玻片上残留的层粘连蛋白溶液。应迅速接种以避免盖玻片完全干燥。每张盖玻片上加入 100 µL 细胞悬液（含 2.0 × 10⁵ 个细胞），并将培养皿放入 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。
3. 小心向每个培养皿中加入 3 mL 细胞培养基，然后放回 37 °C 培养箱中。每周进行两次半量换液，持续 2 周。

6. 在14天体外培养（DIV）时用腺相关病毒（AAV）载体感染细胞培养物

1. 每皿准备 1 mL 无血清 DMEM 培养基，加入 1 µL hSyn-GCaMP6f AAV（滴度为 1.0 × 10¹³）
2. 吸除每皿中的细胞培养基，更换为含 hSyn-GCaMP6f 的 1 mL 无血清 DMEM 培养基。将培养皿放回 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。
3. 吸除含 AAV 的无血清培养基，更换为 3 mL 细胞培养基。将培养皿放回 37 °C 培养箱中继续培养。我们发现 AAV 感染 5–7 天可达到理想的 GCaMP 表达水平。在此病毒感染期间，每隔 2–3 天更换一次培养基。

7. 19-21 天体外培养（DIV）期间的活细胞共聚焦 Ca²⁺ 成像

注意：如步骤 6.3 中所述，可在病毒感染后 5-7 天进行成像。此时间窗口最适合观察到足以检测自发性 Ca²⁺ 活性的荧光蛋白表达水平。

1. 记录缓冲液的制备
   1. 配制1 L HEPES记录缓冲液：将9.009 g NaCl、0.3728 g KCl、0.901 g D-葡萄糖、2.381 g HEPES、2 mL 1 M CaCl₂储备液和500 µL 1 M MgCl₂储备液加入800 mL无菌蒸馏H₂O中，用NaOH调节pH至7.4，最后定容至1 L。
   2. 配制200 mL 20 µM谷氨酸记录缓冲液：将40 µL 100 mM谷氨酸储备液加入上述200 mL HEPES记录缓冲液中稀释。
   3. 配制200 mL 10 µM NBQX记录缓冲液：将200 µL 10 mM NBQX储备液加入200 mL HEPES记录缓冲液中稀释。
2. 共聚焦成像
   1. 向无菌35 mm培养皿中加入3 mL记录缓冲液。
   2. 从37 °C培养箱中取出含有感染细胞的35 mm培养皿，用精细镊子小心夹住盖玻片边缘，迅速将其转移至盛有记录缓冲液的培养皿中。将剩余的盖玻片放回培养基中，并重新放回37 °C培养箱。将装有记录缓冲液的培养皿运送至共聚焦显微镜。
   3. 启动成像软件，在软件初始化过程中进行下一步操作。
   4. 启动蠕动泵，将管路插入记录缓冲液中，调节流速至2 mL/min。
   5. 将感染的盖玻片从35 mm培养皿转移至记录浴槽中。
   6. 使用10倍水浸物镜和明场（BF）照明找到焦平面，并寻找神经元胞体密度较高的区域。切换至40倍水浸物镜，使用明场照明重新对焦样品。
   7. 在FluoView的“Dyes list”窗口中选择AlexaFluor 488并应用。
   8. AAV表达水平可能存在差异，因此为避免荧光染料过度曝光和光漂白，应从较低的高压（HV）和激光功率设置开始。对于AlexaFluor 488通道，将高压（HV）设为500，增益设为1x，偏移设为0；对于488 nm激光线，将激光功率设为5%。为增加z轴方向的有效成像体积，将针孔尺寸增大至300 µm。使用“focus x2”扫描模式，将发射信号优化调整至接近但未达到饱和的水平。在此基础上可进一步调整参数，直至各通道达到理想的可见度。
      注意：为准确捕捉GCaMP检测到的完整Ca²⁺通量范围，应调整基础HV和激光功率设置，使荧光强度上升时不会使探测器过饱和。
   9. 显微镜参数优化后，移动载物台，寻找多个细胞表现出GCaMP6f荧光自发变化的区域，并对焦至所需的成像平面。
   10. 使用“Clip rect”工具将成像帧裁剪至每帧间隔略小于1秒的尺寸，以实现每秒1帧的成像速率。
   11. 将“Interval”窗口设为1.0，“Num”窗口设为600。
       注意：为在指定时间点（300 s）更换不同的记录缓冲液，必须校准泵输送新溶液至浴槽的延迟时间。该延迟取决于灌流速率（2 mL/min）以及输送管路的长度。
   12. 选择“Time”选项，然后使用“XYt”扫描模式开始采集时间序列图像。
   13. 观察成像进度条，并在适当时间点（例如，若泵的延迟校准为60 s，则在第240帧时）将管路从HEPES记录缓冲液切换至20 µM谷氨酸记录缓冲液，以确保在300 s时输送谷氨酸。
   14. 成像完成后，点击Series Done按钮，保存完成的时间序列图像。继续用20 µM谷氨酸灌流5分钟，使培养的神经元总共暴露于谷氨酸10分钟。对每张待成像的盖玻片重复此过程。
   15. 在额外暴露于20 µM谷氨酸5分钟后，将盖玻片从浴槽中取出，放回含有记录缓冲液的35 mm培养皿中，直至完成当天所有成像。完成后，进入第8步。
3. Ca²⁺信号轨迹分析
   1. 在ImageJ中进行图像分析。安装ImageJ的BIO-FORMATS插件，以便打开.OIB图像文件。
   2. 在ImageJ工具栏中，点击分析 | 设置测量值，勾选“平均灰度值（MGV）”选项。
   3. 在ImageJ中以超堆栈（hyperstack）形式打开时间序列图像。
   4. 拖动图像滑块，找到谷氨酸反应最强的帧，以观察所有对谷氨酸有反应的神经元。使用多边形工具勾勒所有可见的神经元胞体，并将其感兴趣区域（ROI）添加至“ROI管理器”列表中。
   5. 完成所有ROI勾勒和添加后，在ROI管理器窗口中选中所有ROI，使用更多选项列表中的多测量功能。将这些数据复制粘贴至电子表格中。对所有待分析的图像重复此过程。
   6. 对每个ROI，使用公式ΔF/F₀ = [F(t) – F₀] / F₀将每帧的原始MGV数据转换为ΔF/F₀值，其中F(t)表示任意帧的MGV，F₀表示约10个无Ca²⁺通量的基线帧的平均MGV。
   7. 使用OriginPro 2020等统计软件，将转换后的ΔF/F₀轨迹绘制成线图。可使用“Peak analyzer”功能（或其它软件中的类似功能）测量谷氨酸反应的峰值幅度、对谷氨酸反应的潜伏期以及曲线下面积。

