预测使用局部循环单核祖细胞在血管成形术治疗的危肢缺血患者截肢

Summary

即使严重肢体缺血（CLI）中受阻血管成形术，下肢截肢也可能发生。单核先天细胞（MPC）反映血管修复。本协议描述了从接近血管成形术的循环中量化MPC，以及它与内皮功能障碍和下肢截肢预测的关系。

Abstract

严重肢体缺血（CLI）代表外周动脉疾病的晚期。血管成形术改善下肢的血液流动:然而，一些患者不可逆转地进展到截肢。血管损伤程度和血管修复机制是影响血管成形术后结果的因素。单核先天细胞 （MPC） 对血管损伤和修复有反应，具有反映血管疾病的能力。本协议描述了从血管成形术部位附近的血管血液循环中获得的MPC的量化，以及它与内皮功能障碍的关系，以及CLI患者血管成形术后未来30天内截肢的预测能力。

Introduction

外周动脉疾病 （PAD） 的特点是慢性和渐进性血管阻塞，血液供应有限¹.在全球范围内，下肢的PAD影响约10%的老年人口，而多达7%的此类病例被提交到截肢^2，3。

关键肢体缺血症 （CLI） 代表了 PAD¹的最严重表现。患者通常在休息时感到疼痛，溃疡或坏死可归因于动脉被遮挡:而临床预后不利，在1年^3、4、5年内截肢及死亡的风险为^30%。

血管成形术是一种微创的血管内程序，可以恢复血液流向下肢的患者与CLI:然而，一些患者将不可避免地需要截肢，即使在血管成形术治疗^1，5。早期识别血管成形术后的不利结果是相当有价值的，由于治疗执行的可能性。

传统危险因素可能为接受血管成形术⁶的CLI患者的主要肢体截肢提供有限的....

Protocol

国家"20德诺维姆布雷"ISSTE中心的机构研究伦理委员会批准了这项未来的议定书，所有登记的患者均表示书面知情同意。

1. 下肢血管块评估、血液取样和气球血管成形术

注:用于此实验的研究样本包括20名糖尿病患者，年龄为68岁，20人中有10人为男性。样本中有一半是吸烟者，最常见的共病是2型糖尿病、全身动脉高血压和/或脂质血症。该样本旨在针对年龄、性别和共同发病率进行标准化。不能排除临床人口影响对MPC和CLI之间关系的可能偏差。

1. 根据卢瑟福分类^13（ 见 补充表1）评估肢体缺血的临床严重程度。
2. 进行下肢血管造影、血液取样和气球血管成形术。
   1. 手术前使用抗凝血剂和麻醉药。
   2. 在选择的腹股沟部位将 18 G 针插入血管。
   3. 放置介绍器并推进灵活的导线。然后，对于 6 Fr 介绍器，初始指南将进一步更改。
   4. 在荧光指南下定期注射对比介质或 CO_2，以确定动脉轨迹和血管阻塞部位（图 1）。
      注:使用对比介质 40 cc，稀释 1:1 在 0.9% 盐水，或 CO₂ 在 10 到 20 mL 每枪在 12 psi 的压力。

Results

在血管成形术现场，从阻塞动脉采集的血液样本是从20名糖尿病患者身上采集的，年龄为68岁，20人中有10人为男性。样本人口中有一半是吸烟者。血管病变主要得分为卢瑟福六级:而患者显示2型糖尿病（100%）、高血压（70%）的患病率较高和血脂异常（55%）。

下肢血管成形术实施后30天的临床随访。血管成形术后基线或动力学的MPC亚人口百分比与内皮功能障碍程度相关（斯皮尔曼分析），FMD评估:在血管成形术（U-Mann惠特尼）之后接受或不进行肢体截肢的患者之间比较了MPC的基线数。研究表明，基线MPC亚人口^{CD45+CD34+KDR+}负相关与FMD（图3A，左），而MPCCD45+CD34+CD133+CD184+血管成形术后的变化与FMD改善显著相关（图3B，右）。此外，在那些进化为截肢的患者中观察到MPC亚人口

Discussion

血管块精确部位的采血可能显示技术困难:因此，我们在靠近血管块的地方进行了采血。同样，接近血管斑块的MPC数量似乎具有高度动态性，并可能在血管成形术前后产生变异。根据我们的观察，建议评估血管成形术后基线和30分钟后MPC数量的变化，因为它们可能反映血管损伤和修复过程中发生的几个病理生理过程。

建议在前3小时内进行MPC测定的血液样本处理:因此，在血管外科团队和实验室研究人员之间可以建立适当的组织计划，甚至以前的模拟实践。应仔细进行MPC隔离，特别是将血液样本分解成密度梯度，并清洗含有MPC的颗粒。我们组用于将细胞转移到细胞管中，添加原发性抗体，修复和存储细胞过夜在4°C:由于时间管理方便，流量细胞读数将在后天进行。

关于循环MPC作为血管损伤和修复的有用临床生物标志物的作用，据报道，已作出重要努力，以规范祖细胞¹⁷之间的免疫表型。一个全面的特征应该包括参与血管疾病中不同临床场景的循环祖细胞的亚人口。使用此处描述的方法，我们发现MPC亚人口CD45+CD34+CD133+CD184+.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Roche	10735086001	血清白蛋白 （BSA） 作为缓冲剂、稳定剂、标准品和混合剂。
校准珠	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant 校准珠以含有 0.05% 叠氮化钠的水溶液形式提供。3.5 ml，最多可进行 100 次测试
CD133/1 （AC133）-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	抗体与 PBS/EDTA 缓冲液中的 R-藻红蛋白偶联
CD184 （CXCR4）-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	单克隆、同种型重组人 IgG1，偶联
CD309 （VEGFR-2/KDR）-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	抗体在 PBS/EDTA 缓冲液中与 R-藻红蛋白偶联
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	单克隆抗体克隆 AC136 检测 CD34
CD45-VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	单克隆 CD45 抗体，人偶联
锥形管	Thermo SCIENTIFIC#	339651	15ml 锥形离心管
流式细胞分析管	FALCON Corning 品牌	#352052	5 mL 聚苯乙烯圆底管。12x75 样式。无菌的。
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	重金属（以 Pb计） <10ppm，Fe<0.01%，砷 <1ppm，不溶物<0.005%
改良的 Neubauer	无品牌	无目录号 用于	细胞计数的血细胞计数器。（范围 0.1000mm、0.0025mm2）
K2 EDTA 采血管	BD Vacutainer	#367863	淡紫色塑料吸血管管 （K2E） 10.8mg，6 mL。
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	无菌并检查是否存在内毒素。密度：1.077±0.001g/mL
多聚甲醛	SIGMA-ALDRICH		固定生物样品（粉末，95%）
移液器转移 1.3mL	CRM Globe	PF1016， PF1015	转移移液器是一种促进液体转移的工具，可更准确地进行液体转移。
试管	KIMBLE CHASE	45060 13100	耐热试管。尺寸/瓶盖 13 x 100 毫米