一种经济高效且可灵活调整的划痕迁移实验方法

摘要

我们提出了一种经济高效的划痕迁移实验方法，为测定细胞迁移提供了一种无需依赖高成本设备的新途径。尽管本实验方案使用了成纤维细胞，但该方法可经调整后用于研究其他细胞类型及影响细胞迁移的因素。

摘要

细胞迁移在生理和病理过程中均起着关键作用。正常的细胞迁移对于发育和免疫应答等基本功能至关重要。当细胞迁移过程出现缺陷或异常时，可能导致严重的不良后果（例如癌症转移、伤口愈合障碍和瘢痕形成）。鉴于细胞迁移的重要性，有必要采用一种经济、灵活且可重复的细胞迁移检测方法。基于常用的划痕迁移实验，我们开发了一种新方法，仅需使用常规实验室设备即可分析细胞迁移。该方法通过可视化标记，可在无需延时显微成像的情况下重新定位特定感兴趣区域。此外，该方法在实验设计上具有高度灵活性，可对迁移基质底物进行调整，也可加入药理学修饰剂。同时，本实验方案还提出了一种计算细胞迁移面积的方法，而这一参数在许多现有方法中常被忽略。这一新方法使划痕迁移实验能够被更广泛的研究者所采用，为深入研究细胞迁移在生理及病理生理条件下的影响提供了更多机会。

引言

细胞迁移在许多生理和病理过程中至关重要。它在发育过程、免疫应答以及正常伤口愈合中均发挥必要作用^1,2,3。这些细胞迁移事件中的许多可由物理或化学信号触发。例如，在免疫应答过程中，白细胞会朝损伤部位迁移，以响应趋化因子的刺激²。此外，白细胞还会释放细胞因子，诱导其他免疫细胞以及其他参与伤口愈合过程的细胞类型（如成纤维细胞）发生迁移，从而启动多细胞协同反应⁴。细胞迁移能力对于维持正常的生理功能至关重要；然而，当细胞迁移失去控制时，可能产生不利影响，并促进慢性炎症、血管疾病、癌症转移以及伤口愈合障碍等病理过程的发生^2,3,4,5,6,7。由于细胞迁移功能缺陷，糖尿病患者常出现伤口愈合障碍；若这些缺陷未得到及时干预，可能导致更严重的并发症（例如截肢^8,9）。本研究及其他相关研究均表明，有必要进一步深入理解细胞迁移在正常生理条件或病理条件下发生的具体机制，这对推动该研究领域的发展至关重要。为实现这一目标，需要提供对研究人员而言易于获取且成本较低的迁移检测方法，特别是那些缺乏开展此类检测所需设备的研究人员。

目前，已有多种迁移实验可用于研究细胞迁移相关的广泛课题。研究人员已开发出二维（2D）和三维（3D）迁移模型，分别针对影响细胞迁移的不同特定方面。3D迁移模型通常用于细胞侵袭研究，用于评估细胞外基质对细胞迁移的影响^10,11,12，而2D迁移实验的应用范围更广，主要用于研究趋化性迁移、伤口愈合以及细胞迁移过程中的功能变化^13,14,15,16。其中一些实验需要额外设备，例如Boyden小室或排斥环，这可能限制部分研究人员对这些实验的可及性。一种成本较低的实验方法是划痕实验，通常用于评估伤口愈合及细胞迁移的一般性变化^14,17。尽管大多数实验室具备开展划痕实验的条件，但用于追踪细胞迁移的设备往往难以获得或购置成本过高。这包括延时显微镜系统，其需要倒置显微镜和活细胞成像系统。这些昂贵的设备并非所有实验室都能普遍获取。因此，这一现状凸显了建立一种新实验方案的必要性，即利用更易获得的设备来评估细胞迁移能力。