8. 培养物的免疫染色

注意：使用甲醛固定后，载玻片可置于 1x PBS 中于 4 °C 保存，直至准备进行免疫染色处理。一抗和二抗孵育按顺序依次进行，即先与抗Caspase-3一抗及其相应的二抗孵育，再进行抗TH一抗及其相应二抗的孵育。

1. 谷氨酸处理后，立即将盖玻片放回其35 mm培养皿中，吸除记录缓冲液，并加入3 mL 10%甲醛溶液。室温（RT）静置40分钟。
2. 用1×PBS洗涤培养皿3次。
3. 吸除PBS，加入含0.01% Triton X-100的PBS溶液1 mL，对细胞进行透化处理，持续2分钟。
4. 用1×PBS洗涤培养皿3次。
5. 吸除PBS，加入含10% NGS的PBS溶液1 mL，封闭细胞，室温孵育40分钟。
6. 用1×PBS洗涤培养皿3次。
7. 将1 µL兔抗Caspase-3一抗加入1 mL含1% NGS的PBS溶液中（1:1000稀释）。吸除培养皿中的PBS，替换为一抗溶液。置于摇床上，室温孵育1.5小时。
8. 用1×PBS洗涤培养皿3次。
9. 将1 µL goat anti-rabbit AlexaFluor 488二抗加入1 mL含1% NGS的PBS溶液中（1:1000稀释）。吸除培养皿中的PBS，替换为二抗溶液。置于摇床上，室温孵育1小时。此后所有步骤需避光操作。
10. 用1×PBS洗涤培养皿3次。
11. 重复步骤8.7–8.10，但在步骤8.7中使用鸡抗TH一抗（1:1000），在步骤8.9中使用goat anti-chicken AlexaFluor 594二抗 （1:1000）。
12. 最后一次PBS洗涤后，取30 µL封片剂滴加于显微镜载玻片上。用镊子从35 mm培养皿中取出盖玻片，使细胞面朝下置于封片剂中。若放置得当，两个盖玻片可同时置于同一张载玻片上。将载玻片置于干燥、避光环境中，静置过夜使封片剂完全干燥。

