一种经济高效且可灵活调整的划痕迁移实验方法

摘要

我们提出了一种经济高效的划痕迁移实验方法，为测定细胞迁移提供了一种无需依赖高成本设备的新途径。尽管本实验方案使用了成纤维细胞，但该方法可经调整后用于研究其他细胞类型及影响细胞迁移的因素。

摘要

细胞迁移在生理和病理过程中均起着关键作用。正常的细胞迁移对于发育和免疫应答等基本功能至关重要。当细胞迁移过程出现缺陷或异常时，可能导致严重的不良后果（例如癌症转移、伤口愈合障碍和瘢痕形成）。鉴于细胞迁移的重要性，有必要采用一种经济、灵活且可重复的细胞迁移检测方法。基于常用的划痕迁移实验，我们开发了一种新方法，仅需使用常规实验室设备即可分析细胞迁移。该方法通过可视化标记，可在无需延时显微成像的情况下重新定位特定感兴趣区域。此外，该方法在实验设计上具有高度灵活性，可对迁移基质底物进行调整，也可加入药理学修饰剂。同时，本实验方案还提出了一种计算细胞迁移面积的方法，而这一参数在许多现有方法中常被忽略。这一新方法使划痕迁移实验能够被更广泛的研究者所采用，为深入研究细胞迁移在生理及病理生理条件下的影响提供了更多机会。

引言

细胞迁移在许多生理和病理过程中至关重要。它在发育过程、免疫应答以及正常伤口愈合中均发挥必要作用^1,2,3。这些细胞迁移事件中的许多可由物理或化学信号触发。例如，在免疫应答过程中，白细胞会朝损伤部位迁移，以响应趋化因子的刺激²。此外，白细胞还会释放细胞因子，诱导其他免疫细胞以及其他参与伤口愈合过程的细胞类型（如成纤维细胞）发生迁移，从而启动多细胞协同反应⁴。细胞迁移能力对于维持正常的生理功能至关重要；然而，当细胞迁移失去控制时，可能产生不利影响，并促进慢性炎症、血管疾病、癌症转移以及伤口愈合障碍等病理过程的发生^2,3,4,5,6,7。由于细胞迁移功能缺陷，糖尿病患者常出现伤口愈合障碍；若这些缺陷未得到及时干预，可能导致更严重的并发症（例如截肢

方案

1. 细胞培养通则

1. 在含有1 g/L葡萄糖、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养心肌成纤维细胞，添加14.2 mM NaHCO₃、14.9 mM HEPES、15%热灭活胎牛血清（FBS）、2% L-谷氨酰胺和0.02%抗菌剂（参见材料表），并在37 °C的CO₂培养箱中维持培养。
2. 将心肌成纤维细胞培养至第0代（P0）时达到90–95%融合度。此时成纤维细胞可传代至48孔板，用于迁移实验。

2. 迁移板的制备

1. 使用黄色或浅色永久性记号笔，在48孔细胞培养板的每个孔中央画一条直线，然后画三条刻度线，将孔均分为三个独立的观察区域。这些区域将用于成像。
   注意：使用浅色永久性记号笔有助于清晰成像迁移中的细胞。黑色或蓝色等深色记号笔会阻碍对迁移细胞的观察。
2. 若需在基质（如胶原蛋白）上评估细胞迁移，请按照特定基质的使用说明和推荐浓度，在此时对孔进行包被处理。
3. 将约15,000–20,000个P1代心肌成纤维细胞接种至每个孔中，并在正常培养条件下（见前一节所列条件）培养，直至细胞融合度达到90–95%。细胞融合通常在24–48小时内完成。
   注意：设置迁移实验板时，应包括阳性对照（已知具有迁移能力的细胞，如3T3细胞

结果

本实验记录了一种研究细胞迁移的新方法，该方法既经济实惠，又易于被大多数实验室采用。许多研究曾使用延时显微镜来评估细胞迁移，但该方法所需的设备在许多实验室中并不容易获得。而通过使用线条和虚线进行标记，则可以在无需昂贵设备的情况下，在不同时间点重新定位特定的感兴趣区域（图1 和 图3）。尽管标记的使用对于这种新方法至关重要，但该方法的多个环节均可根据研究人员的具体需求进行调整。本方案中设定的实验终点为24小时；然而，该终点可根据各实验室的具体需要进行延长。调整实验终点可使细胞继续培养，以便后续使用。此外，本方案具有灵活性，可用于检测药理学调节剂以及细胞外基质底物对细胞迁移的影响。最后，该方法中最昂贵的部分是成像软件的使用，尽管这类软件可能是需授权许可的软件，但使用授权软件并非唯一选择。其他能够生成线条并叠加图像的成像软件也可用于此方法。除了该方法本身具备的成本效益和可适应性外，它还通过引入划痕面积作为考量因素，为研究细胞迁移提供了一种全新的途径。

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讨论

这种新的划痕迁移实验方法为研究人员提供了一种更便捷的手段来检测细胞迁移的变化。尽管该实验在制造划痕的操作步骤上与其他划痕实验相同，但它在细胞迁移的成像和精确分析方面提供了一种新方法¹⁰。该方法无需依赖设备要求较高的延时显微镜和活细胞成像培养装置，而是详细描述了如何使用实验室中常见的设备。利用普通的倒置显微镜和相机，可以在保持一致培养条件的同时，在相同时间点获取迁移图像。此外，该方法能够在不使用高端设备的情况下，精确地对同一目标区域进行成像。重复捕获相同的迁移区域将减少细胞迁移测定中的不一致性，从而提供更严谨、更准确的细胞迁移测量结果。最后，该方法还考虑了划痕面积的影响。尽管操作中已尽量减少人为造成的划痕差异，但仍可能存在不一致情况，因此在细胞迁移分析中使用面积作为归一化因子显得尤为重要。总体而言，上述方案为一种广泛用于评估细胞迁移的强大工具提供了新的改进方法。

开发一种可调节的迁移实验方法为研究提供了新的途径。本文介绍的迁移实验可根据特定的研究问题进行修改。可通过激活或抑制特定目标蛋白对实验进行调整。在迁移实验之前、期间甚至之后，均可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Adobe 所有应用程序	Adobe		包括本方案所用的图像处理软件 Adobe Photoshop
Avant 200 µl 非无菌吸头	MIDSCI	AVR1	吸头经高压灭菌处理以达到无菌
AxioCam Erc 5s 相机	Zeiss	426540-9901-000
考马斯亮蓝 R-250	Fisher Scientific	BP101-25
Costar 平底细胞培养板，48 孔	Fisher Scientific	07-200-86
含 L-谷氨酰胺、1 g/L 葡萄糖和丙酮酸钠的 DMEM 培养基	Fisher Scientific	MT10014CM
Image J	NIH		这是美国政府提供的免费软件，为本方案所用的分析软件
多聚甲醛	Fisher Scientific	AC416785000
优质美国来源胎牛血清	Innovative Research	IFBS-HU
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	这是本方案中用于培养心肌成纤维细胞的抗菌剂
Zeiss Primovert 显微镜	Zeiss	491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 软件	Zeiss		软件随相机购买提供