利用胸苷类似物BrdU分析大鼠细胞增殖与神经发生的免疫组织化学技术

摘要

本文介绍了四种最常用的可视化BrdU阳性细胞的技术，用于检测大鼠中的成年神经发生。本研究包括试剂制备、胸苷类似物给药、经心脏灌注、组织制备、过氧化物酶免疫组织化学反应、免疫荧光、信号放大、复染、显微镜成像以及细胞分析的操作说明。

摘要

在成年海马神经发生（AHN）研究领域中，最重要的环节之一是识别新生成的细胞。胸苷类似物（如5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU））的免疫检测是一种用于可视化这些新生细胞的标准技术。因此，通常通过腹腔注射将BrdU注入小型动物体内，使该胸苷类似物在DNA合成过程中掺入正在分裂的细胞中。随后通过脑切片的免疫组织化学分析进行检测。每一个使用过该技术的研究团队都清楚，要获得成功的染色结果，必须对每一个细微步骤给予特别关注。例如，一个关键步骤是使用盐酸（HCl）进行DNA变性，以使抗体能够进入细胞核并实现染色。然而，现有的科学文献中对此类步骤的详细描述极为有限。因此，对于新建立的实验室而言，标准化该技术具有挑战性，往往需要数月时间才能获得阳性且成功的实验结果。本研究的目的是详细描述并阐明在使用胸苷类似物BrdU进行免疫染色时，如何获得阳性且成功结果的具体操作步骤。该实验方案包括试剂的配制与准备、胸苷类似物在啮齿类动物体内的给药、经心脏灌注、组织处理、过氧化物酶免疫组织化学反应、亲和素-生物素复合物的使用、免疫荧光染色、复染、显微镜成像以及细胞分析。

引言

数十年来，成年人大脑在生命全程中持续生成新神经元的观点一直令科学界着迷。科学家通过检测处于分裂状态的细胞，获得了大脑在其整个生命周期中都能产生新神经元的知识^1,2。最早通过向大鼠颅内注射氚标记的胸腺嘧啶（thymidine-H3），并利用放射自显影技术检测细胞周期中的细胞，首次证实了成年大脑中新生成神经元的存在^1,2。当时报告了胶质细胞的分裂以及神经母细胞的存在，这是关于出生后神经发生现象的首批令人鼓舞的数据¹。然而，thymidine-H3 的使用和检测涉及放射性物质，可能对操作人员造成危害。1988年，Miller 和 Nowakowski 首次探讨了溴脱氧尿苷（BrdU）免疫组织化学法在研究神经系统细胞增殖、迁移及来源方面的适用性³。1998年，Eriksson 及其同事发表了一篇论文，显示在生前注射过5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）的成年患者死后大脑中可观察到新生神经元⁴。这些患者因标记肿瘤生长而接受了 BrdU 注射（250 mg 静脉注射）⁴。该技术随后被引入动物模型研究。这些方法的引入标志着该领域的一个里程碑，因其使得无需使用放射性化合物即可检测新生成的细胞。这一技术逐渐成为衡量成年大脑特定微环境中细胞增殖的金标准，推动了该领域后续研究的深入发展。

胸苷类似物技术的局限性在于，它无法确定新生成细胞的细胞身份。然而，免疫组织化学技术使我们能够对同一细胞进行双重或三重标记，从而验证新生成细胞的细胞命运及其成熟阶段，推动了该领域的进一步发展。该方法可用于区分新生成的细胞是胶质细胞、未分化的神经元，还是完全成熟的颗粒细胞，甚至可判断这些细胞是否积极参与神经环路活动。该领域另一项突破是利用转基因模型来鉴定巢蛋白（nestin）调控区域内的未分化细胞。nestin-GFP 转基因小鼠表达增强型绿色荧光蛋白（GFP），该蛋白受 nestin 启动子调控。Nestin 是一种中间丝蛋白，是前体细胞的特征性标志物⁵。nestin-GFP 转基因小鼠有助于揭示神经发生过程中早期发育阶段的机制⁶。然而，一个显著的局限性在于，维持 nestin-GFP 转基因小鼠品系需要在实验室设施中提供特殊条件，这对部分科研团队（尤其是来自发展中国家的团队）而言成本较高，难以长期维持。

上述技术各有优缺点。然而，迄今为止，通过免疫组织化学（IHC）鉴定增殖细胞，并结合免疫荧光技术进行双标或三标以识别细胞成熟阶段或细胞命运，仍是检测成体神经发生的最可行方法。免疫组织化学的鉴定过程包括使用特异性抗体标记蛋白质、蛋白质结构域或核苷酸，此类抗体被称为一抗，可特异性识别目标分子。一抗随后被二抗识别，二抗通常偶联有显色剂（如辣根过氧化物酶）或荧光染料（如FITC）。显色剂和荧光染料的信号均可通过显微镜检测。利用IHC技术，可鉴定膜蛋白、细胞骨架蛋白或核内成分（如BrdU）。另一方面，BrdU在S期可竞争性地掺入DNA中，因此存在于细胞核内。一个关键步骤是使用HCl进行DNA变性，以打开DNA双链，使BrdU抗体能够接触到DNA中的BrdU。必须注意的是，BrdU在小鼠和大鼠血清中达到饱和浓度的时间分别为腹腔注射后15分钟和60分钟，随后迅速下降，并在60分钟和120分钟时降至无法检测的水平⁷。

本文介绍了四种不同但密切相关的免疫组化（IHC）技术：使用辣根过氧化物酶（HRP）与DAB（3,3'-二氨基联苯胺）反应进行的无信号放大显色间接检测法（步骤4.1）、亲和素-生物素复合物（ABC）放大法（步骤4.1）、无信号放大的间接免疫荧光检测法（步骤4.4），以及标记链霉亲和素-生物素（LSAB）放大法（步骤4.3）。每种方法各有优缺点，适用于特定的组织需求（见表1）。我们选择采用间接免疫组化方法，因其成本较低且操作简便，尤其在使用未标记的一抗时，可灵活地在显色与荧光检测方法之间转换。HRP方法是一种常用的IHC技术，因其成本低、稳定性高、催化 turnover 速率快，且底物易于获取。然而，我们建议使用阳性对照以确认染色方法的准确性，并使用阴性对照以有效验证抗体的功能。多重免疫染色或多重IHC方法（见步骤6）是单次实验中从组织切片获取大量数据的有力工具，当样本数量有限时，该技术尤为重要。另一优势在于可在保持组织完整性的前提下，同时鉴定在同一细胞区域内共表达的特定蛋白。多重染色可标记在特定增殖阶段表达的不同标志物（如nestin、GFAP、DCX、Ki-67），从而实现更深入的增殖与分化研究⁸。选择与所用固定方法兼容的抗体至关重要，以避免交叉反应。我们建议对每种新抗体（包括BrdU）单独进行测试，以优化和调整实验条件。随后进行双标顺序染色，最终在完全掌握顺序染色方法后，再开始同步免疫染色流程。为此方法选择合适的二抗尤为关键。

