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方法文章

一种静脉畸形的患者来源异种移植模型

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DOI：

10.3791/61501

⸱

2020年6月15日

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提供了一种建立静脉畸形小鼠异种移植模型的详细方案。该模型基于皮下注射携带TIE2和/或PIK3CA基因激活突变的患者来源内皮细胞。异种移植病灶能够高度模拟静脉畸形患者组织的组织病理学特征。

摘要

静脉畸形（VM）是一种血管发育异常，由静脉网络发育障碍导致，表现为扩张且常有功能障碍的静脉。本文旨在详细描述一种模拟人类静脉畸形并能反映患者异质性的鼠类异种移植模型的建立方法。研究发现，内皮细胞（EC）中激活性体细胞（非遗传性）TEK（TIE2）和PIK3CA基因突变是导致静脉畸形病理性血管扩张的主要驱动因素。以下方案描述了携带突变型TIE2和/或PIK3CA的患者来源内皮细胞的分离、纯化与扩增过程。将这些内皮细胞皮下注射至免疫缺陷的无胸腺小鼠背部，以形成扩张的血管样结构。使用携带TIE2或PIK3CA突变的内皮细胞所形成的病灶在注射后7‒9天内即可观察到明显的血管化，并在组织病理学特征上重现了静脉畸形患者组织的表现。该静脉畸形异种移植模型为研究驱动静脉畸形形成与扩展的细胞和分子机制提供了可靠的平台。此外，该模型在转化医学研究中具有重要价值，可用于评估新型候选药物在抑制人类静脉畸形中异常血管扩张方面的有效性。

引言

血管系统发育缺陷是多种疾病的潜在病因，包括静脉畸形（VM）。VM 是一种先天性疾病，其特征是静脉的形态发生异常和扩张1。对 VM 组织和内皮细胞（EC）的重要研究表明，两个基因存在功能获得性突变：TEK（编码酪氨酸激酶受体 TIE2）和 PIK3CA（编码 PI3 激酶（PI3K）的 p110α（催化亚基）亚型）2,3,4,5。这些体细胞突变导致包括 PI3K/AKT 在内的关键血管生成/生长信号通路发生配体非依赖性的过度激活，从而引起扩张的静脉畸形3。尽管已有这些重要的遗传学发现，但触发异常血管生成以及形成扩大的血管腔道的后续细胞和分子机制仍尚未完全阐明。

在正常和病理性血管生成过程中，新生血管从已有的血管网络中 sprout（出芽），内皮细胞（EC）经历一系列重要的细胞过程，包括增殖、迁移、细胞外基质（ECM）重塑以及管腔形成6。内皮细胞的二维和三维（2D/3D）体外培养是分别研究这些细胞特性的有力工具。然而，目前迫切需要一种小鼠模型，能够在宿主微环境中模拟病理性血管扩张，同时为转化研究中靶向药物的临床前评估提供高效平台。

迄今为止，尚未报道与 TIE2 功能获得性突变相关的转基因小鼠血管畸形（VM）模型。目前的转基因血管畸形小鼠模型依赖于激活型突变 PIK3CA p.H1047R 的全身性或组织特异性表达3,5。这些转基因动物为研究该 PIK3CA 热点突变在整体或特定组织中的效应提供了重要见解。然而，这些模型的局限性在于会形成高度病理性血管网络，导致早期死亡。因此，这些小鼠模型无法充分反映突变事件的散发性特征以及血管畸形病理的局部性本质。

相反，患者来源的异种移植模型是将来源于患者的病理组织或细胞移植或注射到免疫缺陷小鼠体内而建立的7。异种移植模型是深入认识疾病发展机制及发现新型治疗药物的有力工具8。此外，使用患者来源的细胞可使科研人员重现突变的异质性，从而研究患者表型的谱系特征。

