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整体动物成像 黑腹果蝇 使用显微计算机断层扫描

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DOI：

10.3791/61515

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2020年9月2日

1Department of Molecular Biology, University of Wyoming

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用显微计算机断层扫描技术对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）在任何发育阶段的完整个体进行成像的实验方案。

摘要

生物医学成像工具能够从基因到整个生物体的多个空间尺度上研究分子机制。Drosophila melanogaster（黑腹果蝇）作为一种被广泛研究的模式生物，已通过光学显微镜和电子显微镜技术在细胞和组织水平上深入解析了基因功能。若能应用可在完整生物体水平揭示基因功能的成像平台，将进一步拓展我们对遗传机制的理解。本文介绍一种适用于全动物成像的方法，概述了利用显微计算机断层扫描（µ-CT）在任何发育阶段对Drosophila进行可视化所需的步骤。µ-CT的优势包括仪器商业化易得、操作时间短，并可在无需组织解剖或透明化处理的情况下，以微米级分辨率获取精确的三维信息。结合可加速图像分析与三维重建的软件，可对任意组织或器官系统进行详细的形态计量分析，从而更深入地理解发育、生理和解剖机制，适用于描述性研究和假设验证性研究。通过整合电子显微镜、光学显微镜与µ-CT的成像工作流程，可对基因功能进行全面评估，进一步提升这一强大模式生物的研究价值。

引言

成像技术能够在不破坏物体整体三维结构的前提下，对其内部结构进行详细研究，已被证明对物理学、工程学、材料科学、考古学、古生物学、地质学和生物学等多个不同学科具有广泛的应用价值1,2,3,4,5,6,7,8,9。在这些无损成像技术中，基于X射线的成像平台尤为有用，因为高能X射线相比可见光波具有更强的穿透能力，能够穿透多种不同类型的样品和材料，且散射程度极小。因此，计算机断层扫描（CT）、显微计算机断层扫描（µ-CT）、纳米计算机断层扫描（Nano-CT）以及同步辐射显微断层扫描技术已成为对尺寸从米级到微米级、分辨率从毫米级到亚微米级的样品进行X射线成像的主要技术手段10,11,12,13,14。

尽管这些平台在设计、X射线几何结构和组件方面有所不同，以在样品尺寸和分辨率之间取得平衡，但它们都依赖于相同的基本成像原理：X射线源发出的射线穿过物体后由探测器捕获。当X射线束穿过物体内部不同密度的区域时，由于衰减程度的差异而形成图像对比度。通过旋转样品或探测器，采集一系列二维投影图像，再利用算法将其重建成包含三维信息的断层图像，从而获得在x、y、z方向上具有各向同性分辨率的三维数据15。对于许多采用锥束X射线几何结构对成像物体进行投影的台式µ-CT扫描仪而言，通常使用Feldkamp算法来准确重建物体结构，同时将误差降至最低16。

特定平台的分辨率主要由系统参数决定，例如X射线束的尺寸（焦点尺寸）、扫描仪几何结构（物体到X射线源的距离）、探测器上像素的大小以及所采用的重建算法。其他因素，如扫描仪振动、X射线束波动、样品移动以及用于可视化物体的材料类型或化学染色剂，在实际成像条件下也可能显著影响空间分辨率15。

在生物医学应用中，CT 和 µ-CT 在推动我们对解剖学、生理学、发育过程及疾病机制的理解方面发挥了关键作用，既可用于人类患者的临床诊断，也可作为模式生物的临床前成像平台17,18。例如，小鼠国际表型分析联盟旨在鉴定小鼠基因组中每个基因的功能，该联盟将 μ-CT 作为其表型分析流程的一部分19。其研究成果对于理解参与发育和疾病过程的基因至关重要，同时也为小鼠解剖学和发育过程提供了重要的图谱参考20。其他模式生物，如斑马鱼和大鼠，也已广泛采用 μ-CT 技术对多种基因突变体进行全动物表型分析17,21,22,23。

