DNA中稀有单点突变的裸眼检测

摘要

本方案利用金纳米颗粒和顺磁性微粒，可在野生型DNA分子过量200倍的背景下，通过肉眼识别点突变DNA。

摘要

本方案描述了一种通过肉眼观察颜色变化来检测野生型DNA过量背景下体细胞点突变的比色检测方法。该方法预期的应用是鉴定液体活检中循环游离DNA内的稀有突变，在癌症诊断及对肿瘤患者进行个性化治疗分层方面具有重要意义。作为概念验证，本检测被设计用于检测BRAF基因中的BRAF^V600E突变，该突变的识别对于确定可从BRAF抑制剂靶向治疗中获益的黑色素瘤亚组患者至关重要。然而，由于采用了通用检测探针，该比色检测方法可轻松推广至其他具有临床意义的体细胞突变，因此在肿瘤学诊断中具有广阔的应用前景。

该检测方法可在大量BRAF^WT DNA背景下检出0.5%的BRAF^V600E突变，其灵敏度与某些商用仪器检测方法相当。这一灵敏度在临床上具有诊断意义，可实现对药物敏感患者的早期识别。与基于实时PCR的商用检测方法相比，本检测所需仪器设备和操作步骤极少，仅需使用标准PCR（或等温扩增技术）扩增的DNA即可完成，且通过单管反应在约一小时内实现肉眼判读结果。目前，该检测仅在合成DNA样本上进行过验证。然而，这些合成样本的设计旨在模拟从循环游离DNA扩增的真实样本，以促进该检测向临床诊断的转化应用。

引言

该方法的目的是以最少的仪器设备和肉眼观察读数的方式，检测DNA样本中低丰度的点突变。最终目标是建立一种原理验证性检测方法，适用于未来在循环游离DNA（ccf-DNA）（例如来自血液活检样本）中快速检测体细胞突变的应用，用于癌症的早期诊断与监测¹。与癌症相关的体细胞突变是一种重要的癌症生物标志物²，其在ccf-DNA中仅占较小（但变异较大）³的比例，使得其检测具有挑战性⁴。我们选择致癌性突变BRAF^V600E作为模型靶标，该突变可导致BRAF激酶持续活化。该突变存在于所有BRAF突变癌症中的80%⁵，通常在循环肿瘤DNA中仅占<1%⁶。识别携带该突变的患者具有重要意义，因为该突变可预测患者对BRAF抑制剂的治疗反应。因此，已有多种方法^7,8,9,10被开发用于评估BRAF突变状态，其检测灵敏度范围为0.01%至2%。

与现有最先进方法相比，该方法的主要优势在于 其检测无需依赖仪器（肉眼观察即可），而实时荧光定量 PCR 则需依赖仪器检测荧光分子。另一优势在于其能够高效区分在过量野生型 DNA 分子中仅含一个突变 DNA 分子的情况，该分辨能力可达 0.5%，优于¹¹ 或匹配项¹² 与一些基于仪器检测的实验室或商业试剂盒相比，该方法适用于临床诊断应用。另一方面，作为实验室原型检测，该方法依赖于对温度敏感步骤的手动控制。然而，由于步骤数量较少且检测总时长有限，未来有望将其整合到自动化微流控系统中。

本概念验证方法采用合成DNA分子开发而成。为了高效地将其转化为临床应用，需使用从患者血液活检样本扩增的实际样本进行验证。需要注意的是，该方法未来的应用领域并非直接分析未经处理的复杂生物基质（如体液）。对于此类样本，需先通过标准方法提取DNA，再进行扩增和纯化。因此，分析的起始材料始终是经过纯化和扩增的DNA，其在可能存在的干扰物质方面，与用于本方法开发的合成DNA样本具有可比性。