本文介绍的实验方案提供了一种新颖且经济的方法来评估细胞迁移。该方法的操作流程与划痕实验相同，但在分析细胞迁移时采用了基础科学研究实验室中更为常见的设备，从而实现了方法上的改进。本方案利用常规设备，无需延时显微镜即可更准确地测定细胞迁移。除了评估迁移能力外，该方法还考虑了划痕区域中存在的可变因素，这些因素已被证实对细胞迁移具有显著影响。总体而言，这一新的细胞迁移分析方案为更多实验室深入探索并推动细胞迁移领域的研究提供了可能。

方案

1. 细胞培养通则

1. 在含有1 g/L葡萄糖、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养心肌成纤维细胞，添加14.2 mM NaHCO₃、14.9 mM HEPES、15%热灭活胎牛血清（FBS）、2% L-谷氨酰胺和0.02%抗菌剂（参见材料表），并在37 °C的CO₂培养箱中维持培养。
2. 将心肌成纤维细胞培养至第0代（P0）时达到90–95%融合度。此时成纤维细胞可传代至48孔板，用于迁移实验。

2. 迁移板的制备

1. 使用黄色或浅色永久性记号笔，在48孔细胞培养板的每个孔中央画一条直线，然后画三条刻度线，将孔均分为三个独立的观察区域。这些区域将用于成像。
   注意：使用浅色永久性记号笔有助于清晰成像迁移中的细胞。黑色或蓝色等深色记号笔会阻碍对迁移细胞的观察。
2. 若需在基质（如胶原蛋白）上评估细胞迁移，请按照特定基质的使用说明和推荐浓度，在此时对孔进行包被处理。
3. 将约15,000–20,000个P1代心肌成纤维细胞接种至每个孔中，并在正常培养条件下（见前一节所列条件）培养，直至细胞融合度达到90–95%。细胞融合通常在24–48小时内完成。
   注意：设置迁移实验板时，应包括阳性对照（已知具有迁移能力的细胞，如3T3细胞¹⁸）、阴性对照（未划痕的细胞）以及空白孔。

3. 划痕迁移实验 & 固定

1. 当细胞融合度达到90-95%时，吸去培养基，并使用无菌P200移液器吸头沿已画好的线划痕。
   注意：P200移液器吸头是划痕实验中常用的吸头尺寸^10,14,19。此外，仅使用P200吸头划一次，多次操作可能导致出现多条划痕线。
2. 用低血清培养基（1.5% FBS）清洗孔板，以去除未贴壁的心脏成纤维细胞。
3. 向每孔加入500 µL低血清培养基。如需使用任何药理学试剂，应在此时加入。
   注意：使用低血清培养基是因为其可允许/促进细胞迁移的发生，同时防止成纤维细胞增殖，从而避免对迁移实验结果造成偏差²⁰。本实验方案中使用的是1.5% FBS。
4. 在将成纤维细胞于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育24小时之前，采集0小时的图像。
   1. 使用配备20倍物镜的倒置显微镜采集0小时图像。每孔采集两张0小时图像，以便更完整地覆盖迁移线区域。
   2. 根据标记（直线和短划线），调整孔板位置以拍摄划痕线的上半部分。避免对中间短划线区域成像，以确保同一迁移区域不会被重复拍摄，从而避免结果偏差。
   3. 使用成像软件（材料表）采集0小时图像#1。然后移动孔板，使划痕线的下半部分进入显微镜视野。同样避免拍摄中间短划线区域。定位完成后，采集0小时图像#2（图1）。
      注意：在两张0小时图像中均避免拍摄中间短划线区域，可防止迁移区域被重复采集，否则可能导致结果重复并影响数据准确性。
5. 孵育24小时后，吸去孔内培养基，并用1x非无菌PBS清洗孔板（此后所用的所有1x PBS均为非无菌）。
6. 在通风橱中，向每孔加入500 µL 4%多聚甲醛，在室温（RT）下孵育10分钟。
7. 吸去多聚甲醛，用1x PBS在室温下清洗3次，每次5分钟。
8. 细胞清洗完毕后，可立即进行24小时图像采集，或向每孔加入1x PBS并将孔板置于4 °C保存，待后续成像使用。细胞可在4 °C保存1-2周后再进行成像。
   1. 向每孔加入300 µL透化液（1x PBS + 0.01% Triton X-100）对细胞进行透化处理。在室温下轻轻持续摇动孵育30分钟。
   2. 吸去透化 液，加入1%考马斯亮蓝染液（3%考马斯亮蓝、10%乙酸、45%甲醇和45% dH₂O），在室温下轻轻持续摇动染色10分钟。
      注意：若孔板包被了细胞外基质底物，应在进行迁移实验前先用包被孔板测试考马斯亮蓝染色效果。图2表明，该实验可使用基质底物且不会影响细胞的可视化观察。
   3. 在室温下用1x PBS持续摇动清洗3次，每次5分钟。
   4. 清洗结束后，向每孔加入300 µL 1x PBS，并采集24小时图像。
   5. 通过将孔板调整至与采集0小时图像时相同的位置来采集24小时图像。为实现精确定位，可打开先前采集的0小时图像，并利用永久性记号笔所做的标记，将孔板调整至相同位置。中间的直线及附加的短划线标记应能实现24小时图像与0小时图像之间的精确对位（图1）。