将整体动物成像与模式生物相结合的优势在于，可以全面探索特定生物学过程中基因功能的作用机制。这之所以可行，是因为模式生物具有特征明确的基因组，以及丰富的遗传学工具，能够在特定的发育阶段、特定组织、单个细胞甚至亚细胞器水平上精确调控基因功能。这些工具包括二元表达系统（如UAS/GAL4系统及其多种衍生系统）、CRISPR/Cas9技术以及RNA干扰（RNAi）24,25,26。当这些遗传学工具与强大的成像流程相结合时——该流程包括电子显微镜、光学显微镜（荧光与非荧光模式）以及如显微计算机断层扫描（μ-CT）等整体动物成像技术——即可实现对分子、细胞、组织、器官乃至整个生物体的系统性评估，从而更深入地理解基因功能。

本方案重点介绍在非哺乳动物模式生物 Drosophila melanogaster 中使用 µ-CT 的方法，该生物拥有丰富的遗传工具，已帮助阐明了众多分子机制26,27。 本方案借鉴了先前在非模式昆虫中应用的方案1,28,29,30,31,32，并基于此前在 Drosophila 中开展的 µ-CT 研究，建立适用于该动物的标准化操作流程33,34,35,36,37,38,39,40,41。文中概述了利用市售扫描仪成功进行样品制备、成像及果蝇 μ-CT 数据集分析的各个步骤。通过本方案，可对果蝇所有发育阶段进行高分辨率成像，适用于描述性研究和假设验证性研究，包括分类学、解剖学、发育、生理学以及疾病研究27。该方案也可用于几乎任何昆虫的成像，甚至适用于需要化学染色以增强图像对比度从而提升 µ-CT 可视化效果的非生物材料。

方案

1. 样品选择与表皮制备

  1. 选择适合成像的发育时期（胚胎、幼虫、蛹或成虫）。
    1. 对于胚胎发育阶段，将雌性果蝇置于涂有酵母糊的葡萄汁琼脂平板上交配产卵，每30–60分钟收集一次卵。将收集的胚胎在25 °C下培养至所需发育阶段。
    2. 对于幼虫阶段，从定时的胚胎收集实验中获取一龄和二龄幼虫。直接挑选游走期三龄幼虫rd 在非拥挤条件下，从培养瓶侧面获取各龄期幼虫。
    3. 对于蛹期时序，收集白色未成熟蛹（气门倒转），并记录表皮开始变褐的时间。动物在表皮变褐后的特定时间点将依次经历15个蛹发育阶段，可据此适时收集。42.
    4. 收集羽化后的成虫作为处女蝇，在食物小瓶中饲养至所需时间（例如，5天以完成肠道发育）。
  2. 将5-50只动物转移至含有1 mL含0.5% Triton X-100的1×磷酸盐缓冲盐水（0.5% PBST）的1.5 mL微量离心管中。在室温（RT）孵育5分钟，期间定期轻敲管壁，以促进疏水涂层的去除，并使动物完全浸入溶液中。
    1. 对于胚胎期、幼虫期和蛹期，将离心管置于100 °C的加热块中20秒以终止发育，随后在室温下冷却5分钟。
      注意：动物也可在液氮中快速冷冻37.

2. 固定与染色

  1. 移除0.5% PBST，加入1 mL Bouin固定液。轻敲管壁以确保样本完全浸没。
    警告：Bouin固定液含有甲醛，若泄漏可能对皮肤和眼睛造成急性毒性，吞咽后可能致命。操作时请佩戴手套、护目镜和实验服。
    注意：也可采用其他固定方法，例如使用乙醇。其他固定剂的优缺点在参考文献1,30中有详细描述。
    1. 对于胚胎和成体样本，在室温下于实验台放置固定16–20小时。
    2. 对于幼虫和蛹期样本，在室温下固定2小时。弃去Bouin固定液，用1× PBS洗涤5分钟，重复三次。将样本转移至含1× PBS的多孔解剖皿中，使用固定在持针器上的细小昆虫针小心在前后端表皮上穿孔，注意避免损伤下方软组织。
    3. 将幼虫和蛹期样本重新转移回微量离心管，加入1 mL新鲜Bouin固定液，在室温下于实验台继续孵育24小时。
  2. 移除Bouin固定液，用1 mL μ-CT洗涤缓冲液（0.1 M Na2HPO4，1.8%蔗糖）或1× PBS洗涤样本30分钟，重复三次。
  3. 加入1 mL适当的染色液，在实验台放置孵育2–7天。
    注意：染色剂的选择取决于多种因素，通常需在渗透性、孵育时间和分辨率之间进行权衡。一般而言，磷钨酸（PTA）对软组织的对比度和分辨率更优，但需要破坏表皮结构并延长孵育时间。不同类型染色剂的特性在参考文献1中有详细说明。
    1. 碘染色时，使用1 mL 0.1 N I2KI（卢戈氏碘液），孵育2天。成体表皮无需进一步穿孔处理。
    2. 磷钨酸（PTA）染色时，使用1 mL以水配制的0.5%（w/v）溶液。通过移除口器或用固定在持针器上的细小昆虫针在胸部或腹部表皮穿孔，以破坏成体表皮结构。孵育5–7天，若组织染色不均匀可适当延长孵育时间。
  4. 用1 mL超纯水或1× PBS洗涤30分钟，重复洗涤一次。将样本保存在超纯水或1× PBS中，室温下可保存长达一个月。
  5. 若需在水合状态下扫描样本，请直接进入第4节。若需要更长期保存样本，请进入本方案的第3节。