9. 免疫染色培养物的共聚焦成像

1. 共聚焦成像
   1. 启动成像软件，将样品放置在显微镜载物台上。
   2. 通过显微镜目镜，使用20倍物镜和配备TRITC滤光片的落射荧光光源，对样品进行调焦并寻找TH阳性（TH+）细胞体。
   3. 一旦定位到TH+细胞体，将其置于视野中央，然后切换至60倍物镜。
   4. 在“染料列表”窗口中选择AlexaFluor 488和AlexaFluor 594染料。
   5. 与活体成像相同，初始设置应采用较低的高压（HV）、增益（gain）、偏移（offset）和激光功率，以防止光漂白。使用“focus x2”扫描模式评估各通道的荧光强度，并相应调整。由于后续需对荧光强度进行定量分析，因此必须保持所有视野的成像参数一致。建议先观察每种条件下若干样本，以了解荧光强度的总体范围。
   6. 确定最佳成像参数后，选择“focus x2”扫描模式，将目标细胞移至视野中央，并通过“zoom”滑块将数字放大倍数调整为3倍。
   7. 使用调焦旋钮找到荧光信号最强的焦平面，采集单层XY图像，保存图像后完成操作。
   8. 切换回20倍物镜继续寻找下一个TH+细胞。重复此过程，直至从每种条件下采集到所需数量的细胞。
2. 图像分析
   1. 在ImageJ工具栏中，点击 分析 | 设置测量值，勾选“面积”、“积分密度”和“平均灰度值”选项。
   2. 通过拖放图像至ImageJ工具栏或通过文件菜单打开图像，将其作为多通道超堆栈（hyperstack）打开，各通道将自动分离。
   3. 使用TH通道（594 nm）在细胞体周围绘制感兴趣区域（ROI）。在ImageJ中使用多边形追踪工具，紧密贴合细胞体外缘进行勾画；在细胞膜与细胞核间距最短处，画一条穿过胞浆至核边缘的直线，然后紧密沿核轮廓勾画以将其排除；再画一条直线返回至外膜，尽可能贴近初始线，最后继续沿细胞体轮廓勾画直至闭合ROI。
   4. 使用键盘快捷键“T”或通过工具栏菜单路径 分析 | 工具 | ROI管理器，打开ROI管理器，并将刚绘制的ROI添加至列表中。
   5. 选择caspase-3通道（488 nm）的图像窗口，然后在“ROI管理器”列表中选择已添加的ROI。
   6. 在 ROI管理器 窗口中点击 测量 按钮，结果窗口将显示先前设定的测量数据。将数据复制至电子表格中，并对每个细胞重复此过程。

