我们提供了一种建立静脉畸形小鼠异种移植模型的详细方案。该模型基于皮下注射携带TIE2和/或PIK3CA基因激活突变的患者来源内皮细胞。异种移植病灶能够高度模拟静脉畸形患者组织的组织病理学特征。
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本文内容
摘要
摘要
静脉畸形（VM）是一种血管发育异常，由静脉网络发育障碍导致，表现为扩张且常有功能障碍的静脉。本文旨在详细描述一种模拟人类静脉畸形并能反映患者异质性的鼠类异种移植模型的建立方法。研究发现，内皮细胞（EC）中激活性体细胞（非遗传性）TEK（TIE2）和PIK3CA基因突变是导致静脉畸形病理性血管扩张的主要驱动因素。以下方案描述了携带突变型TIE2和/或PIK3CA的患者来源内皮细胞的分离、纯化与扩增过程。将这些内皮细胞皮下注射至免疫缺陷的无胸腺小鼠背部，以形成扩张的血管样结构。使用携带TIE2或PIK3CA突变的内皮细胞所形成的病灶在注射后7‒9天内即可观察到明显的血管化，并在组织病理学特征上重现了静脉畸形患者组织的表现。该静脉畸形异种移植模型为研究驱动静脉畸形形成与扩展的细胞和分子机制提供了可靠的平台。此外，该模型在转化医学研究中具有重要价值，可用于评估新型候选药物在抑制人类静脉畸形中异常血管扩张方面的有效性。
引言
血管系统发育缺陷是多种疾病的潜在病因，包括静脉畸形（VM）。VM 是一种先天性疾病，其特征是静脉的形态发生异常和扩张1。对 VM 组织和内皮细胞（EC）的重要研究表明，两个基因存在功能获得性突变：TEK（编码酪氨酸激酶受体 TIE2）和 PIK3CA（编码 PI3 激酶（PI3K）的 p110α（催化亚基）亚型）2,3,4,5。这些体细胞突变导致包括 PI3K/AKT 在内的关键血管生成/生长信号通路发生配体非依赖性的过度激活，从而引起扩张的静脉畸形3。尽管已有这些重要的遗传学发现，但触发异常血管生成以及形成扩大的血管腔道的后续细胞和分子机制仍尚未完全阐明。
在正常和病理性血管生成过程中，新生血管从已有的血管网络中 sprout（出芽），内皮细胞（EC）经历一系列重要的细胞过程，包括增殖、迁移、细胞外基质（ECM）重塑以及管腔形成6。内皮细胞的二维和三维（2D/3D）体外培养是分别研究这些细胞特性的有力工具。然而，目前迫切需要一种小鼠模型，能够在....
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方案
患者组织样本是在获得知情同意后，根据辛辛那提儿童医院医学中心（CCHMC）癌症与血液疾病研究所的机构审查委员会（IRB）批准的《肿瘤及血管异常患者组织样本与数据采集和储存方案》以及临床研究委员会的批准，从参与者处获取的。下述所有动物实验程序均已通过CCHMC机构动物护理与使用委员会的审查和批准。
1. 材料与储备溶液的准备
- 完全内皮细胞培养基（EGM）的制备
- 在内皮基础培养基（EBM）中添加试剂盒中包含的以下生长因子（参见材料表）：人成纤维细胞生长因子-β（hFGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）、Long Arg3 胰岛素样生长因子-I（R3-IGF-I）、抗坏血酸、表皮生长因子（EGF）、庆大霉素硫酸盐和两性霉素B，以及肝素。加入1%青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺（PSG）溶液和20%胎牛血清（FBS）。
注意：不建议添加氢化可的松。 - 在超净工作台中使用0.2 µm瓶顶滤器将溶液无菌过滤至已灭菌的玻璃瓶中，分装至50 mL锥形管中，可在4 °C保存一周，或在-20 °C保存长达一年。
- 在内皮基础培养基（EBM）中添加试剂盒中包含的以下生长因子（参见材料表）：人成纤维细胞生长因子-β（hFGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）、Long Arg3 胰岛素样生长因子-I（R3-IGF-I）、抗坏血酸、表皮生长因子（EGF）、庆大霉素硫酸盐和两性霉素B，以及肝素。加入1%青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺（PSG）溶液和20%胎牛血清（FBS）。
- 制备胶原酶A储备液
- 在1×磷酸盐缓冲液（PBS）中配制50 mg/mL的胶原酶A储备液。
- 在超净工作台中使用0.2 µm滤膜和注射....