3. 临界点干燥（可选）

  1. 对样品进行乙醇（EtOH）梯度脱水处理：依次使用10%、25%、50%、75%、100%、100%的乙醇溶液，每种浓度加入1 mL，在室温下孵育1小时。
  2. 最后一次100%乙醇浸泡后，更换为新鲜的100%乙醇，并在室温下继续孵育过夜。
  3. 按照仪器制造商的说明对样品进行临界点干燥。
    注意：电子显微镜实验室通常配备有临界点干燥仪（参见材料表），可在乙醇脱水后用于样品干燥。

4. 样品安装

  1. 对于临界点干燥的样品，用热熔胶将样品粘附到昆虫针或其他适合固定在旋转台卡盘内的持样器上，或放置 塑料或玻璃毛细管中 （约1.0-1.25 mm内径）
  2. 对于水合样品，用P10移液器吸头吸取水，并通过热封或使用石蜡膜密封细端，以防止泄漏。
    警告：务必紧密包裹所有连接处，防止水渗入扫描仪造成损坏。
    1. 用镊子将单个样本转移至移液枪头中。使用细长物体（如钝化的20 G针头或另一个移液枪头）小心地将样本推入枪头底部，直至其刚好接触枪头壁，以固定样本位置。
    2. 用石蜡膜覆盖移液器吸头开口，以防止长时间扫描过程中水分蒸发。
    3. 使用专为旋转台卡盘设计的支架安装P10移液器（图1A-C).

5. 扫描

  1. 在当天成像之前，对设备执行所有必要的校准。
    注意：校准步骤因制造商而异，建议咨询应用专家以确定正确的操作流程。有关本实验方案所用设备和软件的具体信息，请参见材料表。通常情况下，进行诸如旋转台夹头轴线对准（以消除夹头相对于旋转台偏心所导致的“晃动”）以及平场校正（以确保相机上背景像素强度均匀）等校准操作，可为获得最佳分辨率以及在多次扫描间具有可比性的数据集提供最优成像条件。
  2. 通过点击软件左上角的“打开门”图标，打开扫描仪门以接触旋转台夹头。通过拧紧样品 holder 底部周围的卡箍来固定样品。
    注意：将样品安装到旋转夹头上时应施加轻柔压力，以保持扫描仪的对准状态。
  3. 在控制扫描仪的软件中设置扫描参数，以获得最佳分辨率和对比度。
    注意：由于不同制造商的X射线源、相机/探测器及扫描仪几何结构存在差异，这些参数需通过实验经验确定。有关选择最佳参数的更多详细信息也可参见文献43，或咨询制造商的应用专家。
    1. 打开X射线源电源控制（选项 | X射线源）。使用滑动条将X射线电压设置为30–40 kV，电流设置为100–110 μA，以产生功率为3–4 W、焦点尺寸较小的X射线束，从而提高分辨率。
    2. 使用采集模式对话框（选项 | 采集模式）将相机曝光时间设置为500–800 ms。
    3. 根据相机设置和位置，使用软件底部放大镜图标旁的滑动条设置所需图像像素大小（约700 nm至4 μm）。该设置决定了扫描过程中采集的投影图像数量，投影数量越多，分辨率越高，但扫描时间也相应延长（见代表性结果）。
    4. 点击并拖动软件底部旋转箭头旁的滑动条，使样品沿其360˚旋转路径移动。确保样品始终保持在视野范围内。
  4. 点击软件顶部的“开始采集”图标（蓝色圆形箭头图标）。此时将弹出一个对话框，允许设置额外的扫描参数，并命名扫描文件及其输出文件夹。
    1. 将随机移动设置为10，并对4–6帧进行平均。旋转步长将根据所使用的相机设置自动计算。
  5. 在采集对话框中点击“确定”以开始扫描。此时将出现第二个进度条对话框，显示扫描所需时间。扫描仪将自动沿旋转路径采集一系列样品的投影图像（图1D），此过程无需人工监控。