本文描述了一种实验方案：将表达突变型组成性激活 TIE2 和/或 PIK3CA 的患者来源的血管畸形内皮细胞（VM EC）皮下注射至无胸腺裸鼠背部。如既往血管异种移植模型所述，注射的血管细胞被悬浮于细胞外基质（ECM）支架中，以促进血管生成9,10,11。这些 VM 内皮细胞可发生显著的形态发生，并在缺乏支持细胞的情况下形成扩张的、具有灌注功能的病理性血管。该血管畸形异种移植模型为靶向药物在抑制管腔异常扩张方面的临床前评估提供了一个高效的平台。

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方案

患者组织样本是在获得知情同意后，根据辛辛那提儿童医院医学中心（CCHMC）癌症与血液疾病研究所的机构审查委员会（IRB）批准的《肿瘤及血管异常患者组织样本与数据采集和储存方案》以及临床研究委员会的批准，从参与者处获取的。下述所有动物实验程序均已通过CCHMC机构动物护理与使用委员会的审查和批准。

1. 材料与储备溶液的准备

  1. 完全内皮细胞培养基（EGM）的制备
    1. 在内皮基础培养基（EBM）中添加试剂盒中包含的以下生长因子（参见材料表）：人成纤维细胞生长因子-β（hFGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）、Long Arg3 胰岛素样生长因子-I（R3-IGF-I）、抗坏血酸、表皮生长因子（EGF）、庆大霉素硫酸盐和两性霉素B，以及肝素。加入1%青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺（PSG）溶液和20%胎牛血清（FBS）。
      注意：不建议添加氢化可的松。
    2. 在超净工作台中使用0.2 µm瓶顶滤器将溶液无菌过滤至已灭菌的玻璃瓶中，分装至50 mL锥形管中，可在4 °C保存一周，或在-20 °C保存长达一年。
  2. 制备胶原酶A储备液
    1. 在1×磷酸盐缓冲液（PBS）中配制50 mg/mL的胶原酶A储备液。
    2. 在超净工作台中使用0.2 µm滤膜和注射器对溶液进行无菌过滤，分装为100 µL每份，于-20 °C保存。
  3. 制备组织收集培养基（缓冲液A）
    1. 通过将0.927 g二水氯化钙（CaCl2·2H2O）和1 g七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）加入500 mL蒸馏水中，配制Ca2+/Mg2+储备液。使用0.2 µm瓶顶滤器在超净工作台中将溶液无菌过滤至已灭菌的玻璃瓶中，室温（RT）保存。
    2. 在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中添加10% Ca2+/Mg2+溶液和2% FBS。
    3. 在超净工作台中使用0.2 µm滤膜和注射器对溶液进行无菌过滤，分装为5 mL每份，于-20 °C保存。
  4. 组织培养板的纤连蛋白包被
    1. 通过将5.3 g碳酸钠（Na2CO3；0.1 M）溶解于500 mL去离子水中，配制包被缓冲液（缓冲液B）。使用1 M盐酸（HCl）将缓冲液pH调节至9.4。在超净工作台中使用0.2 µm瓶顶滤器将溶液过滤至已灭菌的玻璃瓶中，室温（RT）保存。
    2. 包被时，分别向60 mm/100 mm/145 mm组织培养板中加入2 mL/5 mL/10 mL缓冲液B。加入1 µg/cm2人血浆纤连蛋白纯化蛋白溶液，并轻轻将液体均匀分布于培养板表面。
    3. 将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育20分钟。
    4. 吸除缓冲液B，并在接种细胞前用PBS洗涤培养板。