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结果
本方案描述了基于将患者来源的内皮细胞（EC）皮下注射至免疫缺陷裸鼠背部，建立小鼠血管畸形（VM）异种移植模型的过程。在从VM组织或病灶血液中初次分离细胞后，可在4周内收获内皮细胞克隆（图1A,B）。注射后次日，异种移植病灶栓塞物覆盖的表面积约为80‒100 mm2。据我们观察，携带TIE2/PIK3CA突变EC的病灶栓塞物在注射后7‒9天内即可出现肉眼可见的血管化并实现灌注14,15（图1C-E）。然而，病灶生长程度存在差异，反映了患者及样本间的异质性。
病灶组织块能够高度再现人类血管畸形（VM）组织的组织病理学特征：扩张的血管腔由单层扁平的内皮细胞衬覆（图1F‒H）。这些血管结构通常含有红细胞，证实其与宿主小鼠的脉管系统形成.......
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讨论
本文描述了一种建立静脉畸形（VM）患者来源异种移植模型的方法。该小鼠模型为研究者深入理解病理性管腔扩张提供了优良的实验体系，并将有助于开发更有效且具有靶向性的VM治疗策略。该方法也可轻松拓展用于研究其他类型的血管畸形，例如毛细血管淋巴管静脉畸形16。要成功构建可重复的血管病变模型，有几个关键步骤。首先，患者来源的内皮细胞在注射时必须保持纯度（不含其他细胞类型）并处于指数生长期。污染的成纤维细胞或其他间充质非内皮细胞（non-EC）通常具有细长的形态，易于识别。极少数情况下，即使使用抗CD31抗体偶联磁珠进行纯化后，培养物中仍可能残留少量非内皮细胞，此类培养物需进一步利用内皮特异性细胞表面标志物进行纯化。另一种替代方法是进行内皮细胞的单细胞克隆扩增，可确保突变内皮细胞（mutant-EC）的均一性，因为整个培养物中的所有细胞均来源于单一细胞。然而，该方法不推荐用于VM来源的内皮细胞，因为此类细胞在经历9‒10次传代后通常会停止增殖，并转变为衰老表型。因此，在异种移植实验中必须使用第3至8代之间的细胞，且注射前一日不得进行传代操作。
异种.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Nora Lakes 对本文的校对。本手稿中报道的研究工作由美国国立卫生研究院下属的国家心肺血液研究所资助，资助编号为 R01 HL117952（E.B.）。本内容完全由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 裸鼠（无胸腺），(Foxn1-nu)；5-6周龄，雄性 | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | 皮下注射 |
| 生物素标记的荆豆凝集素-I（UEA-I） | Vector Laboratories | B-1065 | 组织学分析 |
| 瓶顶滤器（500 ml；0.2 µM） | Thermo Fisher | 974106 | 细胞培养 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | BSA | A7906-50MG | 细胞培养；组织学分析 |
| 二水合氯化钙（CaCl2·2H2O） | Sigma | C7902-500G | 细胞培养 |
| 游标卡尺 | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | 病灶栓测量 |
| CD31偶联磁珠（Dynabeads） | Life Technologies | 11155D | 内皮细胞分离 |
| 细胞筛（100 μM） | Greiner | 542000 | 细胞培养 |
| 胶原酶A | Roche | 10103578001 | 细胞培养 |
| 锥形管；聚丙烯（15 mL） | Greiner | 07 000 241 | 细胞培养 |
| 锥形管；聚丙烯（50 mL） | Greiner | 07 000 239 | 细胞培养 |
| 柯普林染色缸 | Ted Pella | 21029 | 组织学分析 |
| 盖玻片（50 × 22 mm） | Fisher Scientific | 12545E | 组织学分析 |
| DAB：3,3'-二氨基联苯胺试剂（ImmPACT DAB） | Vector Laboratories | SK-4105 | 组织学分析 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Corning | 10-027-CV | 细胞培养 |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | 内皮细胞分离 |
| 耳标钳 | VWR | 10806-286 | 皮下注射 |
| EDTA（0.5 M，pH 8.0） | Life Technologies | 15575-020 | 组织学分析 |
| 内皮细胞生长培养基-2（EGM2）子弹套装（基础培养基及补充剂） | Lonza | CC-3162 | 细胞培养 |
| 伊红Y（酒精基） | Thermo Scientific | 71211 | 组织学分析 |