6. 重建

  1. 为了生成断层图像，使用投影图像进行图像重建。
    注意：尽管几乎所有基于锥形束几何结构扫描仪的图像重建都依赖于Feldkamp算法16，但具体参数会因软件实现方式的不同而有所差异，应通过实验确定。以下设置针对一种 commercially available software（见材料表），可作为参考。诸如错位补偿、环状伪影减少以及束硬化校正（对于大多数果蝇样本为0%）等参数需通过迭代方式调整，以选择最佳值用于最终重建。对于希望对重建过程进行更精细控制的高级用户，请参见此处的MATLAB接口44。
  2. 通过使用基于参考扫描的位移校正算法执行初步图像对齐45（操作 | 使用参考扫描进行X/Y对齐）。
  3. 微调每个重建参数（开始 | 微调）。这将激活“参数微调”对话框。
    1. 通过点击“下一步”进入“后对齐”来微调对齐。将迭代次数设置为5，参数步长设置为1.0。点击开始按钮生成一系列预览图像，并选择对齐正确的图像。
      注意：对齐正确的图像不应模糊，也不应出现“剪切”伪影，即原本连续的结构（如表皮）看起来分裂的现象。
    2. 通过点击其旁边的选项来微调环状伪影减少参数。将迭代次数设置为5，参数步长设置为1.0。点击开始按钮生成一系列预览图像，并选择环状伪影最少的图像。
  4. 当上述参数已优化以获得最佳图像时，确保所选值在设置选项卡中正确显示（设置）。
  5. 使用直方图调整最终的亮度和对比度值，设置文件参数（如位深度和类型），并使用仅包含感兴趣结构的感兴趣区域（ROI）（例如整只果蝇或仅头部）以减少计算时间（输出）。
  6. 开始重建（开始 | 开始）。如果需要进行多个重建，可将当前图像添加到批处理管理器中（开始 | 添加到批处理），并对其余图像重复步骤6.2–6.5。

7. 图像分析

  1. 使用免费或商业软件在二维和三维中可视化断层图像，并进行进一步的形态计量分析。
    注意：本方案所用软件的详细信息请参见材料表。其他可用于评估 µ-CT 数据集的软件包括免费软件，如 FIJI46、Seg3D (www.seg3D.org)47 和 ITK-SNAP48，以及商业软件（例如 AMIRA）。其他采用基于机器学习算法以半自动执行分割过程的应用程序可帮助加快工作流程并减少人为偏差（例如 Biomedisa49）。
  2. 将断层图像文件导入软件中（文件 | 导入图像文件）。与文件关联的元数据应自动加载到窗口中，但也可手动设置以匹配图像属性。
  3. 为分割感兴趣结构，请点击屏幕左侧的“Segment”选项卡。创建新的感兴趣区域（ROI）（基本 | 新建），为其命名并选择合适的颜色。
  4. 使用滑动条定义包含感兴趣结构的阈值范围（范围 | 定义范围）。
  5. 选择合适的二维或三维 ROI 绘图工具模式（ROI 绘图 | 画笔选项）。
  6. 要绘制由阈值定义的区域，请在按住鼠标左键的同时按住 Ctrl 键。要擦除区域，请在按住鼠标左键的同时按住 Shift 键。
    注意：要更改圆形或方形画笔的大小，只需在按住 Ctrl 或 Shift 键的同时滚动鼠标滚轮即可。
  7. 在整个 Z 轴体积范围内持续绘制感兴趣结构。
  8. 将 ROI 转换为网格（导出 | 转为网格 | 正常）。
  9. 通过点击右上角的 数据属性 和 设置 面板中的网格，高亮显示网格叠加层。
  10. 使用适当的迭代次数对网格进行平滑处理（平滑网格 | 迭代次数）。
    注意：所有需进行比较的图像应使用相同的网格平滑迭代数值。
  11. 确保在屏幕右侧的 信息 面板中显示网格 ROI 的测量值（表面积、体积 和 Feret 直径），以进行基本的形态计量分析。可使用 对象分析模块 进行额外分析。
  12. 渲染网格对象和整个断层图像，并在三维中进行可视化。使用内置的视频制作工具（右键单击 | 显示视频制作工具）从查看器中提取单帧图像（添加关键帧）生成对象视频。
    注意：还可通过右侧面板中的视觉效果选项卡对视频应用多种视觉增强效果，以突出特定特征等。
  13. 使用视频制作工具中的 导出动画 按钮导出视频以供观看。