2. 从VM患者组织中分离内皮细胞

  1. 从实体血管畸形（VM）组织中分离内皮细胞（EC）
    注意：VM 组织通过减容手术切除12,13，操作需遵循经机构审查委员会（IRB）批准的方案。
    1. 用含 5% 青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSG）的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗 VM 组织（组织样本重量通常在 0.5 g 至 1.5 g 之间）。
    2. 将组织转移至 100 mm 细胞培养皿中，使用无菌外科解剖工具将组织样本切碎成小块，然后转移至 50 mL 圆锥形离心管中。
    3. 将 100 µL 胶原酶 A 储存液加入 5 mL 缓冲液 A 中，终浓度为 1 mg/mL，随后将该溶液加入组织中，在 37 °C 条件下振荡消化 30 分钟，每 5 分钟轻轻摇动一次。
    4. 在室温（RT）下，使用 6 mm 光面研杵在 50 mL 圆锥形离心管中小心研磨已消化的组织。
    5. 继续使用研杵小心研磨消化后的组织，同时加入 5 mL 含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2% PSG 的冷 PBS。重复此步骤四次。
    6. 将溶液通过 100 μm 细胞筛过滤至 50 mL 圆锥形离心管中，以去除组织碎片。
    7. 在室温下以 400 × g 离心细胞悬液 5 分钟。继续进行步骤 2.3。
  2. 从接受硬化治疗患者的病灶血液中分离 VM 内皮细胞（EC）
    1. 根据经 IRB 批准的方案，从接受硬化治疗的患者中获取人 VM 病灶血液。
    2. 用 PBS 稀释病灶血液（样本体积通常在 0.5 mL 至 5 mL 之间），终体积为 40 mL。
    3. 在室温下以 200 × g 离心细胞悬液 5 分钟。
  3. 初始细胞接种
    1. 弃去上清液，将单细胞沉淀重悬于 1 mL 内皮细胞生长培养基（EGM）中。
    2. 在纤维连接蛋白包被（1 µg/cm²）的 100 mm 培养皿中加入 9 mL 完全 EGM，并接种 1 mL 细胞悬液。
    3. 将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中培养。
    4. 每隔一天更换 2 mL 培养基，并添加 2 mL 经无菌过滤的胎牛血清（FBS）。
    5. 当细胞培养达到 40–50% 汇合度时，更换为完全 EGM。细胞通常需要 2–3 周达到此汇合度。
    6. 每日观察内皮细胞（EC）克隆的出现情况。可通过其典型的“鹅卵石样”形态识别（图 1A）。每个样本中通常出现 3–5 个 EC 克隆。
    7. 继续每隔一天更换培养基，持续 5–7 天，直至单个 EC 克隆开始相互接触。
  4. 手动分离单个 EC 克隆
    1. 为收获 EC 克隆，用 5 mL PBS 清洗培养皿，并使用移液管手动吸除液体。
    2. 将培养皿置于显微镜下，使用记号笔在皿盖和底部标记多个 EC 克隆的位置，然后将其放回超净工作台。
    3. 通过在标记区域滴加 50 µL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，使 EC 克隆脱落。
    4. 使用小型细胞刮刀或移液器吸头，轻轻刮取培养皿上的细胞。
    5. 将培养皿倾斜至最近的边缘，每处标记区域用 1 mL EGM 冲洗并收集细胞。
    6. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞数量。
    7. 将收集的 EC 克隆以 1 × 104 个细胞/cm2 的密度接种至含新鲜 EGM 的纤维连接蛋白包被（1 µg/cm²）细胞培养皿中。次日更换为完全 EGM。
    8. 每隔一天更换为完全 EGM，持续 2–3 周，直至细胞达到 80% 汇合度。
    9. 每 100 mm 培养皿使用 2 mL 预热至 37 °C 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液消化 EC 2 分钟，随后加入 4 mL EGM 中和胰蛋白酶活性。
    10. 将细胞悬液收集至一个 15 mL 圆锥形离心管中，在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 2 mL EGM 中。
    11. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞数量。通常每 60 mm 细胞培养皿可获得约 1 × 106 个细胞，每 100 mm 组织培养皿可获得约 2 × 106 个细胞。
    12. 在室温下以 400 × g 离心 5 分钟使细胞成团，弃去上清液。继续进行步骤 3.2.1。

