使用振动轨道转子建立诱导年轻野生型小鼠认知功能障碍和类焦虑行为的慢性睡眠片段化模型

摘要

本文介绍了一种通过电控轨道式旋转装置建立的慢性睡眠片段化（CSF）模型，该模型可诱导年轻野生型小鼠出现明确的认知功能障碍和类似焦虑的行为。该模型可用于探索慢性睡眠障碍及其相关疾病的发生机制。

摘要

睡眠障碍在人群中普遍存在，可表现为慢性疾病或主诉事件。慢性睡眠障碍被认为与多种疾病的发病机制密切相关，尤其是神经退行性疾病。我们近期发现，在年轻野生型小鼠中持续2个月的睡眠片段化可引发类似阿尔茨海默病（AD）的行为学和病理学改变。本文中，我们提供了一种实现慢性睡眠片段化（CSF）的标准化方案。简言之，CSF通过轨道摇床以110 rpm的转速振动实现，运行周期为重复的“开启10秒、关闭110秒”模式，在光照期（上午8:00至晚上8:00）连续进行，最长可达2个月。通过莫里斯水迷宫（MWM）、新物体识别（NOR）、旷场实验（OFT）和强迫游泳实验（FST）评估CSF建模后小鼠的空间学习与记忆能力损害，以及类焦虑但非类抑郁行为。与其他睡眠干预方法相比，该方案显著减少了人工操作负担，并提高了建模效率。该方法可在年轻野生型小鼠中产生稳定表型，具有广泛的研究应用潜力。

引言

睡眠障碍在患有睡眠干扰性疾病的患者以及因睡眠干扰性事件而受影响的健康人群中日益普遍。已有观察表明， 患有神经退行性疾病、慢性疼痛、情绪压力、呼吸系统疾病、泌尿系统疾病等的患者通常会抱怨睡眠体验不佳^1,2,3,4,5。阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）、睡眠中周期性肢体运动（PLMS）、睡眠维持性失眠等多种睡眠障碍是最常见的导致睡眠片段化的病因^6,7。在发达国家，OSA在成年人群中的患病率为5%至9%以上，在儿童人群中的患病率为2%^8,9,10。与此同时，由于智能手机过度使用、睡眠习惯不规律、令人烦躁的噪音以及工作职责（例如照护人员的夜班）等因素，经历睡眠障碍的健康人群比例也在不断上升。目前公认睡眠对大脑代谢废物清除^11,

方案

本方案已获得华中科技大学同济医学院同济医院机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 实验小鼠的筛选与准备

1. 选择野生型成年（8–10 周龄）雄性小鼠，体重为 20–28 g，用于整个实验。
   注：野生型 C57BL/6 小鼠购自中国湖北实验动物研究中心，湖北。
2. 将所有小鼠随机分配至脑脊液（CSF）组和对照组。每笼饲养 3–5 只小鼠，以避免社会隔离应激。对照组笼内小鼠数量需与配对的 CSF 组笼内小鼠数量一致。
   注：同一组内笼中的小鼠将合并用于后续行为学实验。
3. 将对照组笼子置于与 CSF 组相同的房间内，以保持周围环境和操作人员影响的一致性。
4. 使用耳标在每组小鼠耳朵上编号并标记，以便监测。
5. 维持环境温度在 21–23 °C，湿度在 35%–60 % 之间。
6. 维持 12 小时光照-黑暗循环（光照开启：上午 8:00 至晚上 8:00，光照关闭：晚上 8:00 至次日上午 8:00），以避免对小鼠正常睡眠节律产生干扰。
7. 研究人员在建模房间内时，应尽量减少噪音和干扰。
8. 为小鼠提供充足的食物和饮水。使用带有球阀尖端的长喷嘴水瓶，以防止平台运动时漏水。用水瓶顶部的弹簧固定水瓶，防止旋转过程中水瓶移位。

2. 准备并设置轨道转子

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结果

所有代表性结果和图示均引自我们近期的出版物²¹。原期刊已授权允许重复使用这些图示。

整个实验设计按时间顺序展示，表明了脑脊液（CSF）建模以及MWM、NOR、OFT和FST行为学测试的时间安排（图1A）。我们每周记录CSF组和对照组小鼠的体重，以监测建模期间小鼠的一般状况。在建模期间，两组小鼠的体重增长未见明显差异（图1B）。

为评估脑脊液（CSF）对空间学习和记忆能力的影响，我们进行了莫里斯水迷宫（MWM）行为学实验。^43,44. 与对照组相比，脑脊液组在5天训练期间表现出更差的寻找平台的逃避能力（图2A）。在探针试验中，CSF小鼠在目标象限停留的时间比例显著减少，且穿越原平台位置的次.......

讨论

当前方案的关键步骤包括根据研究目的，使用优化参数设置睡眠片段化设备，并在整个建模过程中为小鼠维持舒适、安静的生活环境。此外，确定适当的时机中断或停止睡眠片段化处理，并为这些小鼠安排行为学测试也至关重要。与其他睡眠干预模型类似，该方案应在专用房间内进行，严格控制光照周期，并排除所有可能的非必要干扰。研究人员在检查、补充食物和饮水、更换垫料等操作时，应尽量避免产生噪音，并缩短操作时间。在极少数情况下，会出现攻击同笼小鼠的个体，尤其是在不适的睡眠干扰初期。一旦发现攻击者，应将其从原代笼具及实验分组中移除。根据我们的经验，除少数个体外，大多数实验动物能够适应处理，并按需获取食物和饮水。存在内在问题的小鼠，例如牙齿畸形、体重过轻或皮肤损伤，可能导致体重下降或体质虚弱，应避免用于建模。由于本方案可能引发慢性应激和代谢紊乱，因此必须采用统一标准（如体重）筛选的小鼠进行建模和实验。

在所述方案中，轨道转子将在每天上午8:00至晚上8:00（光照期）自动启动，此时间段是小鼠日常活动最频繁的时期。在光照期内，转子以10秒开启、110秒关闭的重复循环模式运行，以诱导频繁觉醒。不同的建模持续时间将导致不同.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Any-maze 行为追踪系统	Stoelting,Inc,USA	-	一种用于记录小鼠行为轨迹的视频追踪系统。
C57BL/6J 小鼠	湖北省实验动物研究中心，中国湖北	-	购自湖北省实验动物研究中心的健康雄性 C57BL/6J 小鼠，年龄为 10–12 周。
Graphpad Prism 6.0 软件	Graphpad Software,Inc.USA	-	使用 Graphpad Prism 6.0 软件绘制统计图表。
Morris 水迷宫系统	上海欣软信息科技有限公司，中国	XR-XM101	该系统用于进行 Morris 水迷宫实验。
轨道式转子	上海市平实验室设备有限公司，中国	SPH-331	该轨道式转子用于建立慢性睡眠片段化模型。
固态定时器	OMRON Corporation, Kyoto, Japan	H3CR-F8-300	固态定时器用于控制转子运行的频率和时间。
木质无光泽水箱	-	-	长 30 cm，宽 28 cm，高 35 cm。该水箱用于进行旷场实验和新物体识别实验。