结果

在细胞初始培养后，我们在14天体外培养（DIV）时，向VM培养皿中加入1 µL AAV hSyn-GCaMP6f，并给予5天的病毒表达时间。成像当天，新鲜配制HEPES记录缓冲液。实验采用两种处理条件：一种条件为施加20 µM谷氨酸持续10分钟；另一种条件为先施加10 µM NBQX持续5分钟，随后共施加10 µM NBQX和20 µM谷氨酸持续10分钟。在两种条件下，均观察到GCaMP6f荧光信号的异质性和自发性变化，表明存在自发的Ca²⁺活动。²⁺ 通量，如代表性轨迹图所示（图1A，B, 补充视频 1-2）。应用 20 µM 谷氨酸可引发强烈且持续的 Ca²⁺ 在自发活跃和静息状态的神经元中均产生反应（图1A, 补充影片 1）。应用10 µM NBQX可降低自发性活动，并部分阻断谷氨酸反应（图1B, 补充视频 2). 谷氨酸处理刺激Ca²⁺ 每种条件下的反应通过曲线下面积、峰值幅度和反应潜伏期进行量化。谷氨酸处理组与NBQX + 谷氨酸处理组在曲线下面积和峰值幅度上均相似。图1C），而NBQX + 谷氨酸条件下反应潜伏期显著延长（图2A，B). 除了定量测定 Ca²⁺ 为检测对谷氨酸处理的反应，我们使用抗caspase-3抗体对样本进行固定和染色，以评估谷氨酸介导的细胞凋亡。在不同条件下观察到不同程度的caspase-3激活图3A，B）。通过测量面积和平均caspase-3强度来量化caspase-3的激活。与未处理的对照细胞相比，在谷氨酸以及NBQX + 谷氨酸处理条件下，发生caspase-3激活的细胞平均面积趋于显著性差异（图3B）。与未处理的对照组相比，谷氨酸组及NBQX+谷氨酸组的平均caspase-3强度显著升高（图3B）。综上所述，这些结果展示了一个高内涵分析框架，可通过定量Ca²⁺ 对兴奋性毒性物质的反应，并在同一批培养细胞中进一步分析下游凋亡事件，例如caspase-3的激活。

图1：培养的腹侧中脑神经元表现出自发性Ca²⁺活动，并可被谷氨酸强烈激活。（A）腹侧中脑（VM）神经元的自发性Ca²⁺活动及其对20 µM谷氨酸刺激的响应的代表性轨迹。（B）腹侧中脑（VM）神经元的自发性Ca²⁺活动及其对10 µM NBQX + 20 µM谷氨酸刺激的响应的代表性轨迹。（C）群体数据分析显示Ca²⁺轨迹曲线下面积和峰值振幅。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：使用NBQX阻断AMPAR可延迟培养的腹侧中脑神经元对谷氨酸刺激的反应。（A）由谷氨酸（灰色）和NBQX+谷氨酸（蓝色）诱发的Ca²⁺信号代表性曲线。谷氨酸（黑色）和NBQX+谷氨酸（红色）的平均Ca²⁺信号曲线重叠显示。（B）群体数据展示谷氨酸与NBQX+谷氨酸诱发反应的反应潜伏期。右侧图示显示谷氨酸与NBQX+谷氨酸条件之间的百分比变化。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：谷氨酸处理可增加酪氨酸羟化酶（TH）阳性腹侧中脑神经元中caspase-3的表达。（A）腹侧中脑（VM）培养物的代表性共聚焦图像，经caspase-3（绿色）和TH（红色）免疫染色，比例尺 = 10 µm。（B）群体数据分析，显示各实验条件下多巴胺能神经元的面积及caspase-3表达的平均灰度值。请点击此处查看该图的放大版本。

补充视频1：自发性Ca²⁺活动及对谷氨酸施加的反应。
在HEPES记录缓冲液存在下记录的自发性Ca²⁺波动（0–300秒），随后施加20 µM谷氨酸（301–600秒）。比例尺 = 50 µm。请点击此处下载该视频。

补充视频2：自发性Ca²⁺活动及对NBQX + 谷氨酸应用的反应。
在HEPES记录缓冲液存在下记录自发性Ca²⁺波动（0–300秒），随后应用10 µM NBQX（301–600秒），以及10 µM NBQX + 20 µM谷氨酸（601–900秒）。比例尺 = 50 µm。请点击此处下载该视频。

