避免肝移植中的缺血再灌注损伤

摘要

本文介绍了一种在人肝脏从供体到受体的离体常温机械灌注（37 °C）条件下，实现无缺血性肝移植的逐步操作方案。

摘要

目前，离体机械灌注是一种新兴技术，相较于传统的静态冷保存（0–4 °C），能为供体器官提供更优的保存方法。从器官获取、保存到移植过程中，利用机械灌注持续向器官供血，可完全避免缺血-再灌注损伤，并允许在移植前对供体肝脏进行离体功能评估。本文中，我们提供了一套完整的无缺血肝移植操作步骤，采用离体常温机械灌注装置，对人供体肝脏至受体的移植过程实施经肝动脉的脉动式灌注和门静脉的持续灌注。在灌注期间，通过对灌注液进行生化分析以评估肝脏的代谢活性，同时进行肝组织活检以评价损伤程度。无缺血肝移植是一种有望避免缺血-再灌注损伤的创新方法，未来可能扩大可供移植的供体器官来源。

引言

缺血再灌注损伤（IRI）是器官移植中一种众所周知且广泛存在的并发症。明显的非免疫性事件会导致移植物功能不良和移植器官功能延迟恢复，这与器官衰竭、再次移植以及受者死亡的高比例密切相关¹。传统的器官冷保存（CCS）曾被认为是减缓代谢的经典方法，但其并不能有效防止细胞完整性进行性受损和功能恶化。此外，在再灌注阶段，活性氧代谢产物会诱导白细胞聚集。当我们使用扩展标准供体（ECD）移植物（如脂肪肝或来自65岁以上供体的肝脏）时，这些生物学过程变得更加重要。此类ECD移植物对损伤及其他有害影响更为敏感，尤其是来自CCS的损伤²。常温离体 肝脏机械灌注技术在保存供体器官方面已取得显著进展，并在过去几十年中实现了临床应用的完全可行性³。温灌注技术在供体器官中的安全性和可行性已在临床前研究中得到评估，一些研究团队已在动物模型中设计出新型灌注液 和复温策略。目前，针对供体肝脏保存的温灌注技术的多项临床试验已在东亚、欧洲和北美地区启动^4,5。

常温机械灌注（NMP）可提供一种代谢活跃的环境，使器官在持续供氧和营养供应下实现稳态。移植物的代谢被激活，我们可在灌注过程中根据灌注液的生化指标或灌注器官的活检结果，判断供体器官是否适合移植给受者。保存期间可获取的各项参数也为外科医生治疗移植物或修复边缘供体（ECD）移植物提供了手段^6,7。

红细胞是最常用的氧气载体。灌注液中还包含其他一些重要成分，如抗生素、抗血栓药物和营养物质⁸。目前的常规做法是，在肝脏获取后，将其置于0–4 °C的溶液中保存，并在冷台上进行修整。随后，将冷保存的肝脏放入预先准备好的常温机械灌注（NMP）装置中进行数小时的灌注，以评估和修复器官功能。然而，尽管NMP过程在一定程度上对肝脏起到了保护和修复作用，肝脏仍会在NMP启动时和移植后遭受 两次 缺血-再灌注损伤（IRI）的打击^9,10。因此，我们尝试重新评估该过程，并思考如何避免这两次IRI损伤。我们假设，如果能为肝脏提供持续的血液供应，则可避免IRI的发生。为了验证这一假设，我们将传统的双转换灌注方案改为使用Liver-Assist装置实现不间断的肝动脉（HA）和门静脉（PV）供血。这种新型的移植手术被称为无缺血肝移植（IFLT）。首例IFLT病例此前已有报道，并引起了器官移植领域专家的广泛关注¹¹。