间接检测法	具体方法	优点	缺点
间接检测法	辣根过氧化物酶与DAB反应	1. 比直接检测法和间接荧光法具有更高的灵敏度。 2. 比荧光染料具有更强的抗光漂白能力。 3. 比荧光检测法成本更低	1. 使用较少颜色染料时，多重检测较为困难。 2. 对于在同一细胞空间中共表达的靶标，检测较为复杂。 3. 在同一组织上同时检测丰度差异较大的靶标时，动态范围受限。
	荧光法	1. 使用多种颜色染料进行多重检测时效果最佳且最简便。 2. 最适合检测在同一细胞空间中共表达的靶标。 3. 在同一组织上同时检测丰度差异较大的靶标时，具有更优的动态范围。 4. 无需额外步骤。	1. 灵敏度低于DAB辣根过氧化物酶间接反应法。 2. 随时间推移抗光漂白能力较弱。 3. 成本更高。
信号放大法	亲和素-生物素复合物法（ABC）	1. 比直接和间接检测法具有更高的灵敏度。 2. 可降低背景信号	1. 需要额外步骤。 2. 比无信号放大法更昂贵。
	标记链霉亲和素-生物素法（LSAB）	1. 比直接和间接检测法具有更高的灵敏度。 2. 比ABC法具有更强的组织穿透能力。 3. 可降低背景信号	1. 需要额外步骤。 2. 比ABC法更昂贵。
	无额外信号放大法	1. 成本较低。 2. 无需额外步骤。 3. 适用于高丰度靶标检测。	1. 灵敏度较低：对低丰度靶标检测存在困难。

表1：免疫组化（IHC）技术的优缺点。 本表列出了间接检测方法（辣根过氧化物酶反应显色法（3,3'-二氨基联苯胺，DAB）和荧光法）以及信号放大方法（亲和素-生物素复合物法（ABC）、标记链霉亲和素-生物素法（LSAB））的优缺点，并包含无额外信号放大方法的比较。

高分辨率图像对于进行准确分析和展示结果至关重要。提高分辨率有两种方法：1）采用更先进的显微镜设计（例如共聚焦显微镜、多光子显微镜）；2）通过去卷积在数值上逆向还原模糊过程，从而增强图像⁹遗憾的是，由于设备及其维护成本高昂，共聚焦显微镜难以普及。¹⁰宽视野落射荧光显微镜结合z轴层扫图像的后续去卷积处理，为共聚焦显微镜提供了一种合适的低成本替代方案^8,9如上所述，反卷积的目的是恢复被采集系统削弱的原始信号⁹通过使用数学去卷积算法，减少由落射荧光显微镜或共聚焦显微镜获取的图像中的模糊、离焦晕影和畸变¹⁰获取到的模糊图像可以通过数学建模，表示为观测对象与三维点扩散函数（PSF）卷积的结果。PSF 是指显微镜收集的组织样本所发射的点光源的理论衍射图样。PSF 文件需根据每幅图像的具体条件创建，例如相机的 CCD 像元间距、介质的折射率、物镜的数值孔径、荧光染料的发射波长、图像尺寸、z 轴层析成像中图像的数量及其间距（详见技术规格说明） 表2换句话说，PSF 文件总结了成像系统对显微镜观测结果的影响⁹然而，我们使用衍射点扩散函数3D插件（Diffraction PSF 3D Plugin，https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D）为每幅z层堆栈图像创建特定的PSF文件。z层堆栈图像是在同一载玻片XY位置上、沿定义深度（z轴）采集的一系列数字化光学切片。计算机通过重新分配来自其他焦平面物体的信号，整合来自焦平面的信息以生成图像。为生成z层堆栈图像，需从载玻片的不同焦层采集图像（例如，同一XY区域每隔1 μm深度采集一幅图像，共十幅）。随后，我们使用显微镜制造商提供的软件或Fiji软件生成z层堆栈或三维图像。最终结果为单个堆栈图像文件（例如，十幅具有不同焦平面的图像）。目前存在多种面向用户的工具和软件解决方案，例如用于去卷积显微成像的开源软件。我们将展示使用DeconvolutionLab2进行去卷积处理的结果⁹ 即 Fiji¹¹ 插件（ImageJ 的分发版本）¹²）。去卷积将有助于提高最终显微图像的分辨率（参见 图1B，C ）。如需进一步信息和指导，我们强烈建议阅读参考文献¹³.

图1：多色通道三维去卷积的代表性图像。（A）低倍镜下的齿状回（DG）。（B）各通道的原始 z 轴层叠图像及合并图像。（C）各通道及合并图像的三维去卷积 z 轴层叠图像。该脑组织来自属于运动组的大鼠。采用标记链霉亲和素-生物素（LSAB）扩增法。结果显示：Cy3 标记的链霉亲和素偶联抗体用于指示 BrdU（红色），DAPI 作为复染剂（蓝色），胶质纤维酸性蛋白（GFAP）作为星形胶质细胞标记物（绿色）。ML = 分子层；GCL = 颗粒细胞层；SGZ = 颗粒下区。 请点击此处查看该图的放大版本。

本研究的目的是详细描述免疫染色获得阳性且成功结果的各个步骤，并列出基于BrdU研究中常用的实验流程，且无需使用共聚焦显微镜。BrdU染色是一种需要多个步骤的技术，必须严格遵循每一步操作才能获得成功的染色结果。通常，标准化这些染色技术需要数月时间，并耗费大量时间和资源。我们预期本文可为刚进入该领域的研究团队提供有用信息，从而减少实验耗时和错误。

方案

所有操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物编号 8023，1978 年修订版）以及墨西哥当地法律，以尽量减少实验动物的使用数量并减轻其痛苦。本研究中动物实验方案已获得伊比利亚美洲大学伦理委员会批准。

