通过模板匹配法对全二维气相色谱采集数据进行色谱指纹分析

摘要

本方案介绍了一种用于指纹识别和分析全二维气相色谱-质谱联用技术所采集的多维数据的方法。采用专门的模式识别算法（模板匹配）来解析特级初榨橄榄油挥发性组分（即挥发物组）中所蕴含的化学信息。

摘要

数据处理与评估是全二维气相色谱（GCxGC）的关键步骤，尤其是在联用质谱技术时。数据中蕴含的丰富信息可能极具价值，但往往难以高效获取。数据的高密度与复杂性可能导致漫长的分析时间，并需要繁琐且依赖分析人员经验的操作流程。因此，高效且易于使用的数据处理工具对于推动这一先进多维技术在实验室日常应用中的普及与接受至关重要。本研究所提出的数据分析方案采用色谱指纹识别与模板匹配方法，旨在将复杂的二维色谱图高度自动化地分解为独立的化学特征，从而实现对单个色谱图内以及多组色谱图之间信息性模式的深入识别。该方案具有高一致性与可靠性，所需人工干预极少。同时，分析人员可在多种设置下进行监督，并可自定义约束函数，以提供灵活性和适应不同需求与目标的能力。本文展示了模板匹配在特级初榨橄榄油挥发性成分组研究中的强大应用潜力。峰的交叉对齐不仅针对已知目标化合物，也涵盖非靶向化合物，显著增强了在广泛应用场景下的表征能力。文中还提供了示例，以证明该方法在相似条件下分析的样本组所产生的色谱模式分类与比较方面的性能表现。

引言

如今，全二维气相色谱结合飞行时间质谱检测（GC×GC-TOF MS）是用于复杂样品化学表征信息最丰富的分析方法^1,2,3,4,5。在GC×GC中，色谱柱以串联方式连接，并通过调制器（例如基于热或阀的聚焦接口）相连，该调制器在组分从第一维（¹D）色谱柱洗脱后将其捕获，再注入第二维（²D）色谱柱。此操作在固定的调制周期（P_M）内完成，通常为0.5–8秒。通过热调制，该过程包括对洗脱谱带进行低温捕集和聚焦，从而在整体分离能力方面带来一定优势。

尽管二维气相色谱（GC×GC）是一种二维分离技术，但该过程产生的是连续的数据值。检测器的模数转换器（A/D）以特定频率采集色谱信号输出，随后数据被存储在特定的专有格式中，这些格式不仅包含数字化的数据，还包括相关的元数据（即关于数据的信息）。GC×GC系统中使用的A/D转换器有助于将两个分析维度中随时间变化的色谱信号强度映射为数字值（DN）。单通道检测器（例如火焰离子化检测器（FID）、电子捕获检测器（ECD）、硫化学发光检测器（SCD）等）在每次采样时间产生单个数值，而多通道检测器（例如质谱检测器（MS））则在每次采样时间沿分析过程产生多个数值（通常为一个光谱范围内的数值）。

可视化 ²D数据的处理始于将单个调制周期（或循环）的数据值栅格化为一列像素（对应于探测器事件的图像元素）。沿纵坐标（Y轴，从下到上） ²D 分离时间被可视化。像素列被依次处理，因此横坐标（X 轴，从左到右）表示 ¹D 分离时间。此顺序呈现了 ²D数据在右手笛卡尔坐标系中，其中 ¹将 D 的保留序数作为数组的第一个索引。

数据处理 ²D色谱图相较于原始数据能够提供更高层次的信息，从而实现 ²D峰检测、峰鉴定、定量分析响应数据提取及交叉比较分析

这些²D峰图谱可被视为样品的独特“指纹”，而检测到的化合物则作为细节特征，用于有效的交叉比较分析。这种方法被称为基于模板的指纹识别技术^6,7，其灵感来源于生物特征指纹识别⁶。事实上，自动生物特征指纹验证系统依赖于指尖的独特特征：即从油墨印迹或高分辨率图像中定位并提取的脊线分叉点和终止点。这些被称为细节特征的结构随后会与数据库中已有的模板进行交叉比对^8,9。

如上所述，每个二维气相色谱（GC×GC）分离图谱均由在二维平面上合理分布的²D峰组成。每个峰对应一种单一分析物，具有其信息价值，并可作为单一特征用于图谱比较分析。

本文介绍了一种采用串联电离技术的全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC-TOF MS）化学指纹图谱分析的有效方法。该方法旨在对一系列色谱图中的特征峰进行全面且定量的编目。

与现有的商业软件或内部自研程序相比^10,11 采用峰值特征方法，基于模板的指纹识别具有高特异性、高效率和较短的计算时间。此外，其内在的灵活性可实现细节点特征（即， ²严重错位的色谱图之间（如由不同仪器获得或在长时间跨度研究中获取的色谱图）的D峰^12,13,14.