方案

1. 金纳米颗粒探针的合成

1. 采用两步法标准种子生长法合成40 nm柠檬酸盐包被的金纳米颗粒，具体步骤如下。
   1. 使用经典的Turkevich–Frens方法合成15 nm柠檬酸盐包被的金纳米颗粒（AuNPs种子）^13,14.
      1. 所有玻璃器皿均需用王水（HCl:HNO₃）清洗₃ 以3:1的体积比混合。
      2. 将250 mL的0.25 mM HAuCl加热₄ 在均匀搅拌的同时煮沸。
         警告：HAuCl₄ 具有腐蚀性和毒性。
      3. 立即加入 25 mL 的 38.8 mM Na₃∙柠檬酸盐
      4. 继续煮沸并搅拌30分钟，直至溶液变为红宝石色。
      5. 将溶液从热源移开，边搅拌边冷却至室温。
      6. 使用 0.22 过滤 µm PTFE膜注射器滤器
      7. 4°C 保存 °玻璃瓶中的 C
         注意：此处可暂停实验。
   2. 通过种子生长法合成40 nm柠檬酸盐包被的金纳米颗粒（40 nm AuNPs）¹⁵.
      1. 配制溶液A：390 µL 新鲜配制的 0.1 M 硫酸羟胺与 13 mL 金纳米颗粒（AuNP）种子混合，总体积为 120 mL，在 H₂O.
         注意：获得目标尺寸所需的 AuNPs 种子量可能有所变化；每批新的 AuNPs 种子储备液均需进行滴定优化。
         警告：硫酸羟胺具有腐蚀性、毒性、致突变性，对环境有害。操作时：操作后应彻底清洗。若衣物被污染，应脱下并清洗后方可再次使用。使用时应保证充分通风。尽量减少粉尘的产生和积聚。避免与眼睛、皮肤和衣物接触。容器应严格密闭。避免吸入粉尘。禁止使用金属药匙或其他金属器具。储存时：应将容器严格密闭，存放于阴凉、干燥、通风良好的区域，远离不相容物质。远离金属存放。
      2. 配制溶液B：12.25 mL H₂O + 0.25 mL 0.1 M HAuCl₄.
      3. 将溶液B吸入注射器中，并将该注射器安装至注射泵。
      4. 设定注射泵参数：注射器直径（mm）；流速：90 mL/h；总体积：10.80 mL（其中0.8 mL为系统平衡所需的过量体积，即管路填充）。
      5. 启动注射泵。当溶液B最初流出的0.8 mL液体充满管路并滴入废液容器后，将管路置于装有溶液A的反应烧瓶上方（溶液A保持中等且均匀搅拌），使溶液B逐滴加入。
      6. 加入2.65 mL新配制的0.1 M Na后封管₃∙柠檬酸，搅拌5分钟。
      7. 通过在 2,460 x g 条件下离心，浓缩所得的 40 nm AuNPs g 10 分钟，18 次 °C.
      8. 轻轻吸出上清液。在残留体积中轻轻重悬。
      9. 4°C 保存 °C.
         注意：此处实验可暂停。
2. 采用标准的巯基化学法对40 nm柠檬酸盐包被的金纳米颗粒进行功能化¹⁶.
   1. 通过将硫醇化探针寡核苷酸（5′ T(30)–(O–CH₂–CH₂)₃–SH 3′在室温下，用含10 mM Tris(2-carboxyethil)phosphine (TCEP)的溶液轻柔振荡（400 rpm）孵育3小时。
   2. 将过量的消化后寡核苷酸与10 nM AuNPs在室温下轻轻振荡（400 rpm）孵育过夜。
   3. 在10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4，含0.01% SDS）中，通过在10小时内分步加入NaCl，将AuNPs-DNA混合物逐步调节至0.3 M NaCl，期间保持轻微振荡（400 rpm）。
   4. 室温下轻轻振荡（400 rpm）孵育过夜。
   5. 用含0.01% SDS的10 mM磷酸缓冲液配制的0.25 M NaCl溶液洗涤DNA偶联的AuNPs，共洗涤3次，以去除未结合的过量寡核苷酸。
   6. 将获得的通用探针-金纳米颗粒（AuNPs）于4℃保存 °C，直至使用。
      注意：实验在此处可以暂停。
   7. 使用商业化的基于荧光的检测方法测定金纳米颗粒（AuNPs）上DNA探针的密度
   8. 通过紫外-可见光谱法测定 AuNPs 的浓度。为了从吸光度数据推算 AuNPs 浓度，需采用朗伯-比尔定律 & 比尔定律（A=εbc）以及40 nm AuNPs的已发表消光系数¹⁶ 可以使用。
   9. 通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）表征 AuNPs 探针。
      注意：实验可在此处暂停。