3. 内皮细胞的筛选与扩增

  1. 抗CD31偶联磁珠的制备
    1. 将含有抗CD31偶联磁珠的小瓶涡旋振荡30秒。所需磁珠数量为8 × 106 磁珠/2 × 106 细胞。
    2. 在1.5 mL微量离心管中，用1 mL含0.1% BSA的PBS洗涤液洗涤所需量的抗CD31偶联磁珠。
    3. 将微量离心管置于细胞分离磁铁上1分钟。
    4. 吸除上清液，并重复洗涤步骤。
  2. 内皮细胞的纯化与接种
    1. 将步骤2.4.12中获得的细胞沉淀重悬于500 µL含0.1% BSA的PBS洗涤液中 。
    2. 将细胞悬液加入含有磁珠的微量离心管中，并充分重悬。
    3. 在4 °C下轻轻倾斜孵育20分钟。
    4. 加入500 µL含0.1% BSA的PBS，充分混匀。
    5. 将离心管置于细胞分离磁铁上1分钟。
    6. 小心吸除全部液体，此液体中含有未结合磁珠的CD31阴性细胞组分，注意不要触碰磁珠。
    7. 用1 mL含0.1% BSA的PBS洗涤含有CD31阳性细胞组分的磁珠沉淀，并重复磁性分离步骤。
    8. 至少重复洗涤和磁性分离步骤3次，以纯化CD31阳性细胞组分。
    9. 将纯化的内皮细胞重悬于15 mL锥形管中，在室温下以400 × g离心5分钟。
    10. 去除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL EGM培养基中。
    11. 向已包被纤维连接蛋白（1 µg/cm²）的100 mm培养皿中加入9 mL完全EGM培养基，并接种1 mL细胞悬液。注意：在初始接种步骤中，部分磁珠仍附着于细胞表面。大多数磁珠会在细胞扩增过程中被洗去，但在早期传代中可能仍有少量残留。
    12. 将细胞置于37 °C、含5% CO2的湿润环境中孵育。
    13. 每隔一天更换一次培养基，直至细胞达到80%汇合度（图1B）。
  3. 内皮细胞扩增
    1. 当细胞达到80%汇合度时，在37 °C下使用每100 mm培养皿2 mL的0.05%胰蛋白酶-EDTA消化2分钟。
    2. 加入4 mL EGM中和胰蛋白酶，并将细胞收集至一个15 mL锥形管中。
    3. 在室温下以400 × g离心5分钟。
    4. 吸除上清液，将细胞重悬于2 mL EGM中，并使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞数量。
    5. 以1 × 104 细胞/cm²的密度将细胞接种至145 mm纤维连接蛋白包被（1 µg/cm²）的组织培养皿中。
    6. 继续传代培养细胞，直至达到所需细胞数量。请注意，一个完全汇合的145 mm组织培养皿约含有8–9 × 106个细胞，而每次注射所需细胞数为2.5 × 106个。仅应使用第3至第8代之间的细胞进行异种移植。