简要描述了所提出方法的基本操作，以帮助读者更好地理解二维（²D）图谱复杂性及信息能力。随后，通过分析仪器输出的数据矩阵，进行化学成分鉴定，并在二维空间中定位已知的目标分析物。接着构建目标峰的模板，并将其应用于同一批次分析中获得的一系列色谱图。从重新对齐的目标峰图谱中提取与保留时间、质谱特征以及响应值（绝对和相对）相关的元数据，并利用这些数据揭示样本集合中的组成差异。

作为该流程中一个额外且独特的步骤，还会对预靶向色谱图进行非靶向与靶向联用（UT）指纹分析，以将指纹识别能力扩展至已知和未知的分析物。该过程生成一个UT模板，可用于真正全面的比较分析，并可实现高度自动化。

最后一步，该方法对使用高和低电子电离能量（70 和 12 eV）产生的两个平行检测器信号中的特征进行交叉对齐。

该方案具有较强的灵活性，可支持对单个色谱图或一组色谱图进行分析，并适用于不同的色谱条件和/或多种检测器。本方案中，采用一套市售的GC×GC软件套件（见材料表），并结合质谱库及检索软件（见材料表）进行演示。部分必要工具也可在其他软件中获得，或可根据Reichenbach及其同事在文献中描述的方法^{15,16,17,18,19}独立实现。演示所用的原始数据来源于作者实验室开展的一项关于特级初榨橄榄油（EVO油）的研究¹⁴。具体而言，采用顶空固相微萃取（HS-SPME）采集意大利EVO油中的挥发性组分（即挥发组分），并通过GC×GC-TOF MS进行分析，以获取可用于样品品质和感官特性鉴定的特征指纹图谱。有关样品、采样条件及分析设置的详细信息见材料表。

步骤1–6描述色谱图的预处理。步骤7–9描述单个色谱图的处理与分析。步骤10–12描述模板的创建与匹配，这是跨样本分析的基础。步骤13–16描述将该方案应用于一组色谱图的过程，其中步骤14–16用于UT分析。

方案

1. 导入原始数据

注意：这将创建一个二维光栅数组，用于可视化和处理。

1. 启动图像软件。
2. 选择 文件 | 导入；浏览并选择由 GC×GC-TOF MS 系统获取的名为“VIOLIN 101.lsc”的原始数据文件（补充文件 1）；然后点击 打开。色谱图将在该软件中打开。
   注意：原始数据文件格式取决于仪器制造商。该软件可导入用户指南中列出的多种文件格式。
3. 在 导入 对话框中，将 调制周期（P_M） 设置为 3.5 秒；然后点击 确定。
   注意：某些采集软件可能未记录调制周期。
4. 选择 文件 | 另存为图像；导航至目标文件夹；输入名称“Oil 1 RAW.gci”（补充文件 2）；然后点击 保存。

2. 调制相位的调节

注意：这会将每个调制周期中的所有峰都置于同一图像列中，包括那些跨越调制周期末尾并进入下一个调制周期空闲时间的峰²⁰。

1. 选择“处理” | “相位偏移”。
2. 在 相位偏移 对话框中，将 偏移量 设置为 -0.8 s；然后，单击 确定。

3. 基线校正²¹

1. 选择 图形 | 绘制矩形。
2. 单击并拖动鼠标，在图像中无峰出现的区域绘制一个矩形。
3. 选择 工具 | 可视化数据；记录此处检测器信号的平均值和标准差，即 21.850 ± 1.455 标准差（无单位数字，DN）；然后关闭该工具。
4. 选择 处理 | 校正基线。

4. 使用数值图和颜色图对色谱图像进行着色²⁰

1. 选择 查看 | 着色。
2. 在 着色 对话框中，选择 导入/导出 选项卡；选择作为补充材料提供的 #AAAA（补充文件 3）自定义颜色映射表；然后点击 导入。
3. 在 数值映射 控件中，将数值范围设置为最小值和最大值；然后点击 确定。

