利用血管成形术治疗的严重肢体缺血患者局部循环单个核祖细胞预测截肢风险

摘要

即使在严重肢体缺血（CLI）患者接受阻塞血管的血管成形术后，仍可能发生下肢截肢。单核祖细胞（MPCs）反映了血管修复能力。本方案描述了在血管成形术前后循环中MPCs的定量方法，及其与内皮功能障碍的关系，并用于预测下肢截肢风险。

摘要

严重肢体缺血（CLI）是外周动脉疾病的一个晚期阶段。血管成形术可改善下肢血流，但部分患者仍会不可逆地进展至肢体截肢。血管损伤的程度以及血管修复机制是影响血管成形术后预后的关键因素。单核祖细胞（MPCs）对血管损伤和修复具有反应性，并能够反映血管疾病状态。本方案描述了从接受血管成形术的 CLI 患者靠近手术部位的血管中采集的循环血液样本中定量 MPCs 的方法，以及 MPCs 与内皮功能障碍之间的关系，并评估其在血管成形术后30天内预测肢体截肢风险的能力。

引言

外周动脉疾病（PAD）的特点是慢性且进行性的血管阻塞，导致血液供应受限¹。在全球范围内，下肢PAD影响约10%的老年人群，其中高达7%的病例需接受截肢手术^2,3。

严重肢体缺血（CLI）是外周动脉疾病（PAD）最严重的表现形式¹。患者通常会出现静息痛、溃疡或因动脉闭塞导致的坏疽；临床预后较差，1年内截肢风险和死亡率均高达30%^3,4,5。

血管成形术是一种微创血管内手术，可恢复重症肢体缺血（CLI）患者下肢的血流；然而，即使在接受血管成形术治疗后，部分患者仍不可避免地需要接受大截肢手术^1,5。由于存在强化治疗的可能性，早期识别血管成形术后不良预后具有重要价值。

传统危险因素对于接受血管成形术的严重肢体缺血（CLI）患者发生重大截肢事件的预测能力可能有限⁶。以病理生理机制为导向的生物标志物代表了一类具有潜在临床应用价值的新方法，在与血管损伤相关的疾病中可能具有特别的意义⁷。目前，具有内皮修复功能的细胞群体在动脉粥样硬化斑块局部的参与作用已受到越来越多的关注^8,9。

单核祖细胞（MPCs）来源于骨髓，具有干细胞的结构和功能特征，并具备血管再生能力。由于MPC能够增殖、迁移并表现出血管黏附性，这些细胞已成为反映缺血后血管修复的良好候选指标^10,11,12。此外，人们对血管损伤潜在机制的持续关注，也推动了对局部出现的生物标志物预后作用的探索，因为这些标志物被认为能够反映血管损伤与修复过程^7,13,14。

本研究的目的是描述如何确定在接受血管成形术的严重肢体缺血（CLI）患者中，循环至血管阻塞部位附近的单核祖细胞（MPCs）的数量；以及如何评估MPCs与内皮功能障碍指标和肢体截肢之间的关系。

与基于合并症和内在血管特征的预后相比，局部MPCs的数量在预测内皮功能障碍和肢体截肢等临床结局方面表现出特异性能力。一致地，一些研究已在外周动脉疾病（PAD）患者评估过程中描述了类似生物标志物的预后作用^15,16。

根据先前的研究结果⁷，本文所述方法可能有助于在多种临床情况下早期识别发生不良血管事件风险的人群，例如下肢和冠状动脉缺血、脑卒中、血管炎、静脉血栓形成以及其他涉及血管损伤与修复的疾病。

方案

本研究方案已获得 Centro Médico Nacional “20 de Noviembre” ISSSTE 机构研究伦理委员会的批准，所有入组患者均签署了书面知情同意书。

1. 下肢血管阻塞评估、采血及球囊血管成形术

注意：本实验所用研究样本包括20名糖尿病患者，年龄均为68岁，其中男性10名。半数样本为吸烟者，最常见的共病为2型糖尿病、系统性动脉高血压和/或血脂异常。样本在年龄、性别和共病方面力求标准化。由于临床人口学因素对MPCs与CLI之间关系的可能影响，尚不能排除潜在偏倚。