两个旋转泵，分别提供脉动性肝动脉血流和连续的门静脉血流 供应通过压力控制的灌注装置进行，该系统通过相应压力控制流量，能够根据肝脏的阻力自动调节流经肝脏的血流。氧合与二氧化碳₂ 通过两个中空纤维膜氧合器调节灌注液的氧合与排除。可根据不同类型的机械灌注设置不同的温度（范围为10 °C至37 °C）。在灌注过程中，可通过仪器面板实时监测并记录压力、温度、流量和阻力指数。肝辅助装置并非可移动设备，因此用于离体肝灌注治疗（IFLT）的供体肝脏需转运至移植中心。

本文旨在提供一个逐步的IFLT方案，其中利用离体NMP装置，在从人类供体肝脏获取到移植的整个过程中，对肝动脉（HA）提供脉动灌注，并对门静脉（PV） 维持持续灌注。

方案

本方案经中国广州中山大学附属第一医院伦理委员会审核批准。所有参与者均签署了知情同意书。涉及人类参与者的全部研究程序均按照1964年《赫尔辛基宣言》及其后续的修正案或修订版执行。

1. 灌注液和装置的准备

注意：根据本方案制备的NMP 灌注液总体积约为3,000 mL，如先前报道¹，最终血红蛋白浓度为6–10 g/L。灌注液的成分列于表1中。

1. 向人工肝辅助装置的器官储液器中加入灌注液的各组分材料表通过氧合器顶部的连接器注入生理盐水，并清除管道中的所有气泡。
2. 根据设备屏幕上显示的制造商说明，开启静脉泵。以类似方式开启动脉泵。按照设备屏幕上的说明将压力归零。点击 压力 按钮用于将 HA 压力设定在 50–60 范围内 mmHg 和 PV 压力在 5–10 范围内 在整个常温机械灌注过程中，维持 mmHg。
3. 开始使用 O₂ 和 CO₂ 的混合气体进行氧合₂ 和空气（30% O₂）₂以400 mL/min的总流速进行灌注。将灌注液预热至37 °C。
4. 在设备预充后，从动脉灌注管的三通管处采集灌注液样本，用于微生物培养（8 mL）、血气分析（0.5 mL）和肝功能检测（3 mL）（pO₂）₂, pCO₂，pH 和电解质在正常范围内，温度接近 37 °C），并相应监测生化参数。
   注意：灌注液应在层流手术室内使用前新鲜配制。必要时可添加碳酸氢盐或胰岛素。

2. 供体肝脏的无缺血获取

1. 进行腹部十字切口，具体如下：垂直切口从胸骨切迹至耻骨联合，横向切口在脐部水平向两侧腹侧延伸。当需要获取肺或心脏时，可采用胸骨切开术。使用大型C形拉钩以充分暴露术野。
2. 详细检查腹腔内脏器。取肝组织活检标本用于组织学观察和临床研究。采用精细技术游离肝脏。
3. 在胆总管内放置导管以引流胆汁，并结扎胆囊管。从胆总管末端切取全周组织样本（宽度：3–5 mm），用于组织学观察和临床研究。
4. 解剖腹腔干动脉（CA）、胃十二指肠动脉（GDA）、脾动脉（SA）、下腔静脉（IVC）和门静脉（PV）。将8 Fr/12 Fr动脉导管插入GDA或SA。确保来自CA的肝动脉供血未受中断。 
5. 切取一段长约3 cm的右侧髂外静脉，并以端侧吻合方式将其与门静脉（PV）连接，同时对PV进行部分阻断，以构建间置静脉通道。 
6. 将32–34 Fr的下腔静脉导管置于肝下下腔静脉（IHIVC），用于引流至设备的器官储存装置。将一根直型24 Fr导管连接至设备的门静脉灌注管路，然后通过间置静脉完全插入门静脉（PV）。阻断肝上下腔静脉（SHIVC），从而阻断静脉回流至右心房。将动脉导管连接至肝脏辅助装置的肝动脉（HA）灌注管路。随后启动常温机械灌注（NMP），并在原位建立灌注回路。
7. 切取肝脏并转移至器官储存装置中，持续进行常温机械灌注（NMP）。肝脏从腹腔取出后，立即通过预先放置于腹主动脉内的导管对肾脏进行冷灌注，并按常规方法获取肾脏。
   注意：在器官获取过程中，应充分游离肝总动脉（CHA），结扎左胃动脉（LGA），并将腹腔干动脉（CA）分离至腹主动脉。若存在副肝动脉，应在NMP开始前在原位将其旁路处理。