5. 分析物的²D峰（即斑点）检测¹⁸

1. 选择处理 | 检测斑点，使用默认设置；然后观察到一些峰被分割，并且存在虚假检测。
2. 选择配置 | 设置 | 斑点检测；将平滑度在第一维设置为0.1，在第二维设置为2.0，并将最小体积（即总和值的阈值）设置为1.00 E6；然后点击确定。
3. 使用新设置选择处理 | 检测斑点；然后观察改进效果。

6. ²D 峰值过滤

注意：此步骤可自动去除由于一维（¹D）方向上的柱状渗漏以及二维（²D）方向上的条带或尾迹所导致的无意义检测信号。

1. 选择 处理 | 交互式斑点检测。
2. 注意斑点检测设置；然后点击 检测。
3. 在 高级筛选器 构建界面中，点击 添加；然后在 新建约束条件 对话框中选择 Retention II；接着点击 确定。
4. 在 约束条件 滑块中，设置滤波器的最小和最大 ²D 保留时间，以减少假阳性峰的数量，同时不丢失真实峰。
5. 点击 应用；然后点击 是，将新滤波器保存至检测设置中。
   注：针对某些特定检测问题（如离子峰检测或共洗脱峰的去卷积），可能需要使用更高级的工具¹⁹。

7. 线性保留指数校准

注意：执行此步骤²² (I^T) 用于一组保留指数（RI）标准品的特定保留时间 n-烷烃

1. 选择 配置 | RI 表 | 保留指数（第 I 列）。
2. 在 RI 表配置 对话框中，点击 导入；然后选择保留指数校准文件（CSV 格式，包含名称、保留时间和保留指数），文件名为“LRI table.csv” – （补充文件 4）。
3. 选择 文件 | 保存图像 A。浏览至目标文件夹；输入名称“Oil 1 LRI CALIBRATED.gci”（补充文件 5）；然后点击 保存。

8. 在 NIST17 质谱库中搜索峰谱²³

1. 选择 配置 | 设置 | 搜索谱库。
2. 在 搜索谱库 对话框中，将 谱图类型 设为 Peak MS，强度阈值 设为 100，NIST 搜索类型 设为 简单（相似度），NIST RI 列类型 设为 标准极性，NIST RI 容差 设为 10；然后点击 确定。NIST MS 搜索提供许多其他设置，此处均采用默认值。
3. 选择 处理 | 为所有斑点搜索谱库。

9. 审查并校正分析物鉴定结果

1. 在工具面板中，将光标模式设置为 斑点 | 选择斑点。
2. 在 图像 视图中，右键单击目标峰。
3. 在 斑点属性 对话框中，检查斑点属性；然后点击 匹配列表。
4. 查看匹配列表；若鉴定结果有误，选择正确鉴定结果旁的对勾标记。
5. 在 斑点属性 对话框中，输入 组名称 以指定化学类别及其他所需元数据；然后点击 确定。
6. 选择 文件 | 另存为图像；导航至目标文件夹；输入文件名“Oil 1 COLORIZED for Template construction.gci”（补充文件 6）；然后点击 保存。
   注：该文件包含在补充文件压缩包中，可用于步骤 10 的操作。

10. 创建具有目标峰的模板¹⁵

1. 在图像视图中（仍处于步骤 9.1 的选择斑点模式），单击第一个峰，然后按住CTRL + 单击选择其他需要的峰。
2. 在工具面板上，单击添加到模板按钮。
3. 当模板完成后，选择文件 | 保存模板；指定文件夹和文件名；然后单击保存。
4. 选择文件 | 关闭图像。
   注意：此时，这些操作说明将继续使用已创建的包含目标峰的模板，该模板可作为“Targeted tamplate.bt”获取（补充文件 7）。

