利用血管成形术治疗的严重肢体缺血患者局部循环单个核祖细胞预测截肢风险

摘要

即使在严重肢体缺血（CLI）患者接受阻塞血管的血管成形术后，仍可能发生下肢截肢。单核祖细胞（MPCs）反映了血管修复能力。本方案描述了在血管成形术前后循环中MPCs的定量方法，及其与内皮功能障碍的关系，并用于预测下肢截肢风险。

摘要

严重肢体缺血（CLI）是外周动脉疾病的一个晚期阶段。血管成形术可改善下肢血流，但部分患者仍会不可逆地进展至肢体截肢。血管损伤的程度以及血管修复机制是影响血管成形术后预后的关键因素。单核祖细胞（MPCs）对血管损伤和修复具有反应性，并能够反映血管疾病状态。本方案描述了从接受血管成形术的 CLI 患者靠近手术部位的血管中采集的循环血液样本中定量 MPCs 的方法，以及 MPCs 与内皮功能障碍之间的关系，并评估其在血管成形术后30天内预测肢体截肢风险的能力。

引言

外周动脉疾病（PAD）的特点是慢性且进行性的血管阻塞，导致血液供应受限¹。在全球范围内，下肢PAD影响约10%的老年人群，其中高达7%的病例需接受截肢手术^2,3。

严重肢体缺血（CLI）是外周动脉疾病（PAD）最严重的表现形式¹。患者通常会出现静息痛、溃疡或因动脉闭塞导致的坏疽；临床预后较差，1年内截肢风险和死亡率均高达30%^3,4,5。

血管成形术是一种微创血管内手术，可恢复重症肢体缺血（CLI）患者下肢的血流；然而，即使在接受血管成形术治疗后，部分患者仍不可避免地需要接受大截肢手术^1,5。由于存在强化治疗的可能性，早期识别血管成形术后不良预后具有重要价值。

传统危险因素对于接受血管成形术的严重肢体缺血（CLI）患者发生重大截肢事件的预测能力可能有限

方案

本研究方案已获得 Centro Médico Nacional “20 de Noviembre” ISSSTE 机构研究伦理委员会的批准，所有入组患者均签署了书面知情同意书。

1. 下肢血管阻塞评估、采血及球囊血管成形术

注意：本实验所用研究样本包括20名糖尿病患者，年龄均为68岁，其中男性10名。半数样本为吸烟者，最常见的共病为2型糖尿病、系统性动脉高血压和/或血脂异常。样本在年龄、性别和共病方面力求标准化。由于临床人口学因素对MPCs与CLI之间关系的可能影响，尚不能排除潜在偏倚。

1. 根据Rutherford分级标准评估肢体缺血的临床严重程度¹³（参见补充表1）。
2. 进行下肢血管造影、采血及球囊血管成形术。
   1. 手术前使用抗凝药和麻醉药。
   2. 将18 G针头插入选定的腹股沟部位血管。
   3. 置入导引器并送入柔韧的导丝。随后将初始导引器更换为6 Fr导引器。
   4. 在透视引导下定期注射造影剂或CO₂，以识别动脉走行及血管阻塞部位（图1）。
      注：每次注射使用40 cc造影剂，以0.9%生理盐水1:1稀释，或每次注射10至20 mL C....

结果

从20名糖尿病患者（年龄68岁，其中10名男性）接受血管成形术治疗的阻塞动脉部位采集了血样。半数受试者有吸烟史。血管病变主要被评定为Rutherford VI级；患者中2型糖尿病（100%）、高血压（70%）和血脂异常（55%）的患病率较高。

在下肢血管成形术后进行了为期30天的临床随访。通过Spearman分析，将MPC亚群在基线时的比例或血管成形术后的动态变化与FMD评估的内皮功能障碍程度进行相关性分析；并采用Mann-Whitney U检验，比较术后发生或未发生肢体截肢患者的基线MPC数量。研究结果显示，基线时MPC亚群CD45⁺CD34⁺KDR⁺与FMD呈负相关（图3A，左）；而血管成形术后MPC亚群CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺的变化与FMD改善显著相关（图3B，右）。此外，在最终进展为肢.......

讨论

在血管阻塞的确切部位采血可能存在技术上的困难；因此，我们选择在血管阻塞附近进行采血。同样，靠近血管斑块处的MPC数量似乎具有高度动态性，可能在血管成形术前后出现变化。根据我们的观察，建议评估血管成形术前基线水平及术后30分钟时MPC数量的变化，因为这些变化可能反映了血管损伤与修复过程中发生的多种病理生理过程。

建议在采集血液样本后的前3小时内完成MPCs检测的样本处理；因此，血管科-血管外科团队与实验室研究人员之间可制定适当的组织计划，甚至可预先进行模拟演练。MPCs的分离操作应谨慎进行，特别是将血液样本置于密度梯度液中以及对含有MPCs的沉淀物进行洗涤的步骤。本课题组通常将细胞转移至流式管中，加入一抗，固定后于4 °C过夜保存；出于时间安排的便利性考虑，流式细胞术检测将在次日进行。

关于循环MPCs作为血管损伤与修复的有用临床生物标志物的作用，已有重要研究致力于在不同前体细胞之间标准化免疫表型¹⁷。全面的表征应包括参与各种血管疾病临床场景的循环前体细胞亚群。利用本文所述方法，我.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BSA	Roche	10735086001	牛血清白蛋白（BSA），用作缓冲剂、稳定剂、标准品以及混匀试剂。
校准微珠	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant 校准微珠以含 0.05% 叠氮化钠的水溶液形式提供，3.5 ml 可用于最多 100 次检测。
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	与 R-藻红蛋白偶联的抗体，溶于 PBS/EDTA 缓冲液中。
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	单克隆抗体，同型为重组人 IgG1，已偶联标记。
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	与 R-藻红蛋白偶联的抗体，溶于 PBS/EDTA 缓冲液中。
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	单克隆抗体克隆 AC136 可识别 CD34 的 III 类表位。
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	人源性偶联标记的单克隆 CD45 抗体。
锥形管	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15 ml 锥形离心管。
流式管	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL 聚苯乙烯圆底管，规格 12×75，无菌。
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	重金属（以铅计）<10 ppm，铁 <0.01%，砷 <1 ppm，不溶物 <0.005%。
改良型牛鲍计数板	无品牌	无目录号	用于细胞计数的血细胞计数板（量程 0.1000 mm，0.0025 mm²）。
K2 EDTA 血液采集管	BD Vacutainer	#367863	紫色塑料真空采血管（K2E），含 10.8 mg，6 mL。
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	无菌且经内毒素检测合格。密度：1.077±0.001 g/mL。
多聚甲醛	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	用于生物样本固定的试剂（粉末状，95%）。
1.3 mL 移液管	CRM Globe	PF1016, PF1015	移液管是一种可更精确转移液体的工具。
试管	KIMBLE CHASE	45060 13100	耐热试管，尺寸/容量：13 × 100 mm。