结果

图2 显示胚胎的图像，3rd 三龄幼虫、羽化前成虫期（P7）的蛹，以及经碘染色并在水中水合后使用商用台式扫描仪成像的成年雌性果蝇。组织保存完好且染色均匀，细微结构清晰可见，所有主要器官均可轻松识别，适用于形态测量分析和三维可视化研究。

通常，采集较少投影图像的扫描所获得的分辨率低于采集较多投影图像的扫描，其权衡在于扫描所需的时间。尽管扫描时间会因仪器及其他扫描参数的不同而有所变化，但采集数百个投影图像（约3 µm图像像素尺寸）的扫描每份样本大约需要30分钟，而包含数千个投影图像（700 nm–1.25 µm图像像素尺寸）的扫描则可能需要8–16小时。同一成年果蝇头壳在“慢速”（数千个投影）和“快速”（数百个投影）扫描模式下成像的对比结果如图3所示。重要的是，“慢速”与“快速”扫描在形态测量分析结果上并无差异（图3C）40。因此，我们的成像流程采用快速扫描以生成足够大的样本量用于形态测量分析，同时采用慢速扫描以更高分辨率观察任何形态或解剖结构的异常。通过软件（步骤7），可对任意感兴趣的组织或器官系统进行分割，用于形态测量分析，并利用动画制作工具在三维中进行可视化呈现（动画1）。

图4展示了使用PTA染色的果蝇腹部在X射线显微镜下成像的结果，成像时样品处于水合状态（水）或经临界点干燥（CPD）后（材料表）。从这些图像中可以明显看出，PTA染色与该平台成像能力相结合所提供的细节非常丰富，中肠的单个上皮细胞以及睾丸内的精子束均能清晰分辨。尽管临界点干燥样品的图像分辨率相较于水合样品略有提高，但水合样品能更好地保持精细组织（如靠近表皮的脂肪细胞）的超微结构（视频2）。

用于在水中成像果蝇的X射线显微镜装置示意图及实验流程图
图1：µ-CT扫描仪设计及样品安装示意图。（A）一台商用台式µ-CT扫描仪。（B）扫描仪内部视图。X射线源（右侧）发射的X射线穿过位于旋转台上的样品（黄色箭头所示）。X射线在穿过样品后到达探测器，其衰减程度形成图像对比度。探测器由闪烁屏（将X射线转换为光子）和标准CCD相机（左侧）组成。（C）将一只成年果蝇固定以在水中进行水合状态成像。移液器吸头与黄铜固定夹之间的连接处用石蜡膜包裹，以防止泄漏及可能对扫描仪造成的损坏。图中同时标示了样品台卡盘。请注意，移液器吸头略微偏离中心轴，导致扫描时间延长且最终重建图像的分辨率降低。（D）一只成年雌性果蝇的单张二维投影图像；在扫描过程中，沿旋转轴采集数百至数千张此类投影图像，并用于重建生成具有各向同性分辨率和精确三维信息的断层图像。比例尺（C）= 2 mm。P，后端；V，腹侧。本图经Schoborg等40修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