11. 匹配并应用模板

注意：匹配功能可在新色谱图中检测到的峰内识别出模板模式。应用匹配可将模板中的鉴定结果及其他元数据传递至新色谱图中。

1. 选择 文件 | 打开图像；浏览并选择“Oil 2 COLORIZED.gci”（补充文件 8）色谱图文件（该文件已预处理）；然后点击 打开。
2. 在工具面板上，将光标模式设置为 模板 | 选择对象。
3. 选择 模板 | 加载模板。
4. 在 加载模板 对话框中，点击 浏览；浏览并选择目标峰模板“Targeted template.bt”（补充文件 7）；然后点击 打开。
5. 在 加载模板 对话框中，点击 加载，然后点击 关闭。
6. 在图像视图中，右键单击一个模板峰；然后检查其对象属性，包括 qCLIC 和参考质谱（MS）。
7. 选择 模板 | 交互式匹配并转换模板。
8. 在 交互式匹配 界面中，点击 全部匹配；然后在表格和图像中查看匹配结果，其中每个模板峰以空心圆圈标记，若成功匹配，则会通过连线连接至检测到的对应峰的实心圆圈。
9. 根据需要编辑匹配结果；确认无误后，点击 应用，将元数据从模板传输到色谱图。
   注意：匹配约束条件（如 qCLIC）有助于在新色谱图检测出的峰中识别正确的峰模式。约束参数包括用作模板参考的质谱特征类型（峰 MS 或 斑点 MS）以及谱图相似性阈值（直接匹配因子（DMF）和反向匹配因子（RMF））。此处参数设置基于先前研究^13,14，以减少假阴性匹配：采用 峰 MS，DMF 和 RMF 相似性阈值为 700。

12. 将模板转化为差异显著的色谱方法

注意：除非色谱条件发生显著变化，导致模板与新的色谱图无法对齐（例如长期研究过程中或安装新色谱柱后可能出现的情况），否则此步骤并非必需。在此类情况下，可在色谱保留时间平面上对模板进行几何变换，以更好地匹配新的色谱图^12,13。在本示例中，模板与色谱图的峰型模式相似，但在保留时间的几何分布上存在差异，这通常在不同色谱条件下会出现。

1. 重复步骤 11.2–11.5，但需导航至并选择加载Targeted template 2.bt（补充文件 9）。
2. 选择模板 | 交互式匹配模板；然后点击编辑变换。
3. 在变换模板界面中，调整¹D 和 ²D 尺度、平移和剪切参数，以更好地将模板与检测到的峰对齐；然后点击变换模板。
4. 使用变换后的模板，点击编辑匹配；然后重复步骤 11.8–11.9。

13. 在一组色谱图上进行非靶向与靶向联合分析

注意：将一种联合的非靶向与靶向（UT）模板（也称为特征模板^24,25）与一组色谱图逐一匹配，可建立非靶向与靶向分析物之间的对应关系，进而提取出一致的跨样本特征用于模式识别。

1. 对所有样品中的色谱图（即油样的²D色谱图）执行预处理（步骤1–6）和UT模板匹配（步骤11.1–11.9）。或者，可使用项目软件或类似软件自动完成此步骤，此处不作详述。
2. 启动Investigator软件。
3. 选择 文件 | 打开分析，然后选择并打开“Feature Jove su 70 eV.gca”（补充文件10）。
4. 点击 确定 以打开并查看结果。
5. 点击 化合物 选项卡，查看特定分析物（即具有相关化学名称的目标分析物）或非目标分析物（带有(#)标识符并在所有色谱图中对齐）的度量值和统计信息，然后执行以下步骤：
   1. 点击 属性 选项卡，查看跨色谱图的特定指标的数值和统计结果。
   2. 点击 汇总 选项卡，查看化合物和特征的汇总统计信息。如果色谱图来自不同类别（如此处所示，为来自意大利两个不同地区收获的橄榄所制取的油样），则 汇总 选项卡将列出Fisher比率统计量（F值和FDR），以提供可用于区分类别的特征信息。
   3. 在各个选项卡中查看多种图表，并可根据需要在 属性 选项卡中执行主成分分析（PCA）。

14. 为平行质谱分析修改UT模板

注意：分析同时采用 70 eV 和 12 eV（即高和低）的电子电离能量进行^26,27。

1. 打开一个12 eV的色谱图文件，例如“Oil 1 12 eV RAW.gci”（补充文件11），执行预处理步骤（步骤1–6），并按照步骤11.1–11.6所述加载UT模板“UT template 70 relaxed.bt”（补充文件12）。相关文件作为补充材料提供。
2. 如有必要，按照步骤12所述调整模板以匹配检测到的12 eV峰。此处不存在显著的峰错位，因为串联信号是多路复用的。但需注意，由于不同的电离条件会产生不同的碎片模式，因此有必要放宽针对DMF和RMF谱图相似性的qCLIC约束条件（本示例中未演示此操作）。
3. 选择 文件 | 保存模板；指定保存路径和文件名，例如“UT template 12.bt”（补充文件13）；然后点击 保存。