3. 供体肝脏的无缺血保存

1. 将肝脏转移至灌注装置。当肝脏移至器官储存槽时，立即移除下腔静脉插管。在同种移植物再血管化前，持续进行离体常温机械灌注（NMP）肝脏移植物。 
2. 门静脉（PV）灌注压力设定为6–10 mmHg，目标灌注流速高于500 mL/min；肝动脉（HA）压力设定为50–60 mmHg，目标灌注流速高于150 mL/min。在NMP期间，确保灌注参数稳定，并将压力和流速维持在适当范围内进行监测。
3. 清除肝脏及血管上的多余组织。暂时阻断整个下腔静脉（IVC），以检查肝上和肝下下腔静脉（SHIVC和IHIVC）是否存在渗漏。用湿润的无菌纱布覆盖任何干燥表面，防止脱水。
4. 将胆汁引流管接入15 mL收集容器中。将胆汁引流口置于肝脏下方，使胆汁自由流出。记录胆汁产量，并每30分钟监测一次生化参数。
5. 每10–20分钟采集灌注液样本（0.5 mL）进行血气分析，每30分钟采集肝功能检测样本（3 mL），并相应监测生化参数。
6. 通过灌注液的血气分析、肝功能检测以及胆汁生化参数评估肝脏活力，方法如先前报道²。
   注意：为确保患者安全，在开始受者手术操作前，需在NMP期间确认移植物的活力。必要时可加入1 mL罂粟碱以降低血管阻力。

4. 供体肝脏的无缺血植入

1. 采用常规技术切除受体的病变肝脏。使用 32–34 Fr 的下腔静脉插管重新连接供体的肝后下腔静脉（IHIVC），移除病变肝脏 ，并用夹子阻断肝上前腔静脉（SHIVC）。随后，将供体肝脏从储液器转移至受体腹腔，以便原位重建常温机械灌注（NMP）回路。
2. 使用 3–0 不可吸收聚丙烯缝线，采用双腔静脉或背驮式技术，将供体的 SHIVC 与受体相应血管进行吻合。
3. 分别使用 5–0 和 7–0 不可吸收聚丙烯缝线，以端对端方式将供体的门静脉（PV）和肝动脉（HA）与受体对应血管进行吻合。这些吻合操作应在移植物持续进行 NMP 的条件下完成，因为 HA 和 PV 均含有天然和人工来源的分支。
4. 在再灌注前采集肝脏 活检标本。随后，松开 PV 和 HA 上的血管夹，以恢复肝脏原有的双重血供。同时，在移除 HA 和 PV 插管后停止 NMP。然后，经 IHIVC 插管冲洗出肝内约 200 mL 的灌注液。阻断 IHIVC 插管，并松开 SHIVC 上的血管夹。无肝期结束。再次采集 8 mL 灌注液样本用于微生物培养。
5. 移除肠系膜上动脉（SA）或胃十二指肠动脉（GDA）以及搭桥静脉中的插管。结扎供体的 SA 或 GDA 及搭桥静脉。撤出 IHIVC 插管，并根据手术方案将供体 IHIVC 与受体 IHIVC 进行吻合（双腔静脉法）或予以结扎（背驮式法）。在拔除胆汁引流插管后，再次采集胆总管标本。  拔除引流管后，以端对端方式将供体胆总管与受体胆总管进行吻合。
6. 在彻底止血后再次采集肝脏 活检标本 。按常规步骤关闭腹壁。
   注：在植入过程中，应密切监测门静脉和动脉插管，避免扭曲或弯曲，并实时观察流量参数，以确保 HA 和 PV 的血液供应。必要时可轻微增加灌注压力，以保证肝脏获得充足的灌注流量。在进行 SHIVC、PV 或 IHIVC 吻合时，应尽可能缩短静脉残端，以避免术后静脉血流受阻。