4. VM 患者来源异种移植模型实验方案

注意：本实验方案中使用 5‒6 周龄的雄性免疫缺陷型裸鼠（athymic nude Foxn1nu 小鼠）。

所有动物实验操作必须经过机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

  1. 注射前一天的材料准备
    1. 将注射器、针头和移液器吸头预先放入-20 °C冰箱中过夜冷却。
    2. 将基底膜细胞外基质（BMEM）缓慢置于冰桶中，在4 °C条件下过夜解冻，以避免凝胶黏度增加。
  2. 制备用于注射的细胞悬液
    1. 每145 mm培养皿使用5 mL预热至37 °C的0.05%胰蛋白酶-EDTA，在37 °C条件下对内皮细胞（EC）进行胰蛋白酶消化2分钟。
    2. 加入5 mL EGM中和胰蛋白酶，并将细胞收集至一个15 mL锥形管中。
    3. 在室温下以400 × g离心5分钟。
    4. 吸除上清液，用3 mL EGM重悬细胞，并使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞数量。
    5. 确定所有计划注射所需的总细胞数。
      注：推荐每针注射细胞数为2.5 × 106个细胞。每只小鼠通常进行两次注射以实现技术重复。需额外计算10%的细胞数量，以补偿转移至注射器过程中的细胞损失。
    6. 将含有计算所得细胞数量的体积转移至新的50 mL锥形管中，并在室温下以400 × g离心5分钟，使细胞成团。
    7. 吸除上清液，保留少量液体（约50–70 µL），以便松动细胞沉淀。
  3. 注射器准备
    1. 每针额外计算20 µL的过量体积，以补偿转移至注射器时的损失。在冰上用每针220 µL的BMEM重悬细胞沉淀。每处病灶注射的细胞悬液体积为200 μL。
    2. 在冰上充分混匀细胞悬液，以获得均一的细胞悬液，并避免产生气泡。
    3. 使用1 mL移液器和1 mL注射器，通过同时抽吸的力量将BMEM-细胞混合物吸入注射器开口，同时拉动注射器活塞。
    4. 将26G × 5/8英寸无菌针头通过鲁尔锁连接至注射器，并将准备好的注射器平放在冰上，直至注射前。
  4. 小鼠皮下注射
    1. 使用异氟烷蒸发器，以1 L/min的流速给予5%异氟烷/氧气混合气体对小鼠进行麻醉。确保动物充分镇静（例如，对脚趾夹捏无反应）。通过鼻罩持续给予1.5%异氟烷/氧气维持麻醉状态。
    2. 将小鼠俯卧放置，暴露将要进行移植的背部区域，并用70%乙醇对注射区域进行消毒。
    3. 轻轻滚动已准备好的注射器以重悬任何沉降的细胞。轻弹使气泡移至注射器针头端，并排出少量细胞悬液，以确保所有气泡被清除。
      注：每只小鼠可进行两次注射——分别位于小鼠背部左侧和右侧。
    4. 用拇指和食指捏起皮肤，形成“帐篷样”结构，将针头皮下插入皮肤正下方。通过释放捏起的皮肤确认针头仅位于皮下，防止注射至肌肉组织。
    5. 保持针头呈45°角，小心注入200 µL细胞悬液，形成一个小的球形肿块（图1C）。
    6. 使用电子天平记录小鼠体重，标记耳缘编号，并将小鼠放回笼中。
    7. 在麻醉后监测小鼠，确保其恢复至正常活动状态。
  5. 病灶生长监测
    1. 使用游标卡尺测量每个植入物的长度和宽度（图1D）。
    2. 每隔一天记录一次测量数据，直至收集病灶样本。

5. 组织采集与处理

  1. 在植入后第9天，将小鼠放入CO2安乐死舱中实施安乐死，并检查生命体征以确认死亡。随后对小鼠实施颈椎脱位，作为辅助安乐死手段。
  2. 使用手术镊和剪刀解剖小鼠侧 flank 部位，取出异种移植病灶/组织块。
    注意：为防止破坏组织块内充血的血管，操作时应避免解剖器械直接接触病灶组织块，并保留较多的周围组织（如皮肤）附着于组织块上。
  3. 将切除的病灶组织块浸入PBS中进行清洗。
  4. 设置带有相机的拍摄平台。将组织块整齐排列在带有刻度尺的切板上，拍摄所有组织块的照片，以记录病灶的大体血管情况（图1E）。
  5. 将组织块浸入10%福尔马林溶液中，室温下固定过夜。
  6. 次日用PBS清洗组织块，随后转移至70%乙醇中保存。
  7. 将病灶组织块送至病理核心实验室，进行石蜡包埋处理。

6. 病变组织切片

  1. 使用切片机将收集的小鼠病灶切成5 μm厚的切片，并置于带正电荷的载玻片上。
    注意：后续分析应选取位于组织块中心区域的切片（约在组织内部50‒70 µm处）。
  2. 染色前于60 °C下加热1小时以熔化石蜡。
  3. 在化学通风橱中依次进行脱蜡和水化处理。将载玻片依次置于二甲苯中孵育10分钟、100%乙醇（EtOH）中5分钟、90%乙醇中3分钟、80%乙醇中3分钟。
  4. 用去离子水冲洗载玻片5分钟。

