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方法文章

最小体积玻璃化冷冻未成熟猫卵母细胞

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DOI：

10.3791/61523

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2020年6月24日

 , 
1Dipartimento di Scienze Veterinarie per la Salute, la Produzione Animale e la Sicurezza Alimentare 'Carlo Cantoni', Università degli Studi di Milano

本文内容

摘要

本文描述了一种使用实验室自制培养基在商用载体上对未成熟猫卵母细胞进行最小体积玻璃化冷冻的实验方案。该方案涵盖了从离体性腺中分离卵母细胞到玻璃化冷冻及复温的每一个步骤。

摘要

在野生动物保护项目中，配子库的建立对于保护珍贵个体和稀有物种的遗传资源以及促进生物多样性保护至关重要。在猫科动物中，大多数物种面临灭绝威胁，而家猫品种被用作模型以提高种质保存方案的效率。在卵母细胞冷冻保存技术中，玻璃化冷冻在人类和兽医辅助生殖领域正变得越来越普遍。最初为人类卵母细胞和胚胎开发的Cryotop玻璃化冷冻法已被证明同样适用于猫的卵母细胞。该方法具有多项优势，例如可在野外条件下操作以及操作速度快，这在需要处理大量样本时尤为有利。然而，其效率高度依赖操作人员的技术水平，因此需要在不同实验室之间以及实验室内部实现标准化，并加强人员培训。本方案详细描述了一种适用于野外操作的、基于商用载体的猫未成熟卵母细胞最小体积玻璃化冷冻保存逐步操作流程，涵盖从卵母细胞采集到复温的全过程。按照本方案操作，复温后可望获得较高的卵母细胞完整性和存活率（高达90%），但在复温后的成熟率及胚胎发育结果方面仍有改进空间。

引言

冷冻保存已成为辅助生殖技术（ART）中的关键步骤。在人类中，出于医学或个人原因，该技术可用于保存生育能力或推迟生育时间。在动物中，冷冻保存对于克服计划配种时的距离和时间限制至关重要，尤其在农场动物和宠物中；此外，在保护项目中，特别是对于濒危野生动物，该技术可用于保存珍贵个体的遗传物质。当待繁殖个体尚未确定，或为避免与胚胎冷冻相关的伦理问题时（尤其是在人类医学中），配子冷冻保存是最佳选择1。精子相对容易保存，解冻后通常可获得满意的结果；但由于卵母细胞的结构特点，其保存更为复杂。事实上，较低的表面积/体积比以及包绕卵质的透明带的存在，限制了冷冻保护剂和水在细胞内外的移动2。此外，在包括猫科动物在内的家畜中，卵母细胞的细胞质富含脂质，这被认为使其对冷冻保存更为敏感3。

大多数猫科动物都面临威胁，而家猫由于常规卵巢切除术可获得性腺，因此被用作开发生殖质保存方案的模型。在野生动物中，性腺可在选择性手术后或（更常见的情况）死后获取，并可从中回收未成熟（生发泡期）配子。由于存在伦理问题以及不同物种和个体对处理措施的反应各异，旨在获得成熟（第二次减数分裂中期）卵母细胞的激素刺激在野生动物中并不像人类辅助生殖技术中那样普遍4。

因此，冷冻保存策略的开发主要集中在未成熟配子上，因为这些配子通常可在珍稀个体意外或突然死亡后获取。从生物学角度来看，未成熟与成熟配子的冷冻保存存在一些差异，各自具有优势。首先，未成熟卵母细胞中的DNA受到更好的保护，其生发泡内染色体被核膜包裹，而减数分裂中期II（MII）卵母细胞的纺锤体则可能更容易受到冷冻损伤5。其次，低温诱导的细胞骨架损伤可能影响纺锤体旋转、极体排出、原核迁移以及胞质分裂，这些影响因卵母细胞发育阶段不同而异，可能干扰减数分裂进程或受精后的事件。最后，也是最重要的一点，成熟卵母细胞已具备受精能力，而未成熟配子则依赖周围卵丘细胞的支持，完成核成熟和胞质成熟6，因此通常对完整的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）进行冷冻保存。然而，卵丘细胞的丢失和/或配子与周围体细胞之间功能性连接的丧失，可能是未成熟COC冷冻保存过程中最具破坏性的负面影响。

