预测使用局部循环单核祖细胞在血管成形术治疗的危肢缺血患者截肢

外周动脉疾病 （PAD） 的特点是慢性和渐进性血管阻塞，血液供应有限¹.在全球范围内，下肢的PAD影响约10%的老年人口，而多达7%的此类病例被提交到截肢^2，3。

关键肢体缺血症 （CLI） 代表了 PAD¹的最严重表现。患者通常在休息时感到疼痛，溃疡或坏死可归因于动脉被遮挡:而临床预后不利，在1年^3、4、5年内截肢及死亡的风险为^30%。

血管成形术是一种微创的血管内程序，可以恢复血液流向下肢的患者与CLI:然而，一些患者将不可避免地需要截肢，即使在血管成形术治疗^1，5。早期识别血管成形术后的不利结果是相当有价值的，由于治疗执行的可能性。

传统危险因素可能为接受血管成形术⁶的CLI患者的主要肢体截肢提供有限的预测能力。以病理生理学为导向的生物标志物代表具有潜在临床应用的新方法，在血管损伤相关疾病中可能特别有用^。如今，拥有内皮修复性能的细胞种群在动脉粥样硬化斑块的所在地的参与，已日益得到认可^。

单核先天细胞（MPC）源自骨髓，具有血管再生能力的干细胞具有自身的结构和功能特征。由于MPC具有扩散、迁移和显示血管依从性的能力;这些细胞已成为良好的候选者，以反映内皮修复，以回应缺血^{10，11，12。}此外，对血管损伤基础机制的持续关注促使人们探索局部生物标志物的预后作用，因为它们被认为反映了血管损伤并修复^{了7、13、14。}

本研究的目的是描述如何确定在进行血管成形术的CLI患者中，在血管阻塞附近传播的MPC数量:以及如何评估MPC与内皮功能障碍和截肢指标之间的关系。

与基于合并症和内脏血管特征的预后相比，局部MPC的数量显示出预测内皮功能障碍和截肢临床结果的具体能力。一直来，一些研究描述了类似的生物标志物在评估PAD^15，16患者时的预后作用。

根据先前的结果^7，这里描述的方法可能有助于早期识别在几个临床环境中有不良血管结果风险的人口，如下肢和冠状缺血，中风，血管炎，静脉血栓和其他涉及血管损伤和修复。

国家"20德诺维姆布雷"ISSTE中心的机构研究伦理委员会批准了这项未来的议定书，所有登记的患者均表示书面知情同意。

1. 下肢血管块评估、血液取样和气球血管成形术

注:用于此实验的研究样本包括20名糖尿病患者，年龄为68岁，20人中有10人为男性。样本中有一半是吸烟者，最常见的共病是2型糖尿病、全身动脉高血压和/或脂质血症。该样本旨在针对年龄、性别和共同发病率进行标准化。不能排除临床人口影响对MPC和CLI之间关系的可能偏差。

1. 根据卢瑟福分类^13（ 见 补充表1）评估肢体缺血的临床严重程度。
2. 进行下肢血管造影、血液取样和气球血管成形术。
   1. 手术前使用抗凝血剂和麻醉药。
   2. 在选择的腹股沟部位将 18 G 针插入血管。
   3. 放置介绍器并推进灵活的导线。然后，对于 6 Fr 介绍器，初始指南将进一步更改。
   4. 在荧光指南下定期注射对比介质或 CO_2，以确定动脉轨迹和血管阻塞部位（图 1）。
      注:使用对比介质 40 cc，稀释 1:1 在 0.9% 盐水，或 CO₂ 在 10 到 20 mL 每枪在 12 psi 的压力。
   5. 将两根 0.014 Fr 导航导线和两根 0.014 Fr 支持导线引入船舶，并将它们推进到受阻地点。
      注:在单个程序中，两根 0.014 Fr 导线（260 厘米长）用于导航，两根 0.014 Fr 导导导线（260 厘米长）用于支撑。
   6. 依次引入 5 Fr 和 3 Fr 导管，从离血管阻塞最近的部位收集 10 mL 血液。在冰上保持血液样本。
      注:导管尺寸可能是5 Fr和3 Fr，并且它们在操作过程中会更改。
   7. 再次推进导线。然后，引入血管成形气球导管，其中包含位于导管末端的充气气球。推进血管成形气球导管，将气球放置在病变部位。通过将气球充气到血管壁上的块状斑块上来执行血管成形术。验证血流恢复。
      注意:支架可能放置在阻塞区域，以帮助在手术后保持动脉打开。
   8. 引入导管，并推进到离血管块最近的部位。血管成形术后每隔30分钟采集10 mL的血液。在冰上保持血液样本。
      注:建议在血管成形术前后采集血液样本，以进一步评估血管成形术对MPC数量的影响。
   9. 在荧光引导下取出所有电线。
   10. 提供术后护理程序，包括每12小时1毫克/千克皮下使用enoxaparin、阿司匹林100毫克、他汀类药物和镇痛药的抗凝固疗法。在24小时内在血管穿刺部位压缩。