讨论

我们描述了一种长期原代腹侧中脑（VM）细胞培养系统，用于对谷氨酸介导的神经元凋亡进行高内涵分析。已有研究采用原代中脑多巴胺能神经元培养体系，以阐明帕金森病（PD）模型背景下兴奋性毒性的作用机制^11,12。在本研究中，我们采用一种组合方法，利用基因编码的钙离子指示剂（GECIs）检测Ca²⁺活性，并进一步将该活性与下游分子变化（如凋亡信号级联的启动）相关联⁴。该方法相较于其他类似的细胞培养系统具有多项优势。由于我们特别关注帕金森病背景下的兴奋性毒性，使用原代VM细胞培养体系尤为理想。通过采用不同的视野重定位技术，例如带网格的盖玻片或结合酪氨酸羟化酶（TH）免疫染色的电动XY显微镜载物台，我们能够直接研究谷氨酸介导的凋亡在腹侧中脑神经元中对特定细胞类型的效应。此外，为期三周的细胞培养模型使神经元能够发育出完整且成熟的分子特征，更接近成年多巴胺能（DA）神经元⁹。以往的方法主要集中在谷氨酸介导的兴奋性毒性后发生的分子变化^13,14。本模型的独特之处在于，能够在已鉴定的细胞类型中将神经元生理的急性变化与下游分子事件进行关联分析。该原代培养模型的一个局限性在于，解剖技术获取的是整个腹侧中脑区域，其中包括多巴胺能神经元和GABA能神经元，以及来自黑质致密部（SNc）和腹侧被盖区（VTA）的神经元。现有证据表明，与邻近VTA的多巴胺能神经元相比，SNc的多巴胺能神经元对钙离子具有选择性易损性，并更易发生最终的细胞死亡¹⁵。遗憾的是，在胚胎期培养体系中区分SNc与VTA来源的神经元一直存在困难，因胚胎脑中可用于界定这些结构的解剖学标志极少。

我们证明，原代培养技术可用于量化异质性自发性Ca²⁺ 活性（图1因此，这是一个研究持续活跃细胞的理想细胞培养系统模型，例如中脑的起搏型多巴胺能神经元、新皮层神经元以及视交叉上核（SCN）的GABA能神经元。^16,17. 在大多数应用中，Ca²⁺ 成像技术无法达到电生理学相同的 temporal 分辨率。因此，单个 Ca²⁺ 事件类似于神经元动作电位的爆发。这可以解释为 Ca²⁺ 成像技术能够相对准确地测量起搏细胞中的异常爆发样电活动，因此适用于钙信号相关的高内涵筛选^2+-介导的兴奋性毒性细胞死亡。

为了实现并维持细胞的自发性 Ca²⁺ 活动，实验方案中需重点关注两个关键点。第一是解剖后细胞的接种密度。对于原代腹侧中脑（VM）神经元，以往研究通常采用约 100,000 个细胞/cm² 的密度^9,10。我们已对该方案进行调整，将接种密度设为 200,000 个细胞/cm²，这能够产生多样化的自发性活动模式，并增加每张盖玻片上多巴胺能 VM 神经元的数量。由于不同起搏神经元具有不同的放电特性¹⁶，因此接种密度需根据所研究的细胞类型进行个性化设置，并优化至理想的自发性活动水平。第二点是腺相关病毒（AAV）感染后的孵育时间。与接种密度类似，该时间取决于具体的研究问题及所使用的 AAV 类型。对于本实验中使用的特定 AAV，病毒感染后孵育 5 天可达到理想的蛋白表达水平，从而实现 GCaMP 荧光的动态变化，以便记录 Ca²⁺ 活动。多种因素会影响 AAV 表达其携带蛋白的速度和效率，其中许多因素超出了本方法的范围；但简要而言，需重点考虑启动子活性以及目的蛋白成熟和折叠的速率。

该方法的另一个优势在于，它在实验设计、表达载体、成像设备的使用以及可解决的科学问题范围方面具有相当大的灵活性。此外，该方法可用于探究围绕帕金森病（PD）中谷氨酸介导的兴奋性毒性以及其他神经系统功能障碍模型的一系列具体问题。例如，谷氨酸介导的兴奋性毒性涉及多种受体和信号级联反应⁵。通过使用该方法，并如图1中AMPAR阻断剂NBQX所示，可以在生理学和分子水平上解析兴奋性毒性谷氨酸反应的特定组分。理论上，采用第二信使系统的抑制剂进行类似实验，可用来确定这些通路对兴奋性毒性的贡献。此外，本研究中使用的AAV可被改造，以在细胞特异性启动子驱动下表达GECIs ，或表达AAV介导的光遗传学传感器，用于检测其他参数，如神经递质的释放。

