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体外冲击波治疗后外泌体的分离

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DOI：

10.3791/61508

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2020年9月10日

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1Department of Cardiac Surgery, Medical University Innsbruck, 2Institute of Clinical and Functional Anatomy, Innsbruck Medical University

本文内容

摘要

体外应用冲击波后可释放外泌体。本文介绍如何对培养的内皮细胞施加冲击波，并随后分离外泌体以供进一步研究。

摘要

冲击波治疗常规应用于骨科适应证，包括肌腱病（如肱骨外上髁炎（网球肘）和跟腱炎（足跟骨刺））以及难愈性伤口和骨骼疾病。尽管病因不同，冲击波治疗的促血管生成作用与抗炎作用相结合，可促进软组织和骨骼的再生。在超过30年的临床应用中，未观察到任何不良反应。此外，基础研究甚至揭示了冲击波治疗对缺血性心肌具有再生效应。

在之前的研究中，我们已证明培养细胞的机械刺激可通过外泌体的释放转化为生物学反应。然而，其确切机制仍有待阐明。在应用冲击波治疗时，机械耦合至关重要，因为即使微小的气泡也可能吸收冲击波。此前描述的水浴法是一种有效的体外方法，可确保冲击波应用的充分性和可重复性。

我们成功建立了一种可行且可重复的方案，用于在冲击波处理后从培养细胞中分离外泌体。该方法为研究机械转导的潜在机制以及冲击波释放的外泌体所具有的再生和促血管生成潜能提供了可能。

引言

冲击波（SW）是一种声压波，在自然界中当大量能量在短时间内释放时产生（例如伴随闪电的雷声）。在临床实践中，冲击波已用于体外冲击波碎石术治疗肾结石超过30年，且无明显副作用1,2。偶然观察到在肾结石粉碎后X光片上出现髂骨增厚现象，这一发现为研究骨愈合障碍提供了基础，并推动了冲击波在长骨骨不连治疗中的应用3,4,5。

冲击波治疗的适应证已得到扩展，目前该方法在骨科领域已进入常规临床应用，包括治疗肱骨外上髁炎（网球肘）和跟腱炎（足跟骨刺）等肌腱病6,7。此外，基础研究表明冲击波治疗（SWT）具有显著的促血管生成潜力。其中一项研究显示，SWT可上调促血管生成生长因子的表达，如VEGF（血管内皮生长因子）、PIGF（胎盘生长因子）和FGF（成纤维细胞生长因子），随后促进血管生成8。

为了研究冲击波诱导的血管生成在其他病理条件下可能具有的有益作用，我们在缺血性心脏病的动物模型中应用了冲击波（SW）治疗9,10。在证实冲击波治疗可对缺血心肌产生再生效应后，我们进一步明确了先天免疫受体TLR3（Toll样受体3）在冲击波治疗中的不可或缺作用11,12。后续研究表明，冲击波治疗的机械刺激通过外泌体的释放转化为生物学信号。与内皮细胞生理条件下释放的外泌体相比，冲击波治疗（SWT）诱导释放的外泌体含有更高水平的促血管生成微小RNA（microRNA）。将SWT诱导释放的外泌体注入缺血心肌后，可诱导组织再生13。

由于空气会吸收冲击波（SW），因此换能器与细胞培养瓶之间的完美耦合至关重要。标准化的水浴是一种可行的体外应用冲击波治疗（SWT）的方法，并可实现可重复的实验设置。为了避免波的反射及其引起的干涉现象，可在水浴后部设置楔形吸收装置，以消除向水浴后方传播的主波。因此，我们建议仅使用文中所述的水浴系统进行体外冲击波处理。

在本实验方案中，我们描述了在体外应用冲击波以将促血管生成的外泌体释放到上清液中的方法。该方案为研究外泌体在机械转导中的作用提供了可能，并为进一步探究冲击波治疗（SWT）诱导外泌体释放的机制奠定了基础。

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方案

人脐静脉内皮细胞取自妇产科的剖宫产手术。因此，已获得患者的书面知情同意。因斯布鲁克医科大学伦理委员会已批准该研究（编号：UN4435）。

注意：在无菌超净工作台内操作，以避免污染。

1. 实验前24小时

  1. 通过在 4 °C 下以 120,000 × g 超速离心胎牛血清（FCS）过夜，制备无外泌体的内皮细胞生长培养基。
  2. 使用 10% 明胶包被一个 75 cm² 的细胞培养瓶。
  3. 利用内皮细胞生长培养基在细胞培养瓶中接种人内皮细胞。
    实验当天：
    注意：提前将 4 L 去离子水（ddH2O）、无外泌体 FCS、内皮细胞基础生长培养基和 PBS 预热至 37 °C。

2. 准备冲击波治疗应用

  1. 通过添加商用试剂盒（例如 Bullet Kit）中的补充剂，并使用经超速离心去除外泌体的胎牛血清（exosome free FCS）替代普通胎牛血清（FCS），配制无外泌体的内皮细胞生长培养基。
  2. 在水浴锅中加入约 3.5 L 预热至 37 °C 的去离子水（ddH2O）。
  3. 将冲击波（SW）探头连接至水浴锅。
  4. 在冲击波设备上设定处理参数（能量通量密度、脉冲频率）。我们建议使用 0.07 mJ/mm² 的能量通量密度、5 Hz 的频率，施加 500 次脉冲。