4. 0 小时和 24 小时图像的制备

1. 在成像软件中打开同一孔位和位置在0 h和24 h拍摄的图像（材料表）。
2. 在0 h图像上创建一个新图层。然后单击该新图层，并通过双击文本将其重命名为“line layer”（线条图层）。
   注意：此后该图层将被称为线条图层。
3. 单击画笔工具（画笔图标），将画笔大小设置为10像素，颜色设置为红色。
4. 选中线条图层后，绘制两条独立的线，以勾勒出划痕区域的轮廓。这些线条不应接触任何细胞，因为它们用于标记迁移区域。
5. 单击移动工具（箭头图标），然后按住Ctrl键并同时单击线条图层和背景图层。
6. 在0 h图像的中心位置单击，然后将这两个图层拖动至24 h图像的中央。
7. 使用24 h图像时，单击0 h背景图层，并将其不透明度调整为50%。
8. 按住Ctrl键，单击0 h背景图层和线条图层，然后进行自由变换（编辑>自由变换）。通过自由变换功能，将0 h背景图层和线条图层与24 h背景图像对齐。此步骤实现了0 h与24 h图像的叠加，从而确保标记迁移区域的线条能准确地定位在24 h图像上。
9. 成功将0 h背景图层和线条图层叠加到24 h背景图像后，删除0 h背景图层。删除方法为：单击0 h背景图层，右键单击，然后选择删除图层。
10. 删除0 h背景图像后，仅保留线条图层和24 h背景图层（现称为迁移图像）。线条图层将在24 h图像上标示出迁移/划痕区域，可用于确定迁移细胞的数量。
11. 将新的迁移图像另存为Photoshop文件以及TIFF/JPEG格式。注意：该过程的代表性图示见图3。

5. 计数迁移细胞的数量

1. 打开迁移图像。可使用支持 TIFF/JPEG 文件的程序完成此操作（材料表）。
2. 计数位于两条红线之间以及与红线接触的细胞数量。
3. 记录每张图像中迁移的细胞数量。每个孔将有两张迁移图像，这些数值应在校正迁移面积之前保持独立，不得合并（详见下一部分）。

6. 确定迁移面积

1. 在第5节的成像软件程序中（材料表），打开包含迁移条带的24小时图像。
2. 将此图像“另存为”“迁移区域图像”。
3. 保存后，点击背景图层，右键单击并选择删除图层。此时图像中应仅保留划痕线（图3）。
4. 使用画笔工具（画笔图标）填充划痕线之间的区域。画笔颜色应与绘制迁移线时所用颜色一致。
5. 将图像转换为灰度图像，以生成黑白图像（图像>模式>灰度），然后保存图像（图4）。
6. 启动分析软件（材料表），然后在分析软件中打开“迁移区域”文件。
7. 为确定迁移条带的面积，点击 图像>调整>阈值。黑色迁移区域将变为红色，阈值框中将显示面积百分比。该数值表示迁移条带所占面积占图像总捕获面积的百分比。
8. 记录迁移条带的面积百分比，并确保该数值与同一图像中迁移细胞的数量相对应。