1. 试剂准备与实验设置

注意：除非另有说明，大多数溶液可在使用前数天配制。

1. BrdU 溶液
   1. 从 -20 °C 冰箱中取出 BrdU 溶液，置于室温（RT）平衡。
   2. 根据大鼠体重计算所需 BrdU 的质量，剂量为 50 mg/kg。计算所需 0.9% 生理盐水溶液（100 mL 无菌 H₂O 中含 0.9 g NaCl）的体积₂O）配制20 mg/mL工作液所需量。应准备过量，确保每只大鼠每次注射至少有0.5 mL。
      注意：给予实验动物的剂量应安全，副作用最小且有效。已有报道指出，与50 mg/kg剂量相比，100 mg/kg BrdU的染色持续时间优势不足以抵消其潜在的较高毒性⁷. BrdU标记细胞数/mm之间未发现显著差异³ 腹腔注射大鼠50和100 mg/kg⁷建议注射较小剂量，以尽量减少动物的痛苦。
   3. 称取 BrdU 溶液，加入锥形管中的生理盐水中，涡旋混匀。
      注意：对于体积大于1 mL的生理盐水溶液，需在水浴中预热至45‒50 °C。
   4. 将试管置于50 °C水浴中10‒15分钟，每2‒3分钟涡旋一次，直至完全溶解。使用注射器滤器过滤溶液，以实现无菌注射。用锡箔纸包裹试管，在室温下冷却，并立即使用。
      警告：BrdU 溶液具有毒性，且可能具有致癌性。应在通风橱中配制。操作 BrdU 溶液时必须使用适当的个人防护装备（PPE）。建议在使用前即刻配制溶液，但该溶液在室温下可稳定保存 24 小时。请避光保存。
2. 配制 1 L pH 7.4 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS），加入 240 mg 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）₂PO₄)，1.44 g 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄)，200 mg 氯化钾（KCl）和 8 g 氯化钠（NaCl）加入 800 mL 双蒸水（ddH₂O）中，持续搅拌。调节pH至7.4，加入双蒸馏H₂加水至终体积1 L。4 °C保存，可稳定存放长达1周。
3. 在100 mL PBS+中，向0.1 M PBS（pH 7.4）加入3%（3 mL）正常马血清和0.3%（300 µL）Triton X-100。分装为20‒50 mL等份，于-20 °C保存，最长可保存3个月。
   注意：也可使用 TBS 代替 PBS。任何与抗体宿主和实验组织不同的血清均可使用。
4. 在100 mL的0.1 M PBS（pH 7.4）中加入10%（10 mL）正常马血清和0.3%（300 µL）Triton X-100，配制成PBS++。分装为20‒50 mL等份，于-20 °C保存，可使用长达3个月。
5. 配制1 L冷冻保护液：将250 mL乙二醇与250 mL甘油混合，持续搅拌至均匀。缓慢加入PBS定容至1 L。使用4号（20‒25 μm）滤纸过滤。4 °C或室温下保存，有效期最长1年。
6. 配制4%多聚甲醛（PFA溶液）于0.1 M PBS中的方法如下：配制1 L溶液时，将40 g多聚甲醛粉末缓慢加入800 mL温度为60‒65 °C的0.1 M PBS中，持续搅拌。在控制温度（60‒65 °C）的条件下搅拌，直至多聚甲醛完全溶解。如有需要，可加入数滴1 M NaOH以澄清溶液。当溶液冷却至室温后，使用4号（20–25 μm）滤纸过滤。
   警告：多聚甲醛有毒，且可能具有致癌性，需在通风橱中配制。4 °C 保存，建议在2天内使用完毕。多聚甲醛即用型溶液可 commercially available。
7. 配制 1 L pH 6 的 10 mM 柠檬酸钠缓冲液（SCB），将 1.204 g 柠檬酸钠（二水合物）和 1.134 g 柠檬酸加入 800 mL 双蒸水（H₂O）中₂在持续搅拌下。调节pH至6.0，并加入ddH₂O₂最多加水至1 L，4 °C保存，最长可保存6个月。
8. 通过将 8.25 mL 的 12 N HCl（浓储备液）缓慢加入 41.75 mL 的 ddH₂O 中，配制 50 mL 的 2 N HCl₂在持续搅拌下。
   注意：在通风橱中配制。溶液必须在使用前立即配制。
   注意：将使用2 N HCl进行DNA变性，这是关键步骤。由于BrdU已掺入DNA中，使用HCl可打开DNA的化学键，使BrdU抗体能够接触到DNA中的BrdU。
9. 按如下步骤配制内源性过氧化物酶阻断液：将 2 mL 30% 过氧化氢与 98 mL ddH₂O 混合，配制成 100 mL 0.6% 过氧化氢溶液。₂在持续搅拌下。
   注意：该溶液必须在使用前立即配制。避光保存，因为 H₂O₂ 对光敏感。可使用 PBS 或 TBS 代替水。
10. 根据制造商说明书配制亲和素-生物素复合物（ABC）溶液。每5 mL 0.1 M PBS中，加入2滴（≈100 µL）试剂A并混匀，然后加入2滴（≈100 µL）试剂B并混匀。
    注意：溶液必须在使用前配制，并翻滚搅拌20‒30分钟。
11. 使用试剂盒，按照制造商说明书配制DAB（二氨基联苯胺）过氧化物酶（HRP）底物。向5 mL ddH₂O中加入试剂盒组分，混匀备用。₂O，加入2滴（≈ 84 µL）试剂1并混匀，加入4滴（≈ 100 µL）试剂2并混匀，然后加入2滴（≈ 80 µL）试剂3并混匀。最后，如需要，加入2滴（≈ 80 µL）试剂4（镍）并混匀。
    注意：溶液必须在使用前立即配制。
    警告：DAB 具有毒性且可能具有致癌性。必须小心操作，并根据各机构的危险废物处理规定进行处置。为使 DAB 失活，可加入数滴漂白剂（次氯酸钠）；溶液将变为黑色。
12. 通过将100 mg醋酸焦油紫和250 μL乙酸加入80 mL ddH₂O中，配制100 mL焦油紫溶液₂在55‒60 °C下操作。调节体积至100 mL，过滤后置于避光容器中，4 °C保存。
    注意：建议用户在对珍贵的组织样本进行染色前，先测试不同浓度的焦油紫溶液。某些组织样本复染后着色可能较深，这会影响对BrdU阳性细胞计数的准确性。

2. 胸腺嘧啶类似物BrdU的给药

1. 固定实验动物（例如，90日龄、体重350 g的雄性Wistar大鼠），通过固定其下腹部区域实现。
2. 使用23 G针头和1 mL注射器，经腹腔注射（i.p.）给予BrdU溶液（50 mg/kg）。
   注意：根据动物体重调整注射体积。对成年大鼠可使用23‒27 G针头及1‒5 mL注射器。成年大鼠腹腔注射的最大耐受体积为10 mL。BrdU溶液可通过不同途径给予¹⁴，例如腹腔注射或通过饮水口服给药。