胚胎发育的MRI；解剖学横截面示意图，展示器官和神经系统。
图2：通过µ-CT成像的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）所有生命周期阶段。 样品经碘染色，并在水中保持水合状态进行成像。图中显示单个二维切片。(A) 已完成原肠胚形成早期阶段的胚胎（星号）。(B) 三龄幼虫。(C) 变态过程中的P7期围蛹成虫。(D) 成年雌性个体。图中高亮显示多种器官：BWM，体壁肌；Br，脑；Cd，贲门；Cr，嗉囊；DLMs，背纵肌；DVM，背腹肌；E-AD，眼-触角原基；Em，胚胎；FB，脂肪体；FBCs，脂肪体细胞；H，心脏；Hg，后肠；La，髓层；L，腿；Mg，中肠；OL，脑视叶；Ov，产卵器；PC，蛹壳；SG，唾液腺；VNC，腹神经索；W，翅；WD，翅原基。比例尺：(A) = 100 µm；(B)-(D) = 500 µm。D，背侧；A，前端；L，左侧。扫描参数：源到样品距离（mm）：(A, D) 36.5，(B) 48.8，(C) 40.3。源到相机距离（mm）：(A, D) 350，(B, C) 285。相机像素尺寸（µm）：(A-D) 11.6。图像像素尺寸（µm）：(A, D) 1.2，(B) 1.9，(C) 1.7。 请点击此处查看该图的放大版本。

脑部扫描对比；快速与慢速方法；MRI图像；体积图分析；研究结果
图3：扫描参数与图像分辨率不影响形态测量分析。 对同一成人头部使用（A, A’）“快速”扫描设置（数百个投影）和（B, B’）“慢速”扫描设置（数千个投影）进行扫描。脑组织以黄色轮廓标出。（C）慢速与快速扫描所得的脑体积测量结果。高亮结构：AL，触角叶；CB，中央脑；FB，扇形体；FCs，脂肪细胞；La，髓层；Lo，视叶；LoP，视叶板；Me，髓质；Re，视网膜。n = 5，Welch’s t检验。ns = 无显著性差异。 比例尺 = 100 µm。扫描参数：源到样本距离（mm）：(A) 44.4，(B) 36.5；源到相机距离（mm）：(A) 348，(B) 350；相机像素尺寸（µm）：(A-B) 11.6；图像像素尺寸（µm）：(A) 2.95，(B) 1.2。本图经修改自 Schoborg 等人40。请点击此处查看此图的放大版本。

组织学分析、器官切片、对比组织对比度、CPD 与水处理样品。
图 4：Drosophila melanogaster 腹部的X射线显微成像。 腹部用0.5% PTA染色后，以水合状态（水）或临界点干燥（CPD）后进行成像。（A）临界点干燥的腹部，显示为YZ视角，以及（A’）XZ视角。（B）水合状态的腹部，显示为YZ视角，以及（B’）XZ视角。图中高亮显示了多种器官：FC，脂肪细胞；Hg，后肠；Mg，中肠；SP，精子泵；Te，睾丸。比例尺（A）= 250 µm。D，背侧；A，前侧；L，左侧。扫描参数：源到样品距离（mm）：（A）6.7，（B）7。源到相机距离（mm）：（A）28，（B）29.5。物镜：（A-B）4X。图像像素大小（µm）：（A-B）0.65。 请点击此处查看该图的放大版本。

视频 1：使用 Dragonfly 软件中的 Movie Maker 将三龄幼虫进行三维重建。 标注的器官包括脑（黄色）、眼-触角成虫盘（红色）、脂肪体（蓝色）和体壁肌肉（绿色）。请点击此处下载该视频。

视频 2：在水中成像与经临界点干燥后成像的样品比较。 显示的是用 0.5% 钨磷酸（PTA）染色的腹部。两个腹部均以相同的图像像素尺寸设置（0.65 µm）进行扫描。以“Z-堆栈”格式（YZ）展示一系列二维切片，从腹部背侧表面开始，至腹侧表面结束。标注的器官：FC，脂肪细胞；Mg，中肠；SP，精子泵；Te，睾丸。扫描参数：源到样品距离（mm）：(A) 6.7，(B) 7。源到相机距离（mm）：(A) 28，(B) 29.5。物镜：(A-B) 4X。图像像素尺寸（µm）：(A-B) 0.65。 请点击此处下载该视频。