7. 苏木精和伊红（H&E）

  1. 将切片在苏木精中孵育 2 分钟。
  2. 将载玻片放入染色缸中，在水槽中用持续流动的自来水冲洗，直至水变澄清。
  3. 依次将组织在 70% 乙醇中孵育 1 分钟、80% 乙醇中孵育 1 分钟、90% 乙醇中孵育 1 分钟、100% 乙醇中孵育 1 分钟，以及新鲜的 100% 乙醇中孵育 1 分钟，以完成脱水。
  4. 用伊红 Y 对切片染色 30 秒。
  5. 在新鲜的 100% 乙醇中冲洗，直至溶液澄清。
  6. 将载玻片在二甲苯中孵育 2 分钟，在通风橱中干燥 5‒10 分钟。
  7. 在异种移植组织切片上滴加一滴永久性非水封片剂，然后盖上盖玻片。
  8. 将载玻片避光过夜干燥后再进行成像。

8. 免疫组织化学

  1. 通过称取0.6 g Tris碱和1 mL 0.5 M EDTA溶于500 mL去离子水中配制抗原修复缓冲液（Tris-EDTA）。用1 M HCl调节pH至9.0。加入250 µL Tween-20。
  2. 将脱蜡的组织切片（按步骤6.2‒6.3所得）放入烧杯中，加入抗原修复缓冲液，在加热板上搅拌，95 °C孵育20分钟。
  3. 从加热板上取下烧杯，让溶液冷却至35 °C，然后用PBS洗涤3分钟。
  4. 用含5%正常马血清的PBS在室温下封闭组织切片30分钟。
  5. 通过将生物素标记的Ulex europaeus凝集素-I（UEA-I）稀释至20 µg/mL于含5%正常马血清的PBS中，配制生物素化UEA-I工作液。
  6. 每张切片加入50‒100 µL UEA-I工作液，在湿盒中室温孵育1小时。
  7. 用PBS洗涤切片两次，每次3分钟。
  8. 在室温下用3%过氧化氢淬灭切片5分钟。
  9. 用PBS洗涤切片两次，每次3分钟。
  10. 将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素稀释至5 µg/mL于含5%正常马血清的PBS中。
  11. 每张组织切片上加50‒100 µL，于湿盒中室温孵育1小时。
  12. 用PBS洗涤切片两次，每次3分钟。
  13. 根据制造商说明书配制3,3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液，每张切片加50‒100 µL。
  14. 孵育切片10‒15分钟，每隔2‒5分钟检查并监测染色显色情况。
  15. 用PBS洗涤切片三次，每次3分钟。
  16. 滴加一滴苏木精，孵育3分钟。
  17. 将切片放入染色缸中，在水槽下用持续流动的自来水冲洗，直至水变澄清。
  18. 依次将切片在80%乙醇中孵育1分钟、90%乙醇中孵育1分钟、100%乙醇中孵育1分钟，以及二甲苯中孵育2分钟。
  19. 在通风橱下干燥切片5‒10分钟。
  20. 在异种移植组织切片上滴加一滴永久性非水封片剂，盖上盖玻片。
  21. 封片后过夜干燥，再进行成像。