7. 数据分析

1. 将迁移细胞数量归一化为划痕区域的百分比面积。将迁移细胞数量除以迁移线的区域百分比（迁移细胞数 / 迁移区域面积%）。此操作需针对每张图像单独进行，而非基于每个孔的平均迁移值。
2. 在对每张图像的数值进行归一化后，将两张图像的数值相加，代表单个孔的结果。该数值将用于图形绘制和统计分析。若实验设计包含多个重复样本，在统计分析前先对重复样本的数值取平均值。

结果

本实验记录了一种研究细胞迁移的新方法，该方法既经济实惠，又易于被大多数实验室采用。许多研究曾使用延时显微镜来评估细胞迁移，但该方法所需的设备在许多实验室中并不容易获得。而通过使用线条和虚线进行标记，则可以在无需昂贵设备的情况下，在不同时间点重新定位特定的感兴趣区域（图1 和 图3）。尽管标记的使用对于这种新方法至关重要，但该方法的多个环节均可根据研究人员的具体需求进行调整。本方案中设定的终点为24小时；然而，该终点可根据各实验室的具体需要进行延长。调整实验终点可使细胞持续培养，以便后续进一步使用。此外，本方案具有灵活性，可用于检测药理学调节剂以及细胞外基质底物对细胞迁移的影响。最后，该方法中最昂贵的部分是成像软件的使用，尽管这类软件可能是需授权许可的软件，但使用授权软件并非唯一选择。其他能够生成线条并叠加图像的成像软件也可用于此方法。除了该方法本身具备的成本效益和可适应性外，它还通过引入划痕面积作为考量因素，为研究细胞迁移提供了一种全新的途径。

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讨论

这种新的划痕迁移实验方法为研究人员提供了一种更便捷的手段来检测细胞迁移的变化。尽管该实验在制造划痕的操作步骤上与其他划痕实验相同，但它在细胞迁移的成像和精确分析方面提供了一种新方法¹⁰。该方法无需依赖设备要求较高的延时显微镜和活细胞成像培养装置，而是详细描述了如何使用实验室中常见的设备。利用普通的倒置显微镜和相机，可以在保持一致培养条件的同时，在相同时间点获取迁移图像。此外，该方法能够在不使用高端设备的情况下，精确地对同一目标区域进行成像。重复捕获相同的迁移区域将减少细胞迁移测定中的不一致性，从而提供更严谨、更准确的细胞迁移测量结果。最后，该方法还考虑了划痕面积的影响。尽管操作中已尽量减少人为造成的划痕差异，但仍可能存在不一致情况，因此在细胞迁移分析中使用面积作为归一化因子显得尤为重要。总体而言，上述方案为一种广泛用于评估细胞迁移的强大工具提供了新的改进方法。

开发一种可调节的迁移实验方法为研究提供了新的途径。本文介绍的迁移实验可根据特定的研究问题进行修改。可通过激活或抑制特定目标蛋白对实验进行调整。在迁移实验之前、期间甚至之后，均可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Adobe 所有应用程序	Adobe		包括本方案所用的图像处理软件 Adobe Photoshop
Avant 200 µl 非无菌吸头	MIDSCI	AVR1	吸头经高压灭菌处理以达到无菌
AxioCam Erc 5s 相机	Zeiss	426540-9901-000
考马斯亮蓝 R-250	Fisher Scientific	BP101-25
Costar 平底细胞培养板，48 孔	Fisher Scientific	07-200-86
含 L-谷氨酰胺、1 g/L 葡萄糖和丙酮酸钠的 DMEM 培养基	Fisher Scientific	MT10014CM
Image J	NIH		这是美国政府提供的免费软件，为本方案所用的分析软件
多聚甲醛	Fisher Scientific	AC416785000
优质美国来源胎牛血清	Innovative Research	IFBS-HU
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	这是本方案中用于培养心肌成纤维细胞的抗菌剂
Zeiss Primovert 显微镜	Zeiss	491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 软件	Zeiss		软件随相机购买提供