除了初级胚胎解剖和共聚焦成像外，本实验方案的大部分步骤均使用基础的实验室技术，无需特殊培训。因此，该模型的局限性主要包括胚胎解剖技术的难度、细胞培养至成熟所需的时间较长，以及需要具备共聚焦显微镜或类似的成像设备。尽管存在这些限制，该方法的诸多优势和灵活性仍远超其不足，使其成为研究谷氨酸介导的兴奋性毒性在神经系统疾病中作用的理想模型。最后，该模型还可作为有效工具，用于筛选具有抗凋亡效应及能够维持多巴胺能神经元健康的新化合物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 甲醛/PBS	VWR	100496-506
10倍物镜，数值孔径（NA）0.3，水浸式	Olympus	UMPLFLN10XW
12 mm 圆形盖玻片，1号	Phenix Research Products	MS20-121
20倍物镜，数值孔径（NA）0.85，油浸式	Olympus	UPLSAPO20XO
35 mm 未包被塑料细胞培养皿	VWR	25382-348
40倍物镜，数值孔径（NA）0.3，水浸式	Olympus	LUMPLFLN40XW
60倍物镜，数值孔径（NA）1.35，油浸式	Olympus	UPLSAPO60XO
氨苄青霉素（钠盐）	Gold Bio	A-301-25
B-27 添加剂	ThermoFisher	17504044	50倍储存液
双目光学显微镜	Kent Scientific	KSCXTS-1121
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A7030
氯化钙（CaCl2），无水	Sigma-Aldrich	746495
鸡多克隆抗酪氨酸羟化酶抗体	Abcam	ab76442
脱氧核糖核酸酶 I（DNase）	Sigma-Aldrich	DN25
D-葡萄糖，无水	Sigma-Aldrich	RDD016
DMEM + GlutaMAX 培养基	ThermoFisher	10569010	500 mL
马血清	ThermoFisher	26050088	热灭活
光纤照明系统，100V	Kent Scientific	KSC5410
滤器系统，PES 22 µm 250 mL	VWR	28199-764
Fluoview 1000 共聚焦显微镜	Olympus
Fluoview 1200 共聚焦显微镜	Olympus
GlutaMAX 添加剂	ThermoFisher	35050061
山羊抗鸡 Alexa Fluor 594 多克隆抗体	Abcam	ab150176
山羊抗兔 Alexa Fluor 594 多克隆抗体	Abcam	ab150077
1倍汉克平衡盐溶液（HBSS）	ThermoFisher	14175095	500 mL
HEPES	VWR	101170-478
HeraCell 150 CO2 培养箱	Heraeus (ThermoFisher)
ImageJ v1.52e	NIH
IRIS 细剪刀（圆头型）-不锈钢直剪，31×8 mm，13 cm	RWD	S12014-13
卡那霉素单硫酸盐	Gold Bio	K-120-25
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020
L-抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A7506
L-谷氨酸	VWR	97061-634
氯化镁（MgCl2），无水	Sigma-Aldrich	M8266
MPII 微型蠕动泵，115/230 VAC，50/60 Hz	Harvard Apparatus	70-2027
MULLER 显微镊子-直头，0.15 mm 尖端，11 cm	RWD	F11014-11
NBQX	Hello Bio	HB0443
Neurobasal 培养基	ThermoFisher	21103049	500 mL
正常山羊血清（NGS）	Abcam	ab7481
Origin 2020	OriginLab
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	Addgene	100837-AAV1	滴度：1.00E+13 gc/mL
木瓜蛋白酶	Worthington Biomedical Corporation	LS003126
青霉素-链霉素	ThermoFisher	15140122	10,000 U/mL
1倍磷酸盐缓冲液（PBS）	ThermoFisher	10010049	500 mL
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P4832
聚-L-鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P4957
氯化钾（KCl），无水	Sigma-Aldrich	746436
MPII 泵头管路组件	Harvard Apparatus	55-4148
兔单克隆抗caspase-3抗体	Abcam	ab32351
氯化钠（NaCl），无水	Sigma-Aldrich	746398
蔗糖	Sigma-Aldrich	S7903	BioXtra，≥99.5%（GC）
妊娠雌性 C57BL/6 小鼠	Texas A&M Institue for Genomic Medicine
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	500 mL
宽口蓝色 P1000 移液器吸头	VWR	83007-380