1. 根据Rutherford分级标准评估肢体缺血的临床严重程度¹³（参见补充表1）。
2. 进行下肢血管造影、采血及球囊血管成形术。
   1. 手术前使用抗凝药和麻醉药。
   2. 将18 G针头插入选定的腹股沟部位血管。
   3. 置入导引器并送入柔韧的导丝。随后将初始导引器更换为6 Fr导引器。
   4. 在透视引导下定期注射造影剂或CO₂，以识别动脉走行及血管阻塞部位（图1）。
      注：每次注射使用40 cc造影剂，以0.9%生理盐水1:1稀释，或每次注射10至20 mL CO₂，压力为12 psi。
   5. 将两根0.014 Fr的导航导丝和两根0.014 Fr的支撑导丝送入血管，并推进至阻塞部位。
      注：单次操作中使用两根0.014 Fr导丝（260 cm长）用于导航，另两根0.014 Fr导丝（260 cm长）用于支撑。
   6. 依次引入5 Fr和3 Fr导管，从最接近血管阻塞处采集10 mL血液。将血液样本置于冰上保存。
      注：导管尺寸可为5 Fr和3 Fr，操作过程中可根据需要更换。
   7. 再次推进导丝。然后引入球囊血管成形术导管，该导管末端带有可膨胀球囊。将球囊导管推进至病变部位，使球囊正对狭窄处。通过扩张球囊压迫血管壁上的阻塞斑块，完成血管成形术。确认血流恢复情况。
      注：术后可在阻塞区域植入支架，以帮助保持动脉通畅。
   8. 引入导管并推进至最接近血管阻塞的部位，在血管成形术后每隔30分钟采集10 mL血液。将血液样本置于冰上保存。
      注：建议在血管成形术前后采集血液样本，以进一步评估血管成形术对MPC数量的影响。
   9. 在透视引导下撤出所有导丝。
   10. 实施术后护理措施，包括每12小时皮下注射依诺肝素1 mg/kg进行抗凝治疗，以及阿司匹林100 mg、他汀类药物和镇痛治疗。对血管穿刺部位进行持续24小时压迫。

2. 循环单核祖细胞（MPCs）的定量分析（图2）

1. 取 6 mL 已收集的血液转移至新的 15 mL 圆锥管中，并以 PBS 按 1:1（v/v）体积比稀释。
   注意：血液采集后须在 1 小时内完成处理。
2. 准备密度梯度分离，向 3 支试管中各加入 2 mL 密度梯度介质。然后将稀释后的血液等分为三份，分别加入各试管中。
   注意：液体总体积不得超过试管最大容量的四分之三。
3. 在 4 °C 条件下以 1,800 x g 离心 30 分钟。用移液器收集界面层中环状分布的细胞，并转移至新管。加入 2 mL PBS，于 4 °C 以 1,800 x g 离心 6 分钟。保留沉淀，其中含有 MPCs。
4. 使用 PBS 通过离心洗涤含有 MPCs 的沉淀，操作同步骤 2.3。每次洗涤使用新鲜 PBS，并于 4 °C 以 1,800 x g 离心 2 分钟。重复该过程共 6 次。
5. 最后一次洗涤后，使用 1 mL PBS 重悬细胞沉淀。取 20 µL 细胞悬液与 20 µL 0.4% 台盼蓝按 1:1（v/v）比例稀释。取 10 µL 此细胞悬液，使用血细胞计数板和光学显微镜进行细胞计数。
6. 将 1 × 10⁶ 个 MPCs 分装至预先标记的 5 mL 流式细胞术管中。
   注意：需同时准备相应同型对照抗体。
7. 于 4 °C 以 1,800 x g 离心 6 分钟，吸除并弃去上清液。
8. 将一抗用 100 µL 抗体孵育液 [1× PBS，pH 7.4，EDTA 2 mM，BSA 0.05%] 稀释后加入管中。涡旋重悬 10 秒，于 4 °C 避光孵育 20 分钟。
   注意：本方案中所用一抗终浓度分别为 CD45 1:50、CD34 1:20、KDR 1:50、CD184 1:20、CD133 1:50。可在本步骤中断实验流程，将细胞用含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定，并于 4 °C 保存样本不超过 24 小时。
9. 于 4 °C 以 1,800 x g 离心 2 分钟，弃去上清液。加入 500 µL 1× PBS（pH 7.4，EDTA 2 mM）重悬细胞。
10. 进行流式细胞术分析。
    1. 使用同型对照抗体设定背景信号。在 FSC/SSC 图中选择淋巴细胞分布区域，尽量排除细胞碎片、残留的粒细胞及其他颗粒。将此类分布定义为 100%。
       注意：淋巴细胞通常分布在图的左下区域。
    2. 设置门控，选择 CD45⁺ 和 CD34⁺ 细胞比例较高的共同免疫表型。随后，在已确定的 CD45⁺、CD34⁺ 门控基础上，进一步选择双阳性免疫表型，即同时表达 KDR（VEGFR-2）⁺、CD133⁺ 或 CD184⁺ 的细胞。根据其特异性细胞表面标志物鉴定 MPCs 亚群，并以门控事件的百分比形式报告结果。
11. 鉴定 MPCs 的主要亚群。本研究中分析的免疫表型包括：CD45⁺CD34⁺CD133⁺；CD45⁺CD34⁺CD184⁺；CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺；CD45⁺CD34⁺KDR⁺；CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133⁺ 以及 CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184^7,17。
    注意：本研究所用细胞表面标志物功能如下：CD45（淋巴细胞标志物）、CD34（内皮细胞和/或血管细胞标志物）、KDR（VEGFR-2）（内皮细胞膜标志物）、CD133（内皮祖细胞标志物）和 CD184（造血干细胞及内皮细胞标志物）。