3. 组织制备

注意：将三个月大的大鼠自由接触转轮活动七天。在第6天，大鼠注射BrdU（步骤2）3次，每次间隔12小时。末次BrdU注射8小时后，进行第3部分的操作步骤。

1. 腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg），等待数分钟直至动物深度麻醉。
   注意：继续操作前务必确认动物已完全麻醉。可轻轻夹捏其一条腿或尾巴进行测试。若动物对刺激有反应，则需再等待数分钟；若无反应，即可进行下一步。
2. 剪开胸骨下方腹腔皮肤，分离肋骨并剪开膈肌，暴露心脏。
3. 经心灌流固定
   1. 将针头插入左心室，并在右心房处做一小切口。通过泵或重力驱动，以0.1 M PBS溶液进行灌流（流速5‒7 mL/min），直至血液完全排出，流出液变澄清。
   2. 继续使用泵或重力驱动，以PFA溶液进行低温灌流（流速5‒7 mL/min），直至尾部变得僵硬。
      注意：通常一只300 g的大鼠约需100‒150 mL PFA溶液。组织固定为可选步骤，可通过此方法获取脑组织用于多种实验，从而减少实验中动物的使用数量。
4. 解剖与后固定
   1. 将动物断头，轻柔地从颅骨中取出脑组织。将脑放入含有PFA溶液的锥形管中（250 g大鼠约需40 mL），于4 °C下浸泡1‒2天。
      注意：避免过度固定（超过48 h），否则可能导致抗原不可用，从而影响组织染色效果。
   2. 配制100 mL 30%蔗糖溶液：在70 mL 0.1 M PBS溶液中加入30 g蔗糖，持续搅拌溶解后，再用0.1 M PBS定容至100 mL。将脑组织置于含30%蔗糖溶液（35 mL）的锥形管中，于4 °C下浸泡约1‒2天，直至脑组织沉入管底。
5. 切割冠状面脑切片
   注意：使用冷冻切片机（cryostat-microtome）需经过专门培训和指导。详细操作步骤请参见参考文献¹⁵。
   1. 将完整脑组织浸入-80 °C的异戊烷中，于-80 °C下保持10分钟。随后将脑组织置于包埋模具中，并放置于冷冻切片机的载台板上。
      注意：在某些条件下，脑组织在-80 °C下快速冷冻可能导致组织开裂或损伤。操作者应意识到该问题。如发生此类情况，可改用-20 °C的异戊烷进行冷冻。
   2. 使用冷冻切片机（温度设定为-25至-20 °C）切割厚度为40 μm的冠状面切片。按照图2所示指南，依次将切片转移至含有防冻液的24孔细胞培养板中。储存于-20 °C，可保存数月。
      注意：此后所有组织处理均应在12孔板中进行，使用带网状插件的自由漂浮连续切片（40 µm），并在温和且持续振荡（10 rpm）条件下操作。在适当条件下，脑切片可长期保存数年。

图2：将切片从冷冻切片机-切片装置依次转移至含冷冻保护液的24孔细胞培养板的示意图。从A1孔开始，将后续切片依次放入A行；A6孔之后移至下一行B，依此类推。到达D6孔后，返回A1孔并继续。此排列方式可对整个脑区的第N个（例如，神经发生研究中的第六个，相当于一列中的切片）切片进行定量分析。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 免疫染色

注意：每种技术的优缺点总结见表1。

1. 使用DAB过氧化物酶反应检测BrdU
   注意：第1天执行步骤4.1.1至4.1.5。
   1. 将切片从冷冻保护液转移至室温下的0.1 M PBS中，用0.1 M PBS洗涤3次，每次10分钟。
   2. 将切片在内源性过氧化物酶阻断液中孵育30分钟，以灭活内源性过氧化物酶。用0.1 M PBS洗涤3次，每次10分钟。可选地，进行抗原修复（见第5节）。将切片在37 °C下与2 N HCl孵育20分钟。用0.1 M硼酸盐缓冲液（pH 8.5）冲洗10分钟。再用冰冻的0.1 M PBS洗涤3次，每次10分钟。
   3. 将切片在PBS++（封闭液）中室温孵育2小时。然后在4 °C下用1:250稀释的抗BrdU一抗（小鼠来源）在PBS+中过夜孵育。
   4. 第2天，用0.1 M PBS将切片洗涤3次，每次10分钟。
   5. 在室温下用1:250稀释的HRP标记的二抗（抗小鼠）在PBS+中孵育2‒4小时。用0.1 M PBS洗涤3次，每次10分钟。
   6. 将切片转移至DAB过氧化物酶（HRP）底物溶液中，孵育2‒10分钟。当切片变为深灰色时，使用放大镜或显微镜观察组织。若存在阳性细胞，用自来水冲洗3次，每次15分钟（以降低背景）。再用0.1 M PBS洗涤3次，每次10分钟。
   7. 用软毛刷小心地将切片贴附于明胶包被的载玻片上，室温下空气干燥过夜。复染（见第7.1节），加入永久封片剂并加盖盖玻片。可在4 °C下保存长达6个月。
2. 使用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物的过氧化物酶反应检测BrdU
   注意：第1天执行步骤4.2.1至4.2.5。
   1. 将切片从冷冻保护液转移至0.1 M PBS中以恢复至室温。用0.1 M PBS洗涤3次，每次10分钟。
   2. 用内源性过氧化物酶阻断液孵育30分钟，以灭活内源性过氧化物酶。在0.1 M PBS中洗涤3次，每次10分钟。可选地，进行抗原修复（见第5节）。
   3. 在37 °C下与2 N HCl孵育20分钟。用0.1 M硼酸盐缓冲液（pH 8.5）冲洗10分钟。再用冰冻的0.1 M PBS洗涤3次，每次10分钟。
   4. 在PBS++（封闭液）中室温孵育2小时。
   5. 在4 °C下用1:250稀释的抗BrdU一抗（小鼠来源）在PBS+中过夜孵育。
   6. 第2天，用0.1 M PBS将切片洗涤3次，每次10分钟。
   7. 在室温下用1:250稀释的生物素化二抗（抗小鼠）在PBS+中孵育2‒4小时。用0.1 M PBS洗涤3次，每次10分钟。
   8. 在室温下用ABC溶液孵育1小时。用0.1 M PBS洗涤3次，每次10分钟。
   9. 将切片转移至DAB过氧化物酶（HRP）底物溶液中，孵育2‒10分钟。当切片变为深灰色时，使用放大镜或显微镜观察组织。若存在阳性细胞，用自来水冲洗3次，每次15分钟（以降低背景），随后用0.1 M PBS洗涤3次，每次10分钟。
      注意：溶液必须在使用前立即配制。应小心避免因组织中出现不规则的深色斑点而导致脑切片相互粘连。
   10. 用软毛刷小心地将切片贴附于明胶包被的载玻片上，然后在室温下空气干燥过夜。
   11. 如需复染（见步骤7.1），加入永久封片剂并加盖盖玻片。可在4 °C下保存长达6个月。
3. 通过标记的链霉亲和素-生物素（LSAB）扩增法进行免疫荧光检测BrdU
   注意：第1天执行步骤4.3.1至4.3.4。
   1. 将切片从冷冻保护液转移至室温下的0.1 M PBS中。用0.1 M PBS洗涤3次，每次10分钟。可选地，进行抗原修复（见第5节）。
   2. 在37 °C下与2 N HCl孵育20分钟。用0.1 M硼酸盐缓冲液（pH 8.5）冲洗10分钟。再用冰冻的0.1 M PBS洗涤3次，每次10分钟。
   3. 在PBS++（封闭液）中室温孵育2小时。然后在4 °C下用1:250稀释的抗BrdU一抗（小鼠来源）在PBS+中过夜孵育。
   4. 第2天，用0.1 M PBS将切片洗涤3次，每次10分钟。
   5. 在室温下用1:250稀释的生物素化二抗（抗小鼠）在PBS+中孵育2‒4小时。用0.1 M PBS洗涤3次，每次10分钟。再在室温下用1:250稀释的荧光染料标记的链霉亲和素（Cy3）在PBS中（不得使用血清）孵育1‒2小时。用0.1 M PBS洗涤3次，每次10分钟。
      注意：血清可能含有生物素，不应添加至稀释液中。应使用含0.3% Triton X-100的PBS代替。
   6. 用软毛刷小心地将切片贴附于明胶包被的载玻片上，室温下空气干燥过夜，或立即使用适当的封片剂封片。复染（见步骤7.2），加入永久封片剂并加盖盖玻片。可在4 °C下保存长达6个月。
4. 通过间接免疫荧光法检测BrdU
   注意：第1天执行步骤4.4.1至4.4.4。
   1. 将切片从冷冻保护液转移至0.1 M PBS中，直至达到室温。用0.1 M PBS洗涤3次，每次10分钟。如需要，可进行抗原修复（可选，见第5节）。
   2. 在37 °C下与2 N HCl孵育20分钟。用0.1 M硼酸盐缓冲液（pH 8.5）冲洗10分钟。再用冰冻的0.1 M PBS洗涤3次，每次10分钟。在PBS++（封闭液）中室温孵育2小时。然后在4 °C下用1:250稀释的抗BrdU一抗（小鼠来源）在PBS+中过夜孵育。
   3. 第2天，用0.1 M PBS将切片洗涤3次，每次10分钟。
   4. 在室温下用1:250稀释的荧光染料标记的二抗（抗小鼠）在PBS+中孵育2‒4小时。用0.1 M PBS洗涤3次，每次10分钟。
   5. 用软毛刷小心地将切片贴附于明胶包被的载玻片上，室温下空气干燥过夜，或立即使用适当的封片剂封片。复染（见步骤7.2），加入永久封片剂并加盖盖玻片。可在4 °C下保存长达6个月。