15. 对12 eV色谱图进行非靶向与靶向联合分析

1. 选择 文件 | 打开分析，然后选择并打开提供的“Feature Jove su 12 eV.gca” - 补充文件 14。
2. 点击 确定 以打开并查看结果。
3. 点击 化合物 选项卡，以查看各项指标值，参考针对特定分析物（即具有相关化学名称的目标分析物）或带有(#)标识符的非目标分析物在12 eV下的响应值和统计结果（这些标识符在所有色谱图中对齐），然后执行以下步骤：
   1. 点击 属性 选项卡，以查看跨色谱图的特定指标的数值和统计结果。
   2. 点击 摘要 选项卡，以查看在12 eV下化合物和特征的汇总统计信息。如果色谱图来自不同类别（例如本例中来自意大利两个不同地区收获的橄榄所制取的油），则摘要选项卡将列出Fisher比率统计值（F值和FDR），这些值有助于识别可用于区分类别的特征。
   3. 查看各个选项卡上提供的多种图表，并可根据需要在 属性 选项卡上执行 主成分分析 (PCA)。

结果

高品质特级初榨橄榄油挥发性成分的GC×GC-TOF MS图谱在信噪比（SNR）阈值为100以上时，显示出约500个²D峰。该阈值由先前关于食品挥发性物质的研究^14,27定义为进行交叉比较分析时获得可靠谱图所需的最低相对信号强度。各组分在二维色谱空间中的分布取决于其在两个色谱维度中的相对保留特性，具体而言，由其在¹D中的挥发性/极性和在²D中的挥发性决定。本实验采用的色谱柱组合为极性×弱极性（即Carbowax 20M × OV1701）。

该 ²D 型式样显示出高度有序性。同源系列和类别的相对保留型式样如图所示。 图1A 标注（基团用图形表示，峰用气泡表示）：直链饱和烃（黑色）、不饱和烃（黄色）、直链饱和醛（蓝色）、单不饱和醛（红色）、多不饱和醛（橙红色）、伯醇（绿色）和短链脂肪酸（青色）。

检测到 ²D峰可通过比较从整个样品中提取的平均质谱图来鉴定 ²D峰（斑点 光谱）或从最大光谱（顶端 光谱。 图2 展示输出结果 顶端 对第5个斑点进行谱图搜索，并返回高相似性匹配结果（前10个匹配项） (E)-2-己烯醛。所探索的数据库为分析人员在方法步骤8中预先选定的数据库。

通过活性保留指数对鉴定结果进行验证。该实验 我^T 值是为该 ²D峰，因此在此阶段，文库搜索会优先筛选出具有连贯的列表值的结果 我^T. 可根据分析人员经验、依据固定相的不同对参考数据库数值的可靠性评估以及所采用的分析条件，自定义容差窗口。无需通过实验校准即可智能校准线性保留指数的新工具 n-烷烃，最近在Reichenbach等人的一项研究中被开发并讨论¹⁹.

已鉴定的二维（²D）峰（即靶向峰）集合可用于构建靶向峰模板，以快速建立所有样品色谱图中同一化合物之间的可靠对应关系。靶向峰模板的集合如图1B所示。红色圆圈代表196种靶向化合物，其中包括两种与模板峰通过连接线关联的内标物（IS）。内标物用于响应信号的归一化，连接线有助于直观显示所包含的哪种内标物将用于归一化各个二维（²D）峰/斑点的响应信号。

在图1B中，实心圆圈表示模板峰与实际图谱之间的正匹配，空心圆圈则表示未验证到对应关系的模板峰。通过合理选择阈值参数、参考谱图和约束函数，可将假阴性匹配限制在较低水平^13,14,18,19。对于存在多个共洗脱的复杂图谱，建议采用基于谱图解卷积的离子峰检测函数，这是一种有效的选择方案¹⁹。图1B的放大面板中展示了(E)-2-己烯醛的模板峰元数据。

模板匹配的特异性依赖于应用约束函数的可能性，这些函数将阳性匹配限制在算法搜索窗口内、且质谱相似性高于某一阈值的候选峰上。在此情况下，步骤11中的相似性阈值²³根据先前旨在确定最佳参数以减少假阴性匹配的实验结果被设定为700¹⁴。图1B中模板峰属性的高亮区域显示了参考质谱字符串以及qCLIC约束函数的信息，即（Match("