在冷冻保存技术中，玻璃化冷冻法更易于在野外条件下应用。与慢速（或程序控制）冷冻相比，玻璃化冷冻速度更快，且无需特定设备（如程序冷冻仪）。为了满足玻璃化冷冻的三个基本原理（即高黏度、与高浓度冷冻保护剂相关的小体积以及超快速降温），已开发并使用了多种培养基和载体，用于家猫未成熟和成熟卵母细胞的冷冻。最初使用简单的麦管7，随后开发出旨在实现“最小体积”目标的装置。此后曾使用过 Cryoloop8、开放式拉细麦管（OPS）9、塑料槽（改良麦管）10 和 cryotube11，直到采用更为高效的装置——Cryotop11，显著提高了细胞存活率和减数分裂恢复能力。补充图1所示的Cryotop是一种市售载体，已成为玻璃化冷冻首选的开放式系统。该装置最初为人类卵母细胞和胚胎的玻璃化冷冻而设计，由一条附着于硬质塑料手柄上的薄膜条构成，储存时由塑料管帽保护12。由于其操作简便，且玻璃化冷冻液体积极小（可低至0.1 µL），从而实现了极快的降温和复温速率，这一玻璃化冷冻载体已被越来越多地应用于包括家猫在内的多个物种，并已在不同培养基条件下成功应用13,14,15,16,17。

本文旨在介绍一种采集-玻璃化冷冻-复温方案，该方案在最初为人类卵母细胞开发的方案基础上进行了少量修改，采用实验室自制培养基和商业化支撑材料，实现最小体积的玻璃化冷冻，可方便地在野外条件下应用于猫科动物未成熟卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的冷冻保存。

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方案

由于猫卵巢是在兽医诊所作为宠物主人要求的常规卵巢切除术或卵巢子宫切除术的副产品收集的，因此本研究所述操作未经过伦理审批。

1. 卵母细胞采集

  1. 开始实验前，准备用于卵巢和卵母细胞采集的溶液。用磷酸盐缓冲液（PBS）配制卵巢采集液，其中加入抗生素和抗真菌剂混合物（青霉素G钠100 IU/mL、硫酸链霉素0.1 mg/mL、两性霉素B 0.25 μg/mL）。用PBS配制卵母细胞采集液（即PBS/PVA），其中含青霉素G钠100 IU/mL、硫酸链霉素0.1 mg/mL以及0.1%（w/v）聚乙烯醇（PVA）。
  2. 将卵巢和卵母细胞采集液储存于4 °C，待用。
  3. 在母猫绝育当日，处理样本前数小时，取出部分卵巢和卵母细胞采集液，于室温（RT；25 ± 2 °C）下预热。
  4. 当样本送达实验室后，在培养皿中用新鲜的卵巢采集液清洗卵巢，去除周围结缔组织及输卵管。
  5. 为每只母猫准备一个35 mm培养皿，加入约3 mL室温PBS/PVA溶液，另准备一个培养皿用于收集卵母细胞。
  6. 将一对卵巢置于培养皿中，使用外科手术刀片切碎皮质组织，并在体视显微镜（放大倍数8倍）辅助下确认所有卵泡均已破碎。
  7. 用移液器收集卵丘-卵母细胞复合体（COCs），转移至指定培养皿中的新鲜PBS/PVA溶液中。挑选质量良好的COCs，其细胞质应均匀、颜色较深，并被多层致密的卵丘细胞包裹（I级18）。