5. 抗原修复（可选）

注意：抗原修复是一个可选步骤，旨在纠正因固定导致的抗原性丧失问题，这种固定会改变许多抗原的三级和四级结构，使其无法被抗体检测到。该步骤可添加至原始实验方案中。

1. 在微波炉或水浴中，将 10 mM 柠檬酸钠缓冲液（SCB）pH 6 溶液预热至 90‒95 °C（根据海拔不同，溶液在此温度范围内开始沸腾）。取一个 50 mL 锥形管，加入预热的 SCB 溶液至其体积的 80%（即 40 mL）。将切片转移至置于锥形管内含 SCB 溶液的网状插件中。使用经 18‒20 号针头打孔的螺口盖盖住锥形管。
2. 在 80‒85 °C 条件下，将切片在 SCB 中孵育 30 分钟，期间在微波炉中以最低功率交替进行加热循环。如需要，可补充 SCB 溶液至锥形管中。孵育结束后，立即连同网状插件一起将切片转移至冰浴的 0.1 M PBS 中，每次 10 分钟，共清洗 3 次。

6. 多重免疫染色（可选）

注意：有关此步骤的原理，请参见引言部分。

1. 多重免疫染色（同时法）
   1. 在 PBS+ 中配制针对目标抗原的一抗混合液（例如，小鼠抗 BrdU 抗体和兔抗 GFAP 抗体）。每种一抗应来自不同宿主。4 °C 下孵育过夜。随后按照各实验方案的后续相同步骤进行操作。
   2. 在相同的稀释液中配制针对各一抗的相应二抗混合液（例如，山羊抗小鼠 FITC、山羊抗兔 TRITC）。后续继续按照各实验方案的相同步骤进行操作。理想情况下，应使用来自相同宿主的二抗，以避免交叉反应。
2. 多重免疫染色（顺序法）
   1. 按照第一种一抗靶标的实验方案操作（例如，小鼠抗 BrdU 抗体），但在切片封片前停止。室温下用 PBS++（封闭液）孵育 2 小时。
   2. 在 PBS+ 中加入第二种一抗（例如，兔抗 GFAP 抗体），4 °C 下孵育过夜。按照各实验方案的后续步骤操作，包括加入第二种二抗（例如，山羊抗兔 TRITC）。继续完成各实验方案的后续所有步骤。

7. 复染（可选）

1. 对于使用过氧化物酶反应的实验方案，将焦油紫溶液预热至 60 °C。用 ddH₂O 水化切片 1 分钟。将切片在热的焦油紫溶液中孵育 5‒20 分钟。
   1. 用 ddH₂O 冲洗切片 1 分钟。依次用 70%、80%、90% 和 100% 乙醇各冲洗 1‒3 分钟。再用二甲苯冲洗 1‒3 分钟。
   2. 加入永久性疏水封片剂，并加盖盖玻片。
      注意：可在 4 °C 下保存长达 6 个月。可使用含 PVA（聚乙烯醇）-DABCO 的自制封片剂。
2. 对于使用免疫荧光的实验方案，加入少量（25‒50 μL）含 DAPI、碘化丙啶或类似染料的亲水封片剂。用指甲油或塑料封片剂密封盖玻片边缘。在 4 °C 下保存，最长可达 6 个月。