| 乙醇 | Decon Labs | 2716 | 组织学分析 |
| 胎牛血清（FBS），HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | 细胞培养 |
| 带滤芯吸头 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | 多个步骤 |
| 带滤芯吸头 20 μL | VWR | 10017-064 | 多个步骤 |
| 带滤芯吸头 200 μL | VWR | 10017-068 | 多个步骤 |
| 缓冲福尔马林溶液（10%） | Sigma | F04586 | 病灶栓解剖 |
| 血细胞计数板（INCYTO；一次性） | SKC FILMS | DHCN015 | 细胞培养 |
| 苏木精 | Vector Hematoxylin | H-3401 | 组织学分析 |
| 人血浆纤维连接蛋白纯化蛋白（1 mg/mL） | Sigma | FC010-10MG | 细胞培养 |
| 过氧化氢溶液（30% w/w） | Sigma | H1009 | 组织学分析 |
| ImageJ 软件 | 分析 | ||
| 异氟烷，USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | 皮下注射 |
| 七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O） | Sigma | M1880-500G | 细胞培养 |
| 基底膜基质（无酚红；无LDEV） | Corning | 356237 | 皮下注射 |
| 微量离心管（1.5 mL） | VWR | 87003-294 | 内皮细胞分离 |
| 显微镜载玻片 Superfrost（75 mm × 25 mm） | Fisher Scientific | 1255015-CS | 组织学分析 |
| 针头，26G × 5/8 英寸，皮下无菌针头 | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | 皮下注射 |
| 正常马血清 | Vector Laboratories | S-2000 | 组织学分析 |
| 青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺（100X） | Corning | 30-009-CI | 细胞培养 |
| 永久封片剂（VectaMount） | Vector Laboratories | H-5000 | 组织学分析 |
| 研钵C型，光滑头 | Thomas Scientific | 3431F55 | 内皮细胞分离 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Fisher Scientific | BP3994 | 细胞培养 |
| 电子天平 | VWR | 65500-202 | 皮下注射 |
| 血清移液管（10 ml） | VWR | 89130-898 | 细胞培养 |
| 血清移液管（5 ml） | VWR | 89130-896 | 细胞培养 |
| 碳酸钠（Na2CO3） | Sigma | 223530 | 细胞培养 |
| 链霉亲和素-辣根过氧化物酶浓缩液（用于免疫组化） | Vector Laboratories | SA-5004 | 细胞培养 |
| 注射器（60 ml） | BD Biosciences | 309653 | 细胞培养 |
| 注射器滤器（0.2 µM） | Corning | 431219 | 细胞培养 |
| 注射器（1 mL，带鲁尔锁） | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | 皮下注射 |
| 细胞培养处理培养皿（100 × 20 mm） | Greiner | 664160 | 细胞培养 |
| 细胞培养处理培养皿（145 × 20 mm） | Greiner | 639160 | 细胞培养 |
| 细胞培养处理培养皿（60 × 15 mm） | Eppendorf | 30701119 | 细胞培养 |
| Tris碱（Trizma碱） | Sigma | T6066 | 组织学分析 |
| 台盼蓝溶液（0.4%） | Life Technologies | 15250061 | 细胞培养 |
| 胰蛋白酶-EDTA，1X（0.05% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA） | Corning | 25-052-Cl | 细胞培养 |
| 吐温-20 | Biorad | 170-6531 | 组织学分析 |
| 惠顿瓶 | VWR | 16159-798 | 细胞培养 |
| 二甲苯 | Fisher Scientific | X3P-1GAL | 组织学分析 |
参考文献
- Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
- Limaye, N., et al.
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