2. 玻璃化冷冻

  1. 配制平衡液和玻璃化冷冻液。
    1. 在 Medium 199 中加入 7.5% (v/v) 乙二醇 (EG)、7.5% (v/v) 二甲基亚砜 (DMSO) 和 20% 胎牛血清 (FBS)，配制平衡液 (ES)。
    2. 配制玻璃化冷冻液（VS）：在含20% FBS的Medium 199中加入15%（v/v）乙二醇（EG）、15%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）和0.5 M蔗糖（改良自 19).
    3. 使用前将ES和VS在室温下预热。
      注意：已知冷冻保护剂（如 EG、DMSO）具有细胞毒性。为减轻其毒性，可采用在较低温度下使细胞暴露于冷冻保护剂中的策略。20，且卵母细胞通常在室温下暴露于冷冻保护剂中。因此，本方案中从卵母细胞采集到玻璃化冷冻的整个过程均在室温下进行，以避免温度波动。
  2. 准备玻璃化冷冻皿（即一种特殊的培养皿，包含两排共六个锥形孔，称为“Repro plate”）。每种玻璃化冷冻载体准备一排（三个孔）。
    1. 在第一个孔的底部加入 20 µL 的 ES。
    2. 在第二个（即1VS）和第三个（即2VS）孔的底部各加入300 µL VS。
  3. 在ES中平衡COCs。
    1. 使用细口径移液管（例如在本生灯上拉细的巴斯德移液管，使其直径至少为200 µm），将一个（或多个）卵丘-卵母细胞复合体（COC）转移至第一孔的底部。
      注意：根据卵母细胞周围卵丘细胞层数及COCs的大小选择移液器规格，尽量减少每一步操作中随COCs转移的培养基体积。按照本方案，经过培训的操作人员可成功将最多八个猫科COCs进行玻璃化冷冻，每个冷冻载体可承载八个。
    2. 缓慢地在液滴边缘加入 20 µL ES。等待 3 分钟。
    3. 缓慢地在液滴边缘加入另外20 µL的ES。静置3分钟。
    4. 缓慢地在液滴边缘加入 240 µL 的 ES。静置 9 分钟。
    5. 等待期间，准备一个装有液氮（LN2），用实验/猫编号代码标记玻璃化支持物，并保持打开状态。将两者放置在体视显微镜附近，以便操作时易于取用。
      警告！操作液氮（LN）时请穿戴个人防护装备2.
    6. 或者，如果需要玻璃化保存多批卵丘-卵母细胞复合体（COCs），可开始对另一组COCs进行第一步平衡（参见步骤2.3.1–2.3.2），该组COCs将被加载到新的玻璃化载体上。
  4. 在90秒内将COCs在VS中进行玻璃化冷冻。
    1. 使用同一根小口径移液管，吸取1VS培养液，从第一孔（ES）底部取出COCs，并将其转移至第二孔（1VS）的液面表面。
    2. 用1VS清洗移液管。
    3. 将COCs转移至孔板的另一区域（底部）；用移液器混匀其周围的培养基。
    4. 在孔板的另一区域用移液器吸取1VS培养基，吸取卵丘-卵母细胞复合体（COCs），转移并用移液器混匀其周围的培养基。
    5. 重复步骤 2.4.4。
    6. 用2VS冲洗移液管。
    7. 将COCs转移至第三个孔的底部（2VS）；用移液器混匀其周围的培养基。
    8. 在孔板的另一区域用移液器吸取2VS培养基，吸取卵丘-卵母细胞复合体（COCs），转移并用移液器混合其周围的培养基。
    9. 重复步骤 2.4.8。
    10. 在孔的另一区域用2VS填充移液管，吸取COCs并将其加载到玻璃化支持条的尖端附近。吸除多余培养基，尽可能减少VS的体积。
    11. 立即将玻璃化冷冻支持物浸入液氮中2，移动它。用一些夹子将其封闭，确保其始终浸没在液氮中2.
      注意：由于冷冻保护剂具有细胞毒性，掌握正确的操作时间至关重要。由于玻璃化冷冻介质中保护剂浓度较高，必须通过精准的技术操作来控制细胞暴露时间。21如果样本充足，可考虑将其分装处理，以加快操作速度，并最大限度缩短从卵母细胞采集到玻璃化冷冻之间的时间。
  5. 将载有样品的玻璃化冷冻支撑架存放于冻存杯中，并置于液氮中保存2 直至加热前均置于容器中。
    注意：如果使用液氮，本方案的所有前述步骤也可在野外条件下进行2 可获得。需要使用干式运输箱将样本安全运送至实验室，然后在实验室中进行后续步骤。

3. 温育

  1. 准备预热培养基。
    1. 用含20%胎牛血清（FBS）的Medium 199配制含1 M蔗糖的解冻液（TS）。
    2. 用含20%胎牛血清（FBS）的Medium 199配制含0.5 M蔗糖的稀释液（DS）。
    3. 用含20%胎牛血清（FBS）的Medium 199配制洗涤液（WS）。
    4. 使用前将TS预热至38 °C，DS和WS在室温下回温。
  2. 如有需要，准备用于后续复苏后COCs培养的培养基（例如体外成熟，IVM）。
  3. 将加热台放置在体视显微镜附近并开启（设定为38 °C），同时将培养皿盖子放入以预热。
  4. 当所有准备工作完成后，将玻璃化冷冻载体从液氮储存罐转移至装有液氮（LN2）的转运盒中，并将该盒置于体视显微镜旁。
  5. 准备“生殖板”（Repro plate），为每个需要复温的玻璃化冷冻载体准备一行。
    1. 在第一孔底部加入300 µL DS。
    2. 在第二孔（即1WS）和第三孔（即2WS）底部各加入300 µL WS。
  6. 在培养皿盖上滴加一滴TS（100 µL）。
  7. 使用镊子在液氮（LN2）中打开一个玻璃化冷冻载体。
  8. 将TS液滴滴置于体视显微镜下，迅速将玻璃化冷冻载体从液氮（LN2）中取出，并将其条带浸入液滴中，轻轻移动直至所有COCs脱落。载体一旦排空即从液滴中移出，但COCs需在TS中总共停留1分钟（从浸入开始计时，至下一步操作结束）。
  9. 取一支与玻璃化冷冻时所用相似的移液器，吸入DS。将COCs从TS液滴中吸出，并转移至第一孔底部（DS）。静置3分钟。
  10. 用1WS清洗移液器，将COCs吸出并转移至第二孔底部（1WS）。静置5分钟。
  11. 用2WS清洗移液器，将COCs吸出并转移至第三孔表面（2WS）。等待其沉降至孔底。
  12. 在第三孔的另一区域重复步骤3.11。
  13. 用培养基清洗移液器，将卵母细胞转移至培养皿中以进行后续操作（例如IVM）。