8. 成像与分析

注意：显微镜设置参数详见表2。通常使用过氧化物酶反应染色切片（较经济的方法）对染色的新细胞进行计数，但也可采用免疫荧光法进行。

1. 为了定量细胞，首先使用 4 倍放大倍数的物镜正确定位齿状回（有关齿状回解剖结构的进一步说明，请参见 Amaral 等人¹⁶）。
   1. 使用 40 倍放大倍数的物镜，在齿状回的颗粒细胞层中寻找被 BrdU 标记的细胞核。由于新生细胞可能分布在不同层次，需沿 z 轴方向彻底搜索细胞（参见 视频 1）。
   2. 在整个齿状回范围内选择一个间隔切片进行细胞搜索（例如，每第 6 张切片，相当于每 240 μm 一张）。
   3. 计数所有 BrdU 阳性细胞。标记细胞核的形态可能因细胞摄入 BrdU 的量不同而有所变化（可参考 图 3）。在 z 轴方向缓慢移动，以准确量化构成一个簇的多个细胞核（参见 视频 2）。
   4. 将计数得到的细胞总数乘以所选切片间隔数（例如 6），以估算 BrdU 标记的新细胞总数。
   5. 理想情况下，在常规实验中，每只动物至少计数 10 张切片，每组至少包含 5 只动物。
2. 图像去卷积（可选）
   注意：有关此步骤的重要信息，请参见引言部分。该过程需要单色图像（灰度图像）。将彩色图像转换为灰度图像。如果图像是 RGB 复合图像，需先拆分通道，然后将其合并为单个图像（非复合图像），再转换为 8 位灰度图像。
   1. 从显微图像创建 z 轴堆叠文件（z-stack 文件）。
   2. 从 插件 菜单中打开“衍射点扩散函数 3D”插件（Diffraction PSF 3D，https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D），创建点扩散函数（PSF）文件。填写所有必需的数据（参见 表 2）。点击 确定 并保存文件。
   3. 从 插件 菜单中打开 DeconvolutionLab2⁹ 插件（http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/）。将匹配的 z-stack 图像和 PDF 文件拖入对应的窗口槽中。
   4. 选择去卷积算法（例如 Richardson-Lucy）和迭代次数（例如 20 次）。点击 运行。
   5. 从顶部 图像 菜单中选择 堆叠，然后点击 Z 投影，将去卷积后的图像合并为单一的 z-stack 图像。在 投影类型 下拉菜单中选择 最大强度投影，点击 确定 并保存文件。
   6. 使用上一步生成的单个 z-stack 图像文件，从顶部 图像 菜单中选择 颜色，然后点击 合并通道，创建 RGB 图像。在下拉菜单中将相应图像分配至期望的颜色通道。取消勾选 创建复合图像，点击 确定 并保存文件（参见 图 4）。
   7. 若存在多个通道图像，请重复步骤 8.2.1–8.2.5。按照步骤 8.2.6 创建 RGB 图像文件，至少打开两个图像文件，并为每个图像文件选择不同的颜色通道（参见 图 4）。

结果

上述方法用于定量分析成年大鼠在自发性体力活动后海马区新生细胞的数量，并与未进行额外体力活动的对照组进行比较。我们采用新生大鼠的海马区作为阳性对照。选取3月龄雄性大鼠，进行为期7天的自发性体力活动（无尽转轮）方案。在第6天，大鼠接受BrdU注射（见第2节），之后每12小时注射一次，共完成三次注射。为确保完成三次细胞周期分裂，动物在最后一次BrdU注射后8小时经心脏灌注固定（见第3节）。同样程序也应用于未进行体力活动的3月龄大鼠，作为对比对照组。作为阳性对照，出生后第1天的幼鼠单次注射BrdU，操作如上文第2节所述。注射后24小时（出生后第2天），幼鼠被实施安乐死，头部浸入PFA溶液中，操作见步骤3.4。成年大鼠经深度麻醉（步骤3.1）后，按步骤3.2所述进行经心脏灌注。取出脑组织并进行后固定（步骤3.4），随后将脑组织切成40 μm厚的冠状切片（步骤3.5）。切片按步骤4所述进行BrdU免疫组织化学处理。

我们采用辣根过氧化物酶与DAB免疫组化反应（步骤4.1）对齿状回（DG）中BrdU阳性细胞进行染色和计数。图5显示了含有BrdU标记细胞的DG切片。图5C,D展示了DG切片在较高放大倍数下的代表性区域。标记细胞呈现强烈的深色染色，以箭头标示。插图显示了实验组和对照组中标记细胞的平均数量（按步骤8.1所述，将计数的阳性细胞数乘以6）。Student t检验显示两组间BrdU阳性细胞数量存在显著差异（t₍₁₀₎ = 2.704，p = 0.0222）。未进行体力活动的对照组为2,040 ± 314个细胞（n = 6只大鼠）。相比之下，体力活动组平均有3,606 ± 486个BrdU阳性细胞（n = 6只大鼠）。由此可见，体力活动可增加BrdU阳性细胞数量。因此，本结果与其他已有报道一致，表明体力活动可促进成年齿状回的细胞增殖¹⁷。

图3：BrdU标记细胞核不同形态的示例。BrdU是一种DNA合成标记物，可标记细胞核。在海马区，BrdU阳性细胞核呈半椭圆形，位于齿状回颗粒下区。由于BrdU通过竞争机制被掺入，每个细胞掺入的量存在差异，这将在后续细胞核的可视化中体现出来。（A）免疫荧光图像。（B）未使用额外扩增方法的过氧化物酶反应图像。黄色箭头指示伪影和非特异性信号。黑色或白色箭头指示BrdU阳性细胞。1 – 核完全着色，呈深染的半椭圆形。2 – 核内有斑点，细胞核边界清晰，内部含有多个斑点。3 – 核内斑点较少，细胞核边界清晰，内部仅有少量斑点。4 – 小型细胞核，可能为处于不同分化阶段的细胞，但仍属于该微环境的一部分。5 – 成簇的前体细胞正处于分裂阶段，因此可观察到多个细胞聚集形成的致密细胞群。在此类细胞群中计数时必须格外谨慎，以避免错误标记阳性细胞。红色箭头指示正在分裂的细胞核，可能被误认为单个细胞。每个细胞均被框出，并可在Z轴平面上实时区分。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：单通道及合并通道的代表性RGB图像。 上方图像为原始z轴层叠图像，下方图像为三维去卷积处理后的z轴层叠图像。（A）齿状回低倍放大图像。（B）各通道的RGB图像，（C）RGB合并图像。该脑组织来自对照组。免疫荧光染色未使用额外的信号放大方法。BrdU（红色），DAPI作为复染剂（蓝色），GFAP（胶质纤维酸性蛋白）作为星形胶质细胞标记物（绿色）。ML = 分子层；GCL = 颗粒细胞层；SGZ = 颗粒下区。 请点击此处查看该图的高清版本。

图5：各实验组中BrdU标记细胞（深色强染）的代表性齿状回切片。 采用辣根过氧化物酶反应结合亲和素-生物素-过氧化物酶复合物放大法进行染色。(A, B) 显示齿状回的低倍镜图像，(C, D) 显示方框区域的高倍镜图像。A和C为运动组组织，B和D为对照组组织。插图显示运动组与对照组中平均标记细胞数量（按步骤8.1所述，计数阳性细胞后乘以6）。ML = 分子层；GCL = 颗粒细胞层；SGZ = 颗粒下区；箭头指示BrdU+细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