9. 人源性血管通道的分析

注意：VM 病变的血管化程度通过测量血管面积和血管密度来量化。仅考虑 UEA-I 阳性、人源性血管通道进行定量分析。

  1. 使用明场显微镜在20倍放大倍数（高倍视野 [HPF]）下，对每个病灶切片拍摄四到五张图像。在病灶切片内以x轴平面模式采集HPF图像，避免重叠（图1F-H）。所拍摄的图像需包含比例尺。
  2. 在Image J中打开 HPF图像（文件 > 打开）。按以下步骤校准比例尺的像素：使用直线工具划过比例尺，然后点击 分析 > 设置尺度，将测得的像素转换为毫米（mm）。
  3. 点击 分析 > 设置测量项，并选择 面积 和 添加至叠加图。
  4. 使用 分析 > 测量 功能测量一个HPF内的总视野面积。将此测量值保存，用于第9.8步的定量分析。
  5. 使用自由选择工具，手动勾勒UEA-I+血管通道。
    注：血管通道定义为任何由UEA-I+内皮细胞（EC）衬覆、并可能含有血细胞的区域。
  6. 点击 分析 > 测量，以量化所勾勒的UEA-I+血管面积（mm2/HPF）。
  7. 对同一组织块内获取的所有五个HPF图像重复此测量。
  8. 计算五个HPF血管总面积的平均值。所得每HPF血管面积随后除以HPF视野面积（单位为mm2，见第9.5步），并以百分比（%）表示。
  9. 为定量血管密度，需统计每个HPF中UEA-I+血管通道的数量。血管密度表示为每HPF面积内UEA-I+血管通道的平均数量（血管/mm2）。

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结果

本方案描述了基于将患者来源的内皮细胞（EC）皮下注射至免疫缺陷裸鼠背部，建立小鼠血管畸形（VM）异种移植模型的过程。在从VM组织或病灶血液中初次分离细胞后，可在4周内收获内皮细胞克隆（图1A,B）。注射后次日，异种移植病灶栓塞物覆盖的表面积约为80‒100 mm2。据我们观察，携带TIE2/PIK3CA突变EC的病灶栓塞物在注射后7‒9天内即可出现肉眼可见的血管化并实现灌注14,15（图1C-E）。然而，病灶生长程度存在差异，反映了患者及样本间的异质性。

病灶组织块能够高度再现人类血管畸形（VM）组织的组织病理学特征：扩张的血管腔由单层扁平的内皮细胞衬覆（图1F‒H）。这些血管结构通常含有红细胞，证实其与宿主小鼠的脉管系统形成...

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讨论

本文描述了一种建立静脉畸形（VM）患者来源异种移植模型的方法。该小鼠模型为研究者深入理解病理性管腔扩张提供了优良的实验体系，并将有助于开发更有效且具有靶向性的VM治疗策略。该方法也可轻松拓展用于研究其他类型的血管畸形，例如毛细血管淋巴管静脉畸形16。要成功构建可重复的血管病变模型，有几个关键步骤。首先，患者来源的内皮细胞在注射时必须保持纯度（不含其他细胞类型）并处于指数生长期。污染的成纤维细胞或其他间充质非内皮细胞（non-EC）通常具有细长的形态，易于识别。极少数情况下，即使使用抗CD31抗体偶联磁珠进行纯化后，培养物中仍可能残留少量非内皮细胞，此类培养物需进一步利用内皮特异性细胞表面标志物进行纯化。另一种替代方法是进行内皮细胞的单细胞克隆扩增，可确保突变内皮细胞（mutant-EC）的均一性，因为整个培养物中的所有细胞均来源于单一细胞。然而，该方法不推荐用于VM来源的内皮细胞，因为此类细胞在经历9‒10次传代后通常会停止增殖，并转变为衰老表型。因此，在异种移植实验中必须使用第3至8代之间的细胞，且注射前一日不得进行传代操作。