2. 循环单核祖细胞（MPCs）的量化（图2）

1. 到新鲜的 15 mL 圆锥管，转移收集的血液的 6 mL，用 PBS 稀释 1:1 （v/v）。
   注:从采集开始，在1小时内处理血液。
2. 准备密度梯度分离，通过增加2 mL的密度梯度介质到3个试管每个。然后，在每个试管中加入3个等量的稀释血液。
   注意:不要超过试管最大容量的四分之三。
3. 离心机在1，800 x g 30分钟，在4°C。 使用移液器将接口层作为环收集，并转移到一个新的管子中。添加 2 mL 的 PBS，并在 4 °C 下以 1，800 x g 旋转 6 分钟。 保存颗粒，因为这将包含MPC。
4. 按照步骤 2.3 的描述，通过离心将含有 PBS 的 MPC 颗粒洗净。每次洗涤使用新鲜的 PBS，在 4 °C 下以 1，800 x g 旋转 2 分钟。 重复该过程6次。
5. 最后一次清洗后，使用 1 mL 的 PBS 重新悬念细胞颗粒。稀释 20 μL 的细胞悬架，20 μL 的 0.4% 试盘蓝色，1:1 （v/v）。使用 10 μL 的这种细胞悬架，使用血细胞计和光显微镜进行细胞计数。
6. Aliquot 1 x 10⁶ MPC 在以前标记的 5 mL 流细胞管中。
   注:准备相应的同型匹配控制抗体。
7. 在 4 °C 下将管子在 1，800 x g 上离心 6 分钟。 吸气并丢弃超生剂。
8. 稀释抗体孵化液中 100 μL 的原发性抗体 [1 倍 PBS、pH 7.4、EDTA 2 mM、BSA 0.05%]，并添加到管子中。在黑暗中暂停10秒，在4°C下孵育20分钟。
   注:本协议中使用的主要抗体的最终浓度为 CD45 1:50、CD34 1:20、KDR 1:50、CD184 1:20、CD133 1:50。在此步骤中，可以通过在PBS中将淋巴细胞固定在4%的准甲醛中，并在4°C下将样品储存至24小时，从而停止协议。
9. 离心机在 1，800 x g 2 分钟在 4 °C 和丢弃超纳坦。在500μL的1倍PBS，pH 7.4，EDTA 2 mM中重新悬索。
10. 执行流细胞学分析。
    1. 设置具有同型匹配控制抗体的背景。然后，在FSC/SSC图中选择淋巴细胞扩散，试图排除细胞碎片、残留颗粒细胞和其他颗粒。这种分布被认为是100%。
       注:淋巴细胞通常分布在地块的左下部区域。
    2. 使用含有大量细胞CD45+和^CD34+的常见免疫型的门。然后，选择双阳性免疫型使用门，以前识别CD45+，CD34+，并添加KDR（VEGFR-2）+，CD133+或CD184+。 通过特定的细胞表面标记识别MPC子人口。报告为封闭事件的百分比。
11. 识别 MPC 的主要子人口。在本研究中，分析的免疫型为CD45+CD34+CD133+CD45^+CD34+CD184⁺CD45^+CD34+CD133⁺CD184⁺:CD45^+CD34+KDR⁺CD45^+CD34+KDR⁺CD133⁺和 CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184^7，17。
    注:这些细胞表面标记用于研究:CD45（淋巴细胞）、CD34（内皮细胞和/或血管细胞）、KDR（VEGFR-2）（内皮细胞膜标记）、CD133（内皮祖细胞）和CD184（造血干细胞和内皮细胞）。