视频 1：视频显示沿 z 轴分布在不同层中的阳性细胞的不同焦平面。 请点击此处下载该视频。

视频 2：视频显示沿 z 轴分布在不同层的阳性细胞簇在不同焦平面上的图像。 缓慢移动 z 轴以定量分析构成一个细胞簇的所有多个细胞核。请点击此处下载该视频。

显微镜类型：	落射荧光显微镜 Olympus BX53
光源：	130 W 高压汞弧灯 (U-HGLGPS)
图像采集软件：	CellSens 标准版
滤光片组：	目录编号		激发波长范围	二向色镜	抑制波长范围
	U-FUW		340 - 490 nm	410 nm	420 nm
	U-FBW		460 - 495 nm	505 nm	510 nm
	U-FGW		530 - 550 nm	570 nm	575 nm
相机：	型号：		CCD 相机 UC50
	光谱范围：		290 – 1000 nm
	CCD 芯片尺寸：		2/3 英寸，2588（宽度 ×7）× 1960（高度 ×8）像素
	像素尺寸：		3.4 × 3.4 µm
荧光染料：	名称		激发波长 (nm)	发射波长 (nm) *3	发射颜色
	4,6-二脒基-2-苯基-吲哚盐酸盐 (DAPI)		345	455	蓝色
	四甲基罗丹明-异硫氰酸酯 (TRITC)		541	572	红色
	异硫氰酸荧光素 (FITC)		494	519	绿色
	Cy3		552	565	红色
封片剂与浸油：	名称			介质的折射率 *1
	空气（载玻片与物镜之间无介质）			1.00029
	含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂			1.45
	Permount 封片剂			1.519
	低自发荧光浸油 (MOIL-30 Type F)			1.518
放大倍数物镜（平场萤石）	放大倍数	数值孔径 (NA) *2	分辨率 (µm)	图像像素间距 (nm) *5	Z 轴切片间距 (nm) *6
	4X	0.13	2.12	850	3000
	10X	0.3	0.92	340	3000
	20X	0.5	0.55	170	2000
	40X	0.75	0.37	85	1000
	100X	1.3	0.21	34	1000

表2：显微镜设置参数及点扩散函数（PSF）文件创建要求。 在三维衍射PSF插件窗口中有11个参数栏用于创建PSF文件，各参数栏说明如下：*1 - 介质折射率：载玻片与物镜之间介质的折射率（例如，空气 = 1.00029）。*2 - 数值孔径：所用物镜的数值孔径（NA），当使用与物镜设计不匹配的浸没介质时，必须进行校正。*3 - 波长：荧光染料的最大发射波长（nm）。*4 - 轴向球面像差：0.00。*5 - 图像像素间距：CCD像素尺寸（nm）除以放大倍数（例如，3.4 µm，100倍物镜，则为3400/100 = 34 nm）。*6 - Z轴图像间距离。*7 - 宽度：输入待去卷积图像的像素宽度。*8 - 高度：输入待去卷积图像的像素高度。*9 - 深度（切片数）：Z轴堆栈中的图像数量。*10 - 归一化：所有像素值之和等于1。*11 - 标题：PSF文件的命名，应与对应的特定Z轴堆栈图像相匹配。

讨论

成年神经发生是一种主要发生在成年神经前体细胞生态位中的过程，这些细胞具有在其整个生命周期内生成新神经元的潜能。溴脱氧尿苷（BrdU）标记在免疫学中被广泛用于表征成年大脑中新生成细胞的数量。BrdU主要被整合到特定脑区（即神经发生区）的细胞中。这些细胞位于侧脑室下区（SVZ）以及海马齿状回——位于门区与颗粒细胞层之间的颗粒下区（SGZ）^1,2,18_。 此外，还有一些脑区在成年期具有较低的增殖能力，包括下丘脑、纹状体、新皮层和杏仁核¹⁹。如前所述，BrdU染色是成年神经发生研究中常用的检测细胞增殖的方法。然而，将BrdU作为标记物存在局限性和潜在问题。其一是BrdU是一种细胞周期标记物，因此必须进行双重或三重染色以确定细胞命运，并结合细胞标记物来识别被标记细胞所处的特定发育阶段。另一个关于BrdU的问题是，它是一种具有毒性和致突变性的溶液，可能通过改变DNA稳定性而影响细胞功能和细胞周期。在决定给药方案和剂量（50‒600 mg/kg）时，应充分考虑上述信息。另一个关键点是，BrdU是DNA合成的标记物，而非细胞增殖的直接标记物¹⁴。因此，有必要将细胞增殖与其他事件区分开来，例如DNA修复、中止性的细胞周期再进入以及基因重复。研究人员必须设置适当的对照，以确保BrdU的正确使用。有关这些问题和局限性的更详细讨论，我们建议参考Taupin的研究工作¹⁴。免疫组织化学实验方案的标准化过程可能较为缓慢且具有挑战性。在本研究中，我们已列出成功实施IHC实验所需的所有通用步骤。然而，我们建议每个研究团队在实验前对组织、抗体及实验条件进行测试和评估。测试和评估应针对每种抗体和组织至少在三种不同的孵育时间、洗涤步骤和浓度条件下进行。我们还建议研究人员查阅其他相关实验方案，以便选择最符合其特定需求和要求的最佳方案^{20,21,22,23,24,25}。

如前所述，该操作流程包含多个步骤和方法学上的考量，这些内容在科学文献中经常被提及和使用，后续将对此进行讨论。我们建议研究人员根据技术要求、预算、设备、实验设置以及主要研究目标，谨慎且恰当地选择抗体。抗体必须使用与实验中将要检测的相同类型的组织进行预测试。我们还建议选用已针对相同用途（即免疫组织化学，IHC）验证过的抗体（例如，不仅限于Western blot或流式细胞术），以确认其与固定方法的兼容性。BrdU染色可通过多种途径给予，包括腹腔注射、腹腔输注、口服摄入或脑室内输注（有关每种技术的更详细描述，请参见参考文献²⁶）。如果选择腹腔注射，应确保BrdU被注入腹腔内，并避开肠道区域。因为肠道中含有大量处于增殖状态的细胞，可能会在BrdU到达脑组织之前将其耗尽，从而影响被标记细胞的数量。获得较薄的切片至关重要，因为薄切片有利于溶液更好地渗透。按照Kempermann等人提出的体视学方法²⁷，以头尾方向切割出厚度为40 µm的冠状切片，并将其转移至24孔细胞培养板中。免疫组织化学染色可在载玻片上的贴片组织或游离漂浮切片上进行。由于BrdU位于细胞核内部较深的位置，在游离漂浮切片中溶液更容易渗透，因此可获得更佳的结果以及对目标区域更充分的接触。为了使一抗抗BrdU能够进入，必须打开DNA链（DNA变性）。在本研究中，我们采用盐酸（HCl）孵育来完成这一特定步骤。另一方面，封闭非特异性表位的过程有助于更准确地识别细胞信号。