结果

2018年4月，一名66岁男性脑死亡供者因被认为移植后移植物丢失风险较高，未被当地移植中心采纳。在器官获取时，弃用肝脏的原因包括供者年龄较大、肉眼观察显示肝脏质地中度坚硬、肝缘圆钝、肝脏移植物灌注欠佳，以及供者存在多种严重合并症，包括高血压、高血压性心脏病，以及以下相关因素：高钠血症（钠离子浓度156 mmol/L）和血流动力学不稳定，需使用胺类药物（多巴胺）维持。 1.5 µg/kg/分钟，去甲肾上腺素， 0.12 µg/kg/min）。按照本方案所述，对人供体肝脏移植物进行5小时的常温灌注。通过评估肝脏灌注的宏观均匀性来判断肝脏移植物的质量。图1A–D）。还通过监测肝动脉和门静脉血流的变化，研究了肝脏的血流动力学。在灌注期间观察到肝移植物的血流动力学稳定。图2A）。通过动脉灌注液采集的灌注液样本进行血气分析，以监测灌注液中的氧合状态。使用O₂与CO₂的混合气体进行氧合₂ 和空气（30% O₂）₂) 以 400 mL/min 的流速进行，可...

讨论

本研究建立的IFLT技术旨在完全避免缺血再灌注损伤。本文提供了从器官获取、离体保存到移植的逐步IFLT操作流程。

基于非搏动性机械灌注（NMP），离体灌注技术（IFLT）可从器官获取、保存到移植全程为移植物提供持续的血液和氧气供应。大量研究表明，与静态冷保存相比，NMP在减轻缺血-再灌注损伤（IRI）、提高器官活力以及修复移植物损伤方面具有显著优势¹²。随着外科技术的创新及NMP技术在多种器官中的发展，无缺血器官移植（IFOT）的理念有望推广至所有实体器官移植，显著改善器官移植的早期及远期预后，并最大化利用边缘性器官。目前，IFOT技术仅应用于脑死亡后器官捐献（DBD）来源的移植，但通过选择合理的血管插管和灌注参数，该技术同样适用于活体捐献（LDOD）相关的器官移植。心脏死亡后捐献（DCD）可分为两类：可控性DCD（cDCD，指未达到脑死亡标准但接受机械通气的患者，在主动撤除生命支持后死亡）和较少见的不可控性DCD（uDCD，指心脏骤停后心肺复苏失败）¹²。对于已发生器官热缺血损伤的uD...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 葡萄糖酸钙	河北天成药业有限公司	1S181124101	30 mL
25% 硫酸镁	河北天成药业有限公司	H20033861	3 mL
5% 碳酸氢钠	江西东亚药业有限公司惠银碧组	H36020283	具体用量取决于pH值
头孢哌酮钠和舒巴坦钠	辉瑞	H20020597	1.5 g
复方氨基酸注射液	广东利泰制药有限公司	H20063797	250 mL
交叉配血、白细胞去除并洗涤的红细胞	广州血液中心	H20033739	1300 mL
肝素	成都海普洛斯医药科技有限公司	H51021209	37500 U
肝脏辅助	器官辅助	OA.Li.Li.140	灌注装置
肝脏辅助一次性使用包装	器官辅助	OA.Li.DP.540	一次性套件和导管
甲硝唑	上海百特医疗用品有限公司	H20003301	0.5 g
头针疗法	武汉 W.E.O.科学 &科技发展有限公司	WEO-JX-32B-5.0 0.7*25mm	胆管插管
琥珀酰化明胶	B. Braun Medical Suzhou Co., Ltd	H20113119	1400 mL