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结果

根据本方案进行猫卵母细胞玻璃化冷冻及复温后（图1 和 补充图1），绝大多数配子能够存活。在玻璃化冷冻后，可通过光学显微镜观察形态完整性来评估存活率，这是多种评估方法中的一种。22 或使用活性染料。其中一种常用染料为荧光素二乙酸酯/碘化丙啶（FDA/PI），可用于区分活细胞（亮绿色荧光）与死细胞（红色荧光）。 图2 显示了刚复温后经FDA/PI染色的猫卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的代表性图像。有关玻璃化冷冻后存活率的实验数据列于 表1，显示了用于体外成熟的卵母细胞在复温后的数据17 或体外胚胎生产16总体而言，在此处用作示例的两个实验中16,17435个卵母细胞中有395个存活，总体复苏后存活...

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讨论

卵母细胞冷冻保存是一种重要的种质资源保护技术，尤其适用于许多物种濒临灭绝的分类群，如猫科（Felidae）。本文介绍了一种简单且适合野外应用的猫科动物未成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存方案。实验自制的培养基、最小体积玻璃化冷冻载体以及经过培训的专业人员是该方法成功的关键因素，如本文所报告的代表性结果所示，该方法能够持续且重复地获得具有活力的卵母细胞。

从培养基制备开始，应准确遵循操作步骤以确保最佳结果，但操作者的技术水平是关键因素。培养基应在玻璃化冷冻当天配制；若无法实现，也可在前一天配制并保存于4 °C。无论何种情况，在处理样本前都应留出足够时间，使溶液恢复至室温（RT）。卵母细胞的采集及卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的筛选是辅助生殖技术（ARTs）实验室常规开展的快速且简单的操作。然而，冷冻保存是最为精细的步骤。只要遵循操作流程和时间要求，复苏过程相对不敏感，而玻璃化冷冻则可能更为复杂。在平衡步骤中，只需严格遵守规定时间即可，最具挑战性的阶段很可能是玻璃化冷冻步骤（参见本方案第2.4节）。实际上，卵母细胞的转移和移液管的清洗必须把握好时机，整个操作需在90秒内完成。对于初学者，建议...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了欧洲小动物生殖学会（EVSSAR）2016年资助项目以及米兰大学2019年研究支持计划（Linea 2 Azione A）的资助。我们还要感谢MariaGiorgia Morselli博士在本文所述实验及图像采集工作中所做出的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
两性霉素BSigma-AldrichA2942/
自动移液器 &及提示//需要使用移液器移取 20、100、240 和 300 µL
手术刀//10号通常可以
本生尖嘴钳///
夹具//一些小型的（蚊式钳）用于卵巢分离，一些较大的（Klemmer钳）用于液氮操作
Cryotop北里（经销商：MBT - Medical Biological Technologies）01.CR不同国家/地区的经销商和目录编号可能有所不同
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD2650/
乙二醇（EG）Sigma-AldrichE9129/
胎牛血清（FBS）Sigma-AldrichF9665/
巴斯德玻璃吸管//建议长度 230 mm（100+130）
烧杯//根据储罐的罐体
加热台//所有加热阶段均可接受，只要能够维持38ºC
液氮///
Medium 199Sigma-AldrichM4530/
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichD8662/
青霉素G钠Sigma-AldrichP3032/
聚乙烯醇（PVA）Sigma-AldrichP8136/
可重复使用培养板北里（经销商：MBT - Medical Biological Technologies）01.K-2不同国家/地区的经销商和目录编号可能有所不同
体视显微镜//只要操作者能够挑选卵母细胞，其他体视显微镜也可使用
储液罐//任何定期加满的储液罐均可
硫酸链霉素Sigma-AldrichS9137/
耐泡沫塑料/氮气箱//所有可盛装液氮的盒子均可使用，只要操作者感到方便即可。Kitazato 盒称为 "冷却架"
蔗糖Sigma-AldrichS1888/
计时器//所有可设置9分钟以内时间的计时器均可使用

参考文献

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