异种...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Nora Lakes 对本文的校对。本手稿中报道的研究工作由美国国立卫生研究院下属的国家心肺血液研究所资助，资助编号为 R01 HL117952（E.B.）。本内容完全由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
裸鼠（无胸腺），(Foxn1-nu)；5-6周龄，雄性Envigo069(nu)/070(nu/+)皮下注射
生物素标记的荆豆凝集素-I（UEA-I）Vector LaboratoriesB-1065组织学分析
瓶顶滤器（500 ml；0.2 µM）Thermo Fisher974106细胞培养
牛血清白蛋白（BSA）BSAA7906-50MG细胞培养；组织学分析
二水合氯化钙（CaCl2·2H2O）SigmaC7902-500G细胞培养
游标卡尺Electron Microscopy Sciences50996491病灶栓测量
CD31偶联磁珠（Dynabeads）Life Technologies11155D内皮细胞分离
细胞筛（100 μM）Greiner542000细胞培养
胶原酶ARoche10103578001细胞培养
锥形管；聚丙烯（15 mL）Greiner07 000 241细胞培养
锥形管；聚丙烯（50 mL）Greiner07 000 239细胞培养
柯普林染色缸Ted Pella21029组织学分析
盖玻片（50 × 22 mm）Fisher Scientific12545E组织学分析
DAB：3,3'-二氨基联苯胺试剂（ImmPACT DAB）Vector LaboratoriesSK-4105组织学分析
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Corning10-027-CV细胞培养
DynaMag-2Life Technologies12321D内皮细胞分离
耳标钳VWR10806-286皮下注射
EDTA（0.5 M，pH 8.0）Life Technologies15575-020组织学分析
内皮细胞生长培养基-2（EGM2）子弹套装（基础培养基及补充剂）LonzaCC-3162细胞培养
伊红Y（酒精基）Thermo Scientific71211组织学分析
乙醇Decon Labs2716组织学分析
胎牛血清（FBS），HyCloneGE HealthcareSH30910.03细胞培养
带滤芯吸头 1,250 μLMidSciAV1250-H多个步骤
带滤芯吸头 20 μLVWR10017-064多个步骤
带滤芯吸头 200 μLVWR10017-068多个步骤
缓冲福尔马林溶液（10%）SigmaF04586病灶栓解剖
血细胞计数板（INCYTO；一次性）SKC FILMSDHCN015细胞培养
苏木精Vector HematoxylinH-3401组织学分析
人血浆纤维连接蛋白纯化蛋白（1 mg/mL）SigmaFC010-10MG细胞培养
过氧化氢溶液（30% w/w）SigmaH1009组织学分析
ImageJ 软件分析
异氟烷，USPAkorn Animal Health59399-106-01皮下注射
七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O）SigmaM1880-500G细胞培养
基底膜基质（无酚红；无LDEV）Corning356237皮下注射
微量离心管（1.5 mL）VWR87003-294内皮细胞分离
显微镜载玻片 Superfrost（75 mm × 25 mm）Fisher Scientific1255015-CS组织学分析
针头，26G × 5/8 英寸，皮下无菌针头Becton Dickinson (BD)BD305115皮下注射
正常马血清Vector LaboratoriesS-2000组织学分析
青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺（100X）Corning30-009-CI细胞培养
永久封片剂（VectaMount）Vector LaboratoriesH-5000组织学分析
研钵C型，光滑头Thomas Scientific3431F55内皮细胞分离
磷酸盐缓冲液（PBS）Fisher ScientificBP3994细胞培养
电子天平VWR65500-202皮下注射
血清移液管（10 ml）VWR89130-898细胞培养
血清移液管（5 ml）VWR89130-896细胞培养
碳酸钠（Na2CO3）Sigma223530细胞培养
链霉亲和素-辣根过氧化物酶浓缩液（用于免疫组化）Vector LaboratoriesSA-5004细胞培养
注射器（60 ml）BD Biosciences309653细胞培养
注射器滤器（0.2 µM）Corning431219细胞培养
注射器（1 mL，带鲁尔锁）Becton Dickinson (BD)BD-309628皮下注射
细胞培养处理培养皿（100 × 20 mm）Greiner664160细胞培养
细胞培养处理培养皿（145 × 20 mm）Greiner639160细胞培养
细胞培养处理培养皿（60 × 15 mm）Eppendorf30701119细胞培养
Tris碱（Trizma碱）SigmaT6066组织学分析
台盼蓝溶液（0.4%）Life Technologies15250061细胞培养
胰蛋白酶-EDTA，1X（0.05% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA）Corning25-052-Cl细胞培养
吐温-20Biorad170-6531组织学分析
惠顿瓶VWR16159-798细胞培养
二甲苯Fisher ScientificX3P-1GAL组织学分析

参考文献

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