良好的膜通透性可使抗体充分进入目标区域。在 PBS++ 和 PBS+ 溶液中加入 Triton X-100 等通透剂可改善膜的通透性。本实验方案中可使用 PBS 或 Tris 缓冲盐水（TBS）试剂。从成本角度考虑，TBS 可能相对比 PBS 更便宜。然而，PBS 可能干扰抗磷酸化抗体，并抑制碱性磷酸酶偶联的抗体，因此如果目标蛋白存在翻译后磷酸化修饰（即磷酸化蛋白），应避免使用 PBS。本研究中我们采用了 PBS，发现组织洗涤步骤可获得更特异的信号。我们还建议研究人员使用 TBS 或 PBS 至少进行三次洗涤循环。所有溶液必须新鲜配制。抗原修复（AR）是一种旨在减轻因固定导致抗原性丧失的方法，固定会改变抗原的三级和四级结构，这种改变会使抗原无法被抗体检测到^28,29。本方案中采用的热诱导表位修复（HIER）旨在通过高温或强碱性水解（使用其他缓冲液如 pH 8.5 的 EDTA 或 pH 9.5 的 Tris）逆转甲醛与蛋白质之间的化学反应。对于新抗体，必须尝试不同的抗原修复方案进行结果比较，以选择最适合本实验的方案。最后这一步在常规实验中可能是可选的，但我们对组织进行了抗原修复处理，以在本方案中获得更优的结果。

在选择最终的对比染色颜色和复染技术时，必须考虑所使用的初染颜色和方法，以使非染色结构可见，并避免掩盖免疫反应中的初染颜色。对于荧光显微镜观察，DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）是一种广泛使用的细胞核和染色体复染剂，其在结合DNA的AT区域后可发出蓝色荧光（激发波长：360 nm，发射波长：460 nm）。含DAPI的封片介质易于使用且可有效保留荧光信号，有利于图像采集。对于过氧化物反应，免疫组织化学（IHC）可选用多种复染方法，如焦油紫、苏木精、中性红或甲基绿染色。在进行多重免疫染色时，至关重要的是选择与所用固定技术相容的抗体，以避免交叉反应³⁰。当单染过程中出现的问题和困难得到解决后，可根据需要进行另一种颜色的染色。必须严格控制二抗之间的非特异性结合。可通过在使用来自与一抗相同宿主物种的二抗之前，先用该二抗对应的非标记一抗进行封闭来实现饱和。例如，当使用兔来源的抗小鼠二抗和山羊来源的抗兔二抗时，应先使用山羊来源的抗兔二抗，再使用兔来源的抗小鼠二抗。只有在顺序染色方法完全掌握后，方可开始同步免疫染色流程。在此方法中，正确选择二抗尤为关键。理想情况下，所有二抗应来自同一宿主动物，以避免交叉反应。我们建议运行阳性对照，以确认染色方法在出生后海马组织（此阶段神经发生丰富）中能够准确工作。如果阳性对照组织出现染色问题，应重新审查实验步骤，进行修正和调整，并重复实验直至获得良好的染色结果。随后应运行阴性对照，通过省略特定的一抗或以正常血清（与一抗同种属）替代该一抗，来验证抗体的特异性。如引言所述，图像去卷积是一种强大工具，在无法获得共聚焦显微镜时可作为替代方案。该技术可应用于明场透射光、宽场荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜所获取的所有图像。图像去卷积的最终目的是重建原始信号，以弥补成像系统在采集过程中造成的信号退化¹⁰。

总之，通过胸腺嘧啶类似物BrdU的免疫检测来鉴定新生成的细胞，是一种复杂但功能强大的技术。本研究旨在帮助科学家——特别是成年海马神经发生领域的研究者——更准确地定量新生细胞。我们希望这项工作能对科学界有所帮助，并使利用免疫组织化学技术精细优化细胞增殖研究变得更加便捷。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂准备与设置
供体马血清	BioWest	S0900	PBS中的封闭和孵育溶液
试剂级多聚甲醛，结晶状（PFA）	Sigma-Aldrich	P6148	有毒，易燃
氯化钾	Sigma-Aldrich	746436-500G
磷酸二氢钾	J.T Bker	3246-01
蔗糖	J.T Baker	4072-01
氯化钠	Meyer	2365-500G
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S5881-500G	腐蚀性，用于校准 pH
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S9763-5KG
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
胸苷类似物BrdU给药
5-溴-2′-脱氧尿苷，BrdU	Sigma-Aldrich	B9285	有毒的（致突变的，致畸的）
23–27G皮下注射针	BD PrecisionGlide
生理盐水	PiSA	30130032
1 mL注射器	NIPRO
组织制备
15 毫升聚丙烯锥形管	赛默飞世尔科技	339650
50 ml 聚丙烯锥形管	赛默飞世尔科技	339652
解剖工具
断头台	斯托尔廷
冷冻切片机	MICROM	HM525
Netwell 15 mm 聚酯网膜插件	康宁	3477	预装于12孔培养板中
Netwell 塑料 12 孔板支架套装	康宁	3520	用于15毫米聚酯网膜插件
Netwell 塑料 6 孔板支架套装	康宁	3521
灌注泵	Cole-Parmer	7553-70
振荡器	IKA	ROKCER 3D 数字化
免疫染色
焦宁蓝	Sigma-Aldrich	C5042	1%，对光敏感
DAB 过氧化物酶（HRP）底物试剂盒（含镍），3,3’二氨基联苯胺	Vector Laboratories	SK-4100	致癌性，光敏感
盐酸	J.T.Baker	9535-05	腐蚀性，用于校准 pH
过氧化氢，50%	Meyer	5375-1L	有毒，氧化性
Permount 封片介质	Fisher Chemical	SP15-500
含DAPI的VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1200	光敏感
VECTASTAIN® 精英® ABC试剂盒 辣根过氧化物酶（HRP）	Vector Laboratories	PK-6100	酶法、基于亲和素/生物素的扩增系统
一抗
兔源抗GFAP抗体	Sigma-Aldrich	HPA056030	1:500
小鼠源单克隆抗 BrdU 抗体	Sigma-Aldrich	B2531	1:250
二抗
Biotin-SP（长链间隔）AffiniPure 驴抗小鼠 IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	715-065-151	1:250
山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，HRP	Invitrogen	G-21040	1:1000
山羊抗小鼠IgG（全分子），TRITC	Sigma-Aldrich	T5393	1:250
山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附，FITC	Invitrogen	F-2765	1:250
链霉亲和素，Cy3	Vector Laboratories	SA-1300	1:250
成像与分析
计算机	戴尔计算机公司	T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB	用于控制和监测实验方案’ 过程
CCD相机	Olympus	UC50
CellSens Standard 软件	Olympus	cellSens 标准版	采集软件
落射荧光显微镜	Olympus	BX53
高压130 W汞弧灯	奥林巴斯	U-HGLGPS
低自发荧光浸油	Olympus	MOIL-30 型 F
微型盖玻片（VWR，货号 48404 454；24  60 mm
显微镜载玻片（VWR，货号 48323-185；76  26 mm
U-FBW滤光片立方体	Olympus	U-FBW	激发 460 - 495 nm，二向色镜 505 nm，抑制 510 nm
U-FGW滤光片组	Olympus	U-FGW	激发 530 - 550 nm，二向色镜 570 nm，抑制 575 nm
U-FUW滤光片组	Olympus	U-FUW	激发 340 - 490 nm，二向色镜 410 nm，抑制 420 nm