将模板应用于一组色谱图时，可能会遇到一些具有挑战性的情况，例如图谱部分错位。这可能是由于色谱柱温箱温度不一致、载气流速/压力不稳定，或由于对系统进行了人工干预，例如更换色谱柱或调制器环形毛细管^14,28所致。图3展示了一种目标模板与实际色谱图之间部分错位的情况。对于轻微的错位，可通过交互式模板变换（图3，控制面板）重新定位模板峰，以实现更好的匹配。重新定位后，即可进行模板匹配以建立对应关系。在本示例中，模板（图3，步骤12）的峰与实际的²D图谱正确对应。对于严重错位的情况（本文未详细讨论），可通过重复执行匹配-变换-更新操作，迭代调整模板峰的位置，使其适应实际的峰图谱^12,13,14。

在此，目标峰（即已知的分析物）约占色谱结果的40%（平均在约500个可检测峰中包含196个目标峰）。其余60%的化合物及其所携带的信息在目标分析中未被考虑。为了使研究真正全面，还需建立对非目标²D峰的一致性交叉对齐。首次将模板匹配扩展至所有可检测分析物的应用涉及烘焙咖啡复杂的挥发物组⁷。该过程可通过软件（例如 Investigator）实现自动化，本方案中第14–15步即展示此过程。

在此过程中，使用属于研究样本集（20个样本）的预目标图像，通过比对所有图像图谱来确定可靠的峰²⁹。随后，构建一个复合色谱图，从中可在所谓的特征模板中识别出UT可靠峰及峰区域（即²D峰轮廓）¹⁷。

对于在70 eV条件下获得的分析，该过程共确定了144个具有较宽松可靠性的可靠峰²⁹，其中76个属于目标峰列表。基于这144个可靠峰，该过程将所有色谱图与可靠峰的平均保留时间进行一致对齐，然后将其合并以生成一张复合色谱图。图4展示了所有样本的列表，样本按油脂产地标注（左侧），以及每个样本中可靠峰或斑点体积的列表（右侧）。

非靶向特征模板由在复合色谱图中检测到的分析物的²D峰组成，如图5A所示，这些峰由可靠峰模板匹配（n = 168 — 红色圆圈表示靶向峰，绿色圆圈表示非靶向峰）。复合峰的质谱及其保留时间被记录在特征模板中，放大区域中展示了（Z）-3-己烯醇乙酸酯的示例。峰区域在图5B中以红色图形显示；它们由复合色谱图中检测到的所有²D峰的轮廓定义（n = 3578）。

当对20个分析样品中目标峰的分布应用基于主成分分析的无监督模式识别时，西西里和托斯卡纳橄榄油各自聚集成簇，表明土壤气候条件和风土特征影响挥发性成分的相对丰度。结果如图6A所示，基于可靠峰分布的主成分分析结果如图6B所示。这两种方法相互验证了来自不同地理区域的橄榄油具有不同但一致的化学特征，无论所检测的是目标化合物、非目标化合物，还是两者同时检测。

最后，该软件能够对并行检测通道中的谱图进行快速而有效的重新对齐。在此应用中，建议对串联电离信号进行重新对齐。质谱仪的离子源在两个电离能量（即 70 eV 和 12 eV）之间以每通道 50 Hz 的采集频率进行多路复用³⁰。所得到的两条色谱图谱高度对齐，同时光谱数据（即光谱特征和响应）提供了具有不同响应动态范围的互补信息^26,27。对齐后的谱图可用来提取特征（²D 峰和峰区域），并赋予唯一的标识符（即目标峰采用化合物化学名称，非目标峰和峰区域则采用唯一编号 #）。

模板匹配可实现有效的交叉对齐。在此情况下，错位程度较小，但必须放宽质谱（MS）约束条件，以允许对未指定碎片化能量（UT）峰进行匹配。另一方面，对于没有质谱约束的特征性UT峰区域，能够迅速完成匹配，且不会出现假阴性匹配。图5C展示了一个12 eV色谱图的放大区域，其中使用70 eV数据构建的特征模板实现了匹配。由于降低了qCLIC约束条件（例如，DMF阈值设为600），可靠的UT峰得以被正确定位匹配。需要注意的是，在12 eV条件下，由于低电离能导致的碎片化程度有限，检测到的峰数量较少。