3. MPCs 与内皮功能改变及血流动力学检测（FMD）的关系

1. 测定血管成形术前和术后的血流介导性舒张功能（FMD）。
   1. 使用血管线性探头测量肱动脉直径。
   2. 将血压计袖带置于前臂测量部位上方，充气至高于收缩压 50 mmHg，持续 5 分钟后放气。
   3. 在随后的 60 秒内再次测量肱动脉直径。使用以下公式估算 FMD。
      注意：使用以下公式计算舒张程度（%）=（短暂缺血后最大直径 - 基线直径）× 100 / 基线直径。
2. 将 MPC 数量与基线 FMD 值以及血管成形术后 FMD 的变化值（delta）进行相关性分析。

4. MPCs 对截肢的预后能力

1. 球囊血管成形术后患者出院后，应安排定期医疗随访，以评估下肢血流灌注情况。
2. 血管成形术后2周评估肢体缺血的临床严重程度。根据Rutherford分类法¹³，评估静息痛缓解情况、缺血程度改善情况以及功能性足部的保留情况。
3. 比较基线水平与随访时肢体缺血的临床严重程度，识别因预后不良而需行大截肢术的病例。
4. 分析MPCs数量与下肢大截肢患者比例之间的相关性。

结果

从20名糖尿病患者（年龄68岁，其中10名男性）接受血管成形术治疗的阻塞动脉部位采集了血样。半数受试者有吸烟史。血管病变主要被评定为Rutherford VI级；患者中2型糖尿病（100%）、高血压（70%）和血脂异常（55%）的患病率较高。

在下肢血管成形术后进行了为期30天的临床随访。通过Spearman分析，将MPC亚群在基线时的比例或血管成形术后的动态变化与FMD评估的内皮功能障碍程度进行相关性分析；并采用Mann-Whitney U检验，比较术后发生或未发生肢体截肢患者的基线MPC数量。研究结果显示，基线时MPC亚群CD45⁺CD34⁺KDR⁺与FMD呈负相关（图3A，左）；而血管成形术后MPC亚群CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺的变化与FMD改善显著相关（图3B，右）。此外，在最终进展为肢...

讨论

在血管阻塞的确切部位采血可能存在技术上的困难；因此，我们选择在血管阻塞附近进行采血。同样，靠近血管斑块处的MPC数量似乎具有高度动态性，可能在血管成形术前后出现变化。根据我们的观察，建议评估血管成形术前基线水平及术后30分钟时MPC数量的变化，因为这些变化可能反映了血管损伤与修复过程中发生的多种病理生理过程。

建议在采集血液样本后的前3小时内完成MPCs检测的样本处理；因此，血管科-血管外科团队与实验室研究人员之间可制定适当的组织计划，甚至可预先进行模拟演练。MPCs的分离操作应谨慎进行，特别是将血液样本置于密度梯度液中以及对含有MPCs的沉淀物进行洗涤的步骤。本课题组通常将细胞转移至流式管中，加入一抗，固定后于4 °C过夜保存；出于时间安排的便利性考虑，流式细胞术检测将在次日进行。

关于循环MPCs作为血管损伤与修复的有用临床生物标志物的作用，已有重要研究致力于在不同前体细胞之间标准化免疫表型¹⁷。全面的表征应包括参与各种血管疾病临床场景的循环前体细胞亚群。利用本文所述方法，我...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BSA	Roche	10735086001	牛血清白蛋白（BSA），用作缓冲剂、稳定剂、标准品以及混匀试剂。
校准微珠	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant 校准微珠以含 0.05% 叠氮化钠的水溶液形式提供，3.5 ml 可用于最多 100 次检测。
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	与 R-藻红蛋白偶联的抗体，溶于 PBS/EDTA 缓冲液中。
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	单克隆抗体，同型为重组人 IgG1，已偶联标记。
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	与 R-藻红蛋白偶联的抗体，溶于 PBS/EDTA 缓冲液中。
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	单克隆抗体克隆 AC136 可识别 CD34 的 III 类表位。
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	人源性偶联标记的单克隆 CD45 抗体。
锥形管	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15 ml 锥形离心管。
流式管	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL 聚苯乙烯圆底管，规格 12×75，无菌。
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	重金属（以铅计）<10 ppm，铁 <0.01%，砷 <1 ppm，不溶物 <0.005%。
改良型牛鲍计数板	无品牌	无目录号	用于细胞计数的血细胞计数板（量程 0.1000 mm，0.0025 mm²）。
K2 EDTA 血液采集管	BD Vacutainer	#367863	紫色塑料真空采血管（K2E），含 10.8 mg，6 mL。
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	无菌且经内毒素检测合格。密度：1.077±0.001 g/mL。
多聚甲醛	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	用于生物样本固定的试剂（粉末状，95%）。
1.3 mL 移液管	CRM Globe	PF1016, PF1015	移液管是一种可更精确转移液体的工具。
试管	KIMBLE CHASE	45060 13100	耐热试管，尺寸/容量：13 × 100 mm。