3. 冲击波应用

  1. 在显微镜下使用100倍总放大倍数，通过细胞形态和内皮细胞密度评估细胞活力。仅使用高融合度的培养瓶以获得更多的外泌体。
  2. 小心地用约250 mL的PBS替换内皮细胞培养基，完全充满培养瓶，排除所有残留空气。
  3. 使用封口膜或密封盖将培养瓶密封。
  4. 将细胞培养瓶垂直置于水浴中，细胞面朝向远离冲击波（SW）装置的一侧。确保培养瓶与施加器之间的距离与标示刻度一致。对于Orthowave 180c设备，使用10 cm的距离。
  5. 对细胞培养瓶的下半部分施加250次冲击波治疗脉冲。
  6. 将培养瓶旋转180°，对上半部分施加250次冲击波治疗脉冲。
  7. 随后移除培养瓶密封，将PBS替换为15 mL含无外泌体胎牛血清（exosome free FCS）的内皮细胞生长培养基。
  8. 将经治疗的细胞在无外泌体培养基中继续培养，培养时间根据实验设计确定。冲击波治疗后4小时可收集到最多数量的外泌体（图1）。
    注意：在假手术对照组中，对细胞培养瓶进行相同处理（见上文），但不施加冲击波治疗。

4. 外泌体的分离

  1. 将上清液转移至收集管中，在 4 °C、300 × g 条件下离心 10 分钟。此步骤可去除上清液中的所有细胞。
  2. 为去除细胞碎片，将上清液转移至新管中，在 4 °C、3,000 × g 条件下离心 20 分钟。
  3. 将上清液通过 200 nm 滤膜过滤至离心管中，以去除凋亡小体。
  4. 将过滤后的上清液在 4 °C、120,000 × g 条件下离心 70 分钟。弃去上清液，并用 300 µL PBS 重悬外泌体沉淀。
    1. 由于超速离心后外泌体沉淀不可见，需将超速离心管涡旋振荡 30 秒，以确保外泌体沉淀完全重悬。根据实验需求调整 PBS 体积，并进行后续实验。
  5. 将重悬的外泌体储存于 -80 °C。
    注意：在将上清液转移至收集管后，或在超速离心前，可通过将上清液于 -80 °C 冻存，暂停本实验方案。

5. 常见问题

  1. 确保SW治疗仪与水浴槽连接紧密。连接不充分可能导致水浴槽漏水。
  2. 确保烧瓶与治疗头之间保持准确距离，以便对不同烧瓶施加相同能量通量密度。
  3. 标记接受SW治疗的细胞培养瓶以及作为对照样本的细胞培养瓶。
  4. 将培养瓶放回培养箱前需彻底干燥，以避免污染。

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结果

采用所述方案，我们对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）以及人冠状动脉内皮细胞（CAECs；PromoCell）进行了冲击波治疗（例如 Orthowave 180c）。通过纳米颗粒示踪分析（NTA）对释放的囊泡进行定量。结果显示，冲击波治疗可显著增加微囊泡的释放（图1A,B）。通过透射电子显微镜对HUVECs释放的囊泡进行成像，观察到外泌体典型的约100 nm的粒径（图1C）以及通常描述的杯状形态（图1D）。由于流式细胞仪分析检测到外泌体蛋白标志物CD9、CD81和CD63的存在，可以确定HUVECs释放的微囊泡确为外泌体（图1 E-G）。

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讨论

在多项基础研究中，已证实冲击波治疗具有再生效应，并已在骨科适应证中常规应用3,4,5。在多种动物模型中，已观察到冲击波对缺血心肌的再生作用，并由此推动了CAST-HF试验的启动9,10。该随机对照试验旨在评估在冠状动脉旁路移植术期间额外应用直接心脏冲击波治疗的临床获益14。既往研究已证实外泌体在冲击波治疗中的关键作用13。然而，外泌体释放的确切机制及其所携带内容物的具体组成仍不明确。为了研究冲击波治疗后外泌体的释放过程及其再生效应，我们建立了一种可行且标准化的方案，用于获取冲击波治疗诱导产生的外泌体。

据我们所知，这是首个描述在冲击波治疗后分离外泌体方法的实验方案。本方案必须使用水浴装置...

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披露

JH 和 MG 是 Heart Regeneration Technologies GmbH 的股东，该公司是因斯布鲁克医科大学的衍生企业，致力于推动心脏冲击波治疗（www.heart-regeneration.com）。其余所有作者均无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了AUVA对JH和CGT提供的无限制研究资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞培养瓶 Cellstar 65817075 cm2
收集管 – Falcon TubeCorning 352070
内皮细胞生长培养基-2 BulletKit Lonza CC-3162
内皮细胞生长基础培养基 LonzaCC-3121
胎牛血清 Sigma F0804
封口膜（Parafilm） Pechiney PM996
磷酸盐缓冲液gibco 14190-904
冲击波治疗仪MTSOrthowave 180c

参考文献

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