讨论

在所有发育阶段对完整的Drosophila melanogaster进行可视化观察一直是一项挑战，主要原因是光学显微镜难以穿透该生物体厚且含色素的角质层。尽管其他整体动物成像方法，如磁共振成像（MRI）、光学相干断层扫描（OCT）以及结合组织透明化技术的超显微成像，已在果蝇研究中成功应用50,51,52,53,54，但微型计算机断层扫描（μ-CT）具备多项优势，使其成为该生物体整体成像的理想选择13,15,30。X射线能够轻松穿透色素化的角质层，其短波长支持亚微米级成像。标记过程仅需使用广泛可得的化学试剂，且无需特殊的实验操作技能13。μ-CT扫描仪已实现商业化供应，其成本与光学显微镜平台相当，同时因其在地质学、古生物学、工程学等多个学科中的广泛应用潜力，对科研机构更具吸引力。同步辐射X射线源也可用于固定或活体昆虫的高分辨率μ-CT成像31,55,56，但相较于商用台式扫描仪，其可及性较低。

本方案提供了一种高效获取果蝇成虫、蛹、幼虫及细胞化胚胎的μ-CT图像的方法。需要注意的是，对于上述许多步骤，也可采用其他替代方法进行样本制备以用于成像。已有其他研究对昆虫样本所用的不同固定、标记和干燥步骤进行了详细比较，建议有意采用该技术的研究者评估每种方法的优缺点1,4,13,29,30,57。尽管本方案相对简单，但仍提出了一些有益的建议。

首先，在破坏完整标本的角质层时应格外小心，避免对下方的软组织造成显著损伤。在穿刺之前，应让幼虫和早期蛹期样本在Bouin氏液中固定2小时，这有助于硬化组织，并减少血淋巴从角质层破口渗出，从而防止器官结构发生改变。若成虫中感兴趣结构位于特定部位，可将成虫的各个体段（头部、胸部和腹部）分离开。建议使用解剖刀将这些体段干净地切开，而不是用镊子强行撕开，以免破坏肠道或中枢神经系统等结构的三维构型。关于固定时间，成虫通常只需16小时即可完成固定，而幼虫和蛹期则需要24小时。此外，若发现碘或PTA染色不均匀，可将样本重新放回染色液中继续孵育，直至染色均匀。最后，水合状态的样本不应置于4 °C环境中，因为这似乎会在样本恢复至室温后诱导体腔内形成气泡。

其次，样品安装方式会因仪器类型、载物台类型以及样品是否需要保持水合状态或经过临界点干燥处理而有所不同。若样品处于水合状态，需确保其不会泄漏，以免可能损坏扫描仪。将样品装入移液器吸头时，应使用钝头物体轻轻推入，直至样品遇到轻微阻力且无法继续移动为止。用力过猛可能导致角质层变形及内部结构损伤。同时，务必使样品在样品 holder 中尽可能与旋转轴对齐。任何晃动都会因增大视场范围而延长扫描时间，并在重建后降低最终断层图像的分辨率。

第三，用于获取投影图像的扫描仪设置也会因仪器而异。为了最大限度发挥扫描仪的分辨率能力，X射线束的焦点尺寸应尽可能小（5-10 μm）。这可以通过平衡X射线电压和电流设置，使总功率保持在3-4 W来实现。结合这些参数以及相机的适当曝光时间，可实现样品对X射线束的充分衰减，并获得最佳图像对比度。在样品与X射线源之间使用铝或铜滤片，可用于微调最佳X射线能量设置，以获得最佳图像对比度，或对高功率光源进行足够的束流衰减。至于图像分辨率，其受多种变量影响，包括染色类型、投影图像数量、图像像素尺寸、相机位置、样品移动、扫描仪振动以及重建参数。使用包含已知尺寸标记的条形图模型（QRM GmbH）有助于评估特定扫描仪和相机设置下的空间分辨率。