3. MPC 与内皮功能和血动力学测试 （FMD） 的修改的关系

1. 确定流量介质拉长 （FMD），血管成形术前后。
   1. 使用血管直线传感器测量胸动脉的直径。
   2. 将植物烟雾计的袖口放在测量点上方的前臂上，在收缩压上方50 mmHg处放气5分钟，并放气。
   3. 在接下来的60年代内再次确定胸动脉的直径。使用下面的方程来估计 FMD。
      注:使用方程（%）=（瞬态缺血后的最大直径-基底直径）×100/基底直径计算扩张程度。
2. 将 MPC 的数量与 FMD 的基线 FMD 值和血管成形术后三角洲相关联。

4. 截肢的MPC的预后能力

1. 安排气球血管成形术和患者出院后的定期医疗预约，以评估流向下肢的血液质量。
2. 在血管成形术后2周评估肢体缺血的临床严重程度。根据卢瑟福分类^13，评估解决休息疼痛，降低缺血和保存功能脚。
3. 比较肢体缺血的临床严重程度，在基线与随访。确定因不良结果而需要严重截肢的病例。
4. 将MPC的数量与需要截肢的下肢的患者比例联系起来。

在血管成形术现场，从阻塞动脉采集的血液样本是从20名糖尿病患者身上采集的，年龄为68岁，20人中有10人为男性。样本人口中有一半是吸烟者。血管病变主要得分为卢瑟福六级:而患者显示2型糖尿病（100%）、高血压（70%）的患病率较高和血脂异常（55%）。

下肢血管成形术实施后30天的临床随访。血管成形术后基线或动力学的MPC亚人口百分比与内皮功能障碍程度相关（斯皮尔曼分析），FMD评估:在血管成形术（U-Mann惠特尼）之后接受或不进行肢体截肢的患者之间比较了MPC的基线数。研究表明，基线MPC亚人口CD45+CD34+KDR+负相关与FMD（图3A，左），而MPCCD45+CD34+CD133+CD184+血管成形术后的变化与FMD改善显著相关（图3B，右）。此外，在那些进化为截肢的患者中观察到MPC亚人口CD45+CD34+KDR+（图4A，B，左）的基线数量增加:以及血管成形术后减少MPC亚人口CD45+CD34+CD133+CD184+（图4A，C，右）。

图1:下肢血管造影和采血。（A） 在荧镜检查下，对比介质证明了血管轨迹。（B） 血管成形术前的血管阻塞。（C） 血管成形术后血管阻塞。血管外科医生使用导管从离血管阻塞和动脉瘤斑块最近的部位采集血液，实验室研究人员准备获取血液样本。箭头指示血管阻塞的部位。 请点击这里查看此数字的较大版本。

图2:血液样本制备和单核祖细胞（MPC）测定。（A） 密度梯度准备。（B） 血离心后淋巴细胞环分离。（C） 淋巴细胞相的收集。（D） 离心。（E） 试管底部的颗粒形成。（F） 细胞悬架计数。（G） 为流动细胞学准备淋巴细胞。（H） 通过流动细胞学确定细胞亚人口。 请点击这里查看此数字的较大版本。

图3:MPC与血动力学指标的关系。（A） 超声波的位置，以获得FMD和代表性的结果。（B） 基线% MPC 子人口 （左， CD45+CD34+KDR+:右， CD45+CD34+CD133+CD184+） 和基线 FMD 值之间的关系:以及血管成形术后（C）% MPCs 与血管成形术后 Fmd 改善的关系。缩写:MPC，单核先天细胞:FMD，流介质除污。 请点击这里查看此数字的较大版本。

图4:血管成形术后下肢截肢的MPC和预后。（A） MPC 亚人口代表性流动细胞学图像。（B） 在30天的随访中，基线%MPCs亚人口（左，CD45+CD34+KDR+:右，CD45+CD34 + CD133+CD184+），或（C） % MPCs 后血管成形术， 血管成形术后下肢截肢。缩写:MPC，单核祖细胞。请点击这里查看此数字的较大版本。

补充文件1:卢瑟福对肢体缺血严重程度的分类。请点击这里下载此文件。

作者没有什么可透露的。