图1：二维轮廓图与靶向模板。（A）来自意大利托斯卡纳的特级初榨橄榄油挥发性组分的轮廓图。同系物系列和化合物类别以不同颜色和线条标出：直链饱和烃（黑色线条及²D轮廓）、不饱和烃（黄色）、直链饱和醛（蓝色）、单不饱和醛（红色）、多不饱和醛（橙红色）、伯醇（绿色）以及短链脂肪酸（青色）。（B）已知分析物的靶向模板叠加图（红色圆圈），连接线表示内标物（ISs）。图中显示了²D峰/斑点属性元数据（癸醛）或模板峰属性。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：Apex MS 搜索结果。 针对 blob 5 的 Apex MS 搜索输出结果。列表显示了数据库中与之相似度最高的匹配条目及其在文库中可获取的相关元数据。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：模板重新比对。工作流程图，展示通过变换实现模板重新比对的各个步骤。请点击此处查看此图的放大版本。

图 4：GC Investigator 界面。 分析面板显示所有已选图像，并根据油脂的生产地区进行标注（左侧），以及各样品中可靠峰/斑点体积的列表（右侧）。请点击此处查看此图的放大版本。

图 5：靶向模板与UT模板。（A）步骤11中自动处理后得到的可靠峰；红色圆圈对应已知分析物，绿色圆圈为未知物。在叠加图中，显示了（Z）-3-己烯醛的模板对象属性。（B）放大区域，显示UT峰（红色和绿色圆圈）以及UT模板在70 eV电离能下采集的样品油谱图上匹配的峰区域（红色图形）。（C）UT模板在12 eV电离能下采集的样品油谱图上的匹配结果。请点击此处查看该图的放大版本。

图 6：主成分分析载荷图。它们展示了样本（来自托斯卡纳和西西里的橄榄油）的自然分布情况，分别基于（A）目标峰分布或（B）非目标峰分布的结果。请点击此处查看此图的放大版本。

补充文件。 请点击此处下载这些文件。

讨论

对全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC-TOF MS）数据的可视化是全面理解二维分离结果的基本步骤。通过自定义着色的图像图，分析人员能够直观识别检测器响应的差异，从而判断样品中各组分的分布差异。这种可视化方法彻底改变了分析人员对色谱图解读与处理的视角。色谱分析人员一旦理解并熟练掌握这一初步步骤，便为后续的数据处理开辟了全新的视角。

数据处理的另一个基本方面是能够访问所有样本点的完整数据矩阵（即质谱数据和响应值），每个样本点对应一次检测器事件。在这方面，²D 峰的积分至关重要，因为对应于单一分析物的检测器事件集合需要被准确识别。在本方案中，²D 峰的检测基于分水岭算法¹⁸，并包含一些改进以提高在部分共洗脱化合物情况下的检测灵敏度。为了使该过程更具特异性，必须进行解卷积，并采用更复杂的处理程序。这可以通过对质谱数据执行离子峰检测来实现；该算法处理数据阵列，并根据谱图特征分离出单一分析物的响应^19,31。

分析物鉴定是本实验方案以及任何全二维气相色谱-质谱（GC×GC-MS）数据分析过程中一个关键且至关重要的步骤。在缺乏使用真实标准品进行确证分析的情况下，第8和第9步所提出的鉴定程序必须由分析人员谨慎执行。目前所有商业软件均提供自动化分析功能，包括将质谱图谱特征与已收集的参考谱图（即谱图数据库）进行相似性比对，以及评估定性/定量离子之间的特征离子丰度比值。然而，为了准确区分异构体的鉴定结果，还需引入额外的确证判据。本方案建议采用线性保留指数对候选化合物列表进行排序；但该方法的局限性在于保留数据的可获得性及其一致性。

该方法的独特之处主要在于模板匹配^12,13,15,29。模板匹配能够以非常高效、特异且直观的方式实现²D模式识别。通过设置自定义的阈值和/或约束函数，可以调节其灵敏度和特异性，同时分析人员可通过主动调整变换函数参数来监督整个过程。该过程的独特性在于，能够在同一批次样品之间，甚至在采用相同名义条件采集但存在中度至严重错位的样品之间，实现目标峰与非目标峰信息的交叉对齐。该操作的优势在于能够保留所有目标分析物的鉴定结果——这对分析人员而言是一项耗时的工作，同时还能保留此前分析会话中为目标峰和非目标峰保存的全部元数据。