2. BRAF^V600E稀有突变的比色法鉴别

1. 准备用于分析的靶标样本：合成的 BRAF 混合物^V600E DNA 和 BRAF^野生型 DNA以不同比例（BRAF^V600EBRAF^野生型 1:10，1:100，1:200，BRAF^V600E 100%，BRAF^野生型 100%).
2. 用杂交缓冲液（HB）（1× PBS，pH 7.4，5% w/v PEG 600）将超顺磁性微粒洗涤两次以达到平衡，并将其重悬于与起始体积相等的HB中。洗涤时，取一份超顺磁性微粒 aliquot 置于1.5 mL离心管中（最多50） µL/管），加入 500 µL 的 HB，通过轻柔吹吸混匀三次，放置磁铁吸附后分离上清液，立即加入 500 µ加入 L 的 HB，重复操作进行第二次洗涤步骤。去除上清液后，应立即加入 HB，以避免磁珠干燥，具体操作请参照制造商建议。
3. 每个待测样本，准备一个含有2.5的试管 µHB 中洗涤后的顺磁性微粒 L
4. 通过将2.5个磁性微粒与 µL 磁性微粒与 10 µ10 L µ生物素标记的第一鉴别探针（DP1）的 M 溶液，该探针含有 BRAF^V600E 突变，室温下持续5分钟。
5. 用磁力分离法将微粒与未结合的干扰探针分离，并将微粒重悬于12.5 µL 的 HB。为此，将磁铁置于管壁一侧，等待溶液变为透明。小心用移液器吸除溶液，立即加入 HB，并轻轻吹打使磁珠均匀重悬。
6. 向悬浮液中加入10 µ10 L µ步骤2.1中所述DNA目标样本的混合物
7. 室温孵育30分钟。
8. 孵育期间，每隔 3 分钟振荡样品一次，以避免超顺磁性微粒发生沉淀。
9. 向悬浮液中加入10 µ2 L µM溶液的第二种鉴别探针（DP2），设计为含有一段与靶标互补的序列和一个poly-A尾。
10. 室温孵育15分钟。
11. 孵育期间，每隔3分钟振荡样品，以避免超顺磁性微粒发生沉淀。
12. 孵育后，用磁力分离去除多余的DP2。
13. 立即加入300 fmol与检测探针偶联的AuNPs，室温孵育5分钟。
14. 磁力分离含有过量金纳米颗粒（AuNPs）的上清液，并进行下一步操作^st 通过添加100进行洗涤步骤 µ室温下 L 的 HB。
15. 磁力分离上清液，并进行2次^未检测到 通过添加100进行洗涤步骤 µL of HB。
16. 在52℃孵育 °5 分钟，C
17. 磁力分离上清液，置于52℃ °C.
18. 立即在12.5中重悬 µ用于比色结果的裸眼读取的HB溶液。
19. 拍摄结果照片，并将样品在 4 ℃ 保存 °C.

结果

该方法用于在过量的BRAF^wt合成DNA中检测BRAF^V600E突变。图1展示了检测策略的详细信息。该检测提供比色法的“是/否”结果^17,18，其中红色代表阳性结果（是），黄色代表阴性结果（否）。

简而言之，将包被有生物素化鉴别探针（DP1）的链霉亲和素包被顺磁性微粒用于捕获携带BRAF^V600E突变的DNA。待检测的样本（BRAF^wt与BRAF^V600EDNA的混合物）被加入至微粒中。短暂孵育后，向反应管中加入第二条检测探针（DP2），随后加入显色金纳米粒子（AuNP）探针。样本中的BRAF^V600EDNA首先与DP1结合，然后依次结合DP2和AuNP探针，形成夹心结构，使AuNP修饰在顺磁性微粒表面（图2），从而使...

讨论

该方法的核心在于能够在大量干扰性非靶标DNA存在的情况下，区分仅有一个核苷酸差异的靶标DNA。因此，探针的设计和杂交条件对于实现高灵敏度的 discrimination 至关重要。本检测方法采用通用的比色探针，可适用于任何感兴趣的点突变的检测。然而，每当为新的突变设计新的探针对时，可能需要对反应条件进行一些微小的优化。

该方法中唯一的關鍵步驟是 2.17 步，磁性分離必須在 52 °C 下進行。在此步驟中，必須保持前一步洗滌過程的溫度。這是因為檢測在極小的體積中進行，如果磁性分離過程中不控制溫度，溫度會迅速下降，從而導致非靶分子非特異性地結合到磁珠上。為確保此情況不發生，應檢查陰性對照的顏色，檢測結束時陰性對照應為鮮豔的黃色。

该检测目前仍处于实验室原型阶段，已在合成DNA靶标上进行测试。向临床应用转化需要扩增包含靶标的基因组DNA短片段。由于该检测需要可与探针 readily 杂交的单链DNA，因此建议通过产生单链扩增子的方法来扩增靶标。后者可通过不对称PCR¹⁹或不同的等温扩...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
台式离心机 - Allegra X 30	Beckman Coulter	A99473
DL-二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	D0632-25G
Dynabeads M-280 链霉亲和素顺磁性微粒	Invitrogen	11205D
硫酸羟胺	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	379913-25G
KDS 100 Legacy 注射泵	kdScientific	789100
NanoDrop OneC 分光光度计	Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA)
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	806552-500ML
Pierce™ TCEP-HCl，无需称量™ 格式	Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA)	A35349
聚乙二醇 600	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	202401
PTFE 0.22 µm 滤膜，Fluoropore	Millipore	FGLP04700
Quant-iT™ OliGreen™ ssDNA 定量检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA)	O11492
二水合柠檬酸钠	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	W302600
合成寡核苷酸	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
四氯金(III)酸	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	520918
硫醇化 polyT DNA 探针	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
透射电子显微镜 (TEM)	JEOL JEM 1011 显微镜
Zetasizer Nano S - 动态光散射系统	Malvern Panalytical