评估成像临界点干燥或水合样品的优劣也具有重要意义。Sombke 等人对这两种方法进行了比较评估，发现对于涉及节肢动物的 μ-CT 应用，临界点干燥效果更优30。然而，水合样品的优势在于动物所经历的化学和机械处理较少，从而可减少可能导致定量和形态学伪影的因素。这种方法通常也能比临界点干燥更好地保存精细组织。但水合样品的保存期限要短得多，应在固定后一个月内完成成像，因为此后组织降解和图像质量下降将变得明显。此外，由于 X 射线还需穿透塑料移液枪头及周围液体（水或缓冲液），水合样品的分辨率略低于临界点干燥样品。临界点干燥样品可长期保存，尤其是在使用 Drierite 干燥剂保存时效果更佳。此外，可通过将翅膀或腿部粘附在昆虫针上并插入样品台卡盘中，直接将其置于 X 射线光路中，从而简化安装过程。然而，这些样品在乙醇脱水过程中可能发生组织收缩以及精细组织结构的丢失，因此采用梯度递增的乙醇浓度进行处理以尽量减少此类影响至关重要。尽管如此，应注意的是，所有形式的化学处理，包括多聚甲醛固定甚至碘染色，均可能导致组织收缩58,59。尽管两种方法均无法提供活体果蝇“真实器官大小”的测量数据，但只要突变体与野生型样品的固定、染色和干燥步骤完全一致——最好并行操作——所获得的形态测量数据仍具有可比性。

总之，μ-CT 为果蝇（Drosophila）提供了一种有效的整体动物成像工具33,34,35,36,37,38,39,40,41。许多其他研究已展示了该技术在理解昆虫分类学、生态学、生理学、发育和解剖学等多个方面的强大能力，这些研究结果可为未来果蝇相关研究提供重要参考1,28,30,31,32,55,56,57。结合该模式生物中已广泛使用的遗传学和光学显微镜技术，μ-CT 可融入实验流程，有助于更深入地理解基因型与表型之间的关系。

披露

作者声明不存在竞争性或经济利益。

致谢

没有Nasser Rusan的支持，这一切都不可能实现。我要感谢美国国立卫生研究院小鼠影像中心的H. Doug Morris、Danielle Donahue和Brenda Klaunberg，以及Micro Photonics公司的Ben Ache，感谢他们提供的培训和有益的讨论。我还要感谢蔡司公司的Mansoureh Norouzi Rad使用Xradia 520 Versa对腹部样本进行扫描。Lauren Smith、Samantha Smith和Rachel Ng也在扫描工作中提供了帮助。Object Research Systems公司的Mike Marsh提供了Dragonfly软件的技术支持。本研究得到了美国国家心肺血液研究所（1K22HL137902-01）和怀俄明大学启动资金的支持。此外，我也感谢匿名审稿人提出的宝贵建议和意见。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100% 乙醇用于临界点干燥
波因液（Bouin's Solution）Sigma-AldrichHT10132用于动物样本固定
临界点干燥仪采用临界点干燥法对样本进行干燥；可选型号多样（如 Balzers CPD 020 或 Leica EMCPD300）
Dragonfly 软件Object Research Systems用于微计算机断层扫描（micro-CT）数据集的可视化与分割；https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html
加热金属块用于微量离心管
图像分析工作站应具备足够的内存和高质量显卡以支持三维渲染
碘溶液（I2KI）费希尔科技（Fisher Scientific）SI86-1用于染色
微计算机断层扫描仪BrukerSkyscan 1172采用锥束X射线几何结构；探测器为像素尺寸11.54 µm 的滨松1000万像素相机
微计算机断层扫描仪控制软件Bruker用于控制扫描仪本身（例如执行平场校正、调节X射线管功率、相机曝光时间、数据采集等）
显微操作针（Minutien Pins）精细科学工具公司（Fine Science Tools）26002-15用于在角质层上穿孔
NRecon 图像重建软件Bruker用于将锥束X射线几何结构采集的二维投影图像重建为横截面图像
P10 移液器吸头Genesee Scientific24-120用于样本装载
磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline）研究产品国际公司（Resarch Products International）P32060-4000.0使用前用水稀释至1X浓度
磷钨酸水合物Sigma-Aldrich79690-25g用于染色
显微针夹持器精细科学工具公司（Fine Science Tools）26018-17用于固定显微操作针（Minutien Pins）
吐温X-100（Triton X-100）研究产品国际公司（Research Products International）111036用于去除成年果蝇表面的蜡质层（配制成0.5% PBST）
X射线显微镜蔡司（Zeiss）Xradia 520 Versa采用锥束X射线几何结构，配备菲涅耳波带片物镜，实现远距离高分辨率成像（Resolution at a Distance, RaaD™）

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