模板匹配在计算时间方面也具有很高的效率；低分辨率质谱数据文件包含约 1–2 GB 的压缩数据，而高分辨率质谱分析单次运行的数据量可能达到 10–15 GB。模板匹配并非每次均处理完整的数据矩阵，而是首先利用模板中的峰对色谱图进行保留时间对齐，然后在搜索窗口内对候选峰进行处理，以评估其与模板中参考峰的相似性匹配程度。在保留时间严重错位这一最具挑战性的情况下，全局二阶多项式变换方法的表现优于局部方法，同时还能减少计算时间¹³。

为了使二维气相色谱（GC×GC）技术在学术界和研究实验室之外得到广泛应用，数据处理工具必须能够方便地进行可视化和色谱图检查等基本操作；分析物的鉴定应支持采用标准化算法和流程（例如 NIST 搜索算法和 I^T 校准）；同时，交叉比较分析应具备直观性、高效性，并得到交互式工具的支持。本提出的方法在满足上述需求的同时，还提供了先进的选项和工具，可用于处理复杂情况，如分析物共洗脱、多分析物校准、族类分析以及并行检测信号对齐等。

相关文献已充分涵盖了许多应用场景，在这些场景中，二维气相色谱（GC×GC）以及更广义的全二维色谱技术能够提供独特的解决方案和可靠的结果，而这些是单次一维色谱（¹D-色谱）分析所无法实现的。^5,32,33 尽管GC×GC是提升分离能力和灵敏度的最强大工具，但其分离能力、灵敏度及其他系统性能始终存在一定的局限性。当接近这些系统极限时，数据分析将变得愈发困难。因此，必须持续开展研究与开发，以改进我们所拥有的分析工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1D SolGel-Wax色谱柱（100%聚乙二醇；30 m） × 0.25 mm dc × 0.25 μm df）。载气为氦气，恒定标称流速为1.3 mL/min。	Trajan SGE 分析科学公司，林伍德，澳大利亚	PN 054796	载气为氦气，恒定标称流速为1.3 mL/min。程序升温设置如下：40°C（2 分钟）至 240°C（10 分钟）于 3.5°℃/min
2D OV1701 色谱柱（86% 聚二甲基硅氧烷，7% 苯基，7% 氰丙基；1 m） × 0.1 mm dc × 0.10 μm df) 来自于。	梅加，莱尼亚诺，米兰，意大利	PN MEGA-1701
用于样品前处理的自动化系统：GC用SPR自动进样器	SepSolve-Analytical，英国兰特里桑特
特级初榨橄榄油：意大利西西里和托斯卡纳	项目VIOLIN（Ager - 农业食品研究网络基金会）		样品（n=10）于2018年生产年度内采集 "小提琴" 项目采样活动。根据Stilo等人先前研究中已验证的参考方案14，对油样采用顶空固相微萃取（HS-SPME）方法采集挥发性成分。
气相色谱仪：7890B 型 GC	美国特拉华州威尔明顿安捷伦科技公司
GC 图像 GC×GC 版本 2.9	GC Image LLC，美国内布拉斯加州林肯市		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
图像处理软件	GC Image LLC，美国内布拉斯加州林肯市		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
质谱仪：BenchTOF-Select	英国兰特里桑特 Markes International
Methyl-2-octynoate（CAS 111-12-6）	默克-密理博/苏佩尔科	PN: 68982
调节器控制器：Optimode v2.0	SRA Intruments，切尔努斯科-苏尔-纳维利奥，米兰，意大利
调节器：KT 2004 环型	Zoex Corporation 休斯顿，德克萨斯州，美国
质谱图库与检索软件：NIST 图库 V 2017，软件 V 2.3	美国国家标准与技术研究院（NIST），马里兰州盖瑟斯堡		https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17
n-烷烃 C8-C40，用于保留指数定标	默克-密理博/苏佩尔科	PN: 40147-U
n正己烷（CAS 110-54-3）气相色谱-质谱分析 SupraSolv	默克-密理博/苏佩尔科	PN：100795
固相微萃取纤维	默克-密理博/苏佩尔科	PN 57914-U
α- /β-侧柏酮（CAS 546-80-5）	默克-密理博/西格玛奥德里奇	PN: 04314