使用振动轨道转子建立诱导年轻野生型小鼠认知功能障碍和类焦虑行为的慢性睡眠片段化模型

摘要

本文介绍了一种通过电控轨道式旋转装置建立的慢性睡眠片段化（CSF）模型，该模型可诱导年轻野生型小鼠出现明确的认知功能障碍和类似焦虑的行为。该模型可用于探索慢性睡眠障碍及其相关疾病的发生机制。

摘要

睡眠障碍在人群中普遍存在，可表现为慢性疾病或主诉事件。慢性睡眠障碍被认为与多种疾病的发病机制密切相关，尤其是神经退行性疾病。我们近期发现，在年轻野生型小鼠中持续2个月的睡眠片段化可引发类似阿尔茨海默病（AD）的行为学和病理学改变。本文中，我们提供了一种实现慢性睡眠片段化（CSF）的标准化方案。简言之，CSF通过轨道摇床以110 rpm的转速振动实现，运行周期为重复的“开启10秒、关闭110秒”模式，在光照期（上午8:00至晚上8:00）连续进行，最长可达2个月。通过莫里斯水迷宫（MWM）、新物体识别（NOR）、旷场实验（OFT）和强迫游泳实验（FST）评估CSF建模后小鼠的空间学习与记忆能力损害，以及类焦虑但非类抑郁行为。与其他睡眠干预方法相比，该方案显著减少了人工操作负担，并提高了建模效率。该方法可在年轻野生型小鼠中产生稳定表型，具有广泛的研究应用潜力。

引言

睡眠障碍在患有睡眠干扰性疾病的患者以及因睡眠干扰性事件而受影响的健康人群中日益普遍。已有观察表明， 患有神经退行性疾病、慢性疼痛、情绪压力、呼吸系统疾病、泌尿系统疾病等的患者通常会抱怨睡眠体验不佳^1,2,3,4,5。阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）、睡眠中周期性肢体运动（PLMS）、睡眠维持性失眠等多种睡眠障碍是最常见的导致睡眠片段化的病因^6,7。在发达国家，OSA在成年人群中的患病率为5%至9%以上，在儿童人群中的患病率为2%^8,9,10。与此同时，由于智能手机过度使用、睡眠习惯不规律、令人烦躁的噪音以及工作职责（例如照护人员的夜班）等因素，经历睡眠障碍的健康人群比例也在不断上升。目前公认睡眠对大脑代谢废物清除^11,12、记忆巩固^13,14、代谢平衡^15,16等多种生理过程具有重要作用。然而，长期睡眠障碍是否会导致健康人体内不可逆的病理改变，以及其是否为中枢神经系统疾病（如数年后发生的神经退行性疾病）的病因或促成因素，目前仍 largely 不明确。我们的目标是报道一种实验模型，该模型在对年轻野生型小鼠进行为期2个月的睡眠片段化处理后，可稳定且显著地诱导认知功能障碍和类焦虑行为。该模型将用于回答上述科学问题。

睡眠障碍被列为阿尔茨海默病（AD）或痴呆症的潜在风险因素。Kang 等人首次发现并描述了6小时急性睡眠剥夺会加重 AD 的病理变化¹⁷。此后，许多其他研究报道，睡眠剥夺或睡眠碎片化可加剧转基因 AD 小鼠模型中的发病过程^18,19,20。然而，极少有研究人员研究睡眠障碍对年轻野生型小鼠的影响；即 睡眠障碍是否会导致年轻野生型小鼠出现类似 AD 的行为或病理改变。在我们最近发表的研究中，我们报道了在2–3月龄的野生型小鼠中，持续2个月的睡眠碎片化诱导出明显的空间记忆缺陷和类似焦虑的行为，并且在皮层和海马中均观察到细胞内淀粉样蛋白-β（Aβ）的积累增加²¹。我们还观察到早期内体-自噬体-溶酶体通路标志物的表达水平发生改变以及小胶质细胞的活化，这些变化与 APP/PS1 小鼠中报道的病理改变相似^21,22。

本研究所采用的睡眠片段化（SF）方案由 Sinton 等人²³ 验证，并经 Li 等人²⁴ 修改。简言之，在光照开启期（上午 8:00–晚上 8:00），以每分钟 110 转的轨道摇床每 2 分钟振动 10 秒，以干扰睡眠。该模型的睡眠结构改变此前已通过脑电生理睡眠记录进行表征，并由 Li 等人²⁴ 报道，结果显示在光照开启期间，觉醒时间显著增加，快速眼动（REM）睡眠减少，而在建模超过 4 周后，24 小时内的总睡眠和觉醒时间未受影响²⁴。目前，全睡眠剥夺和部分睡眠剥夺是最常用的睡眠干预模型。全睡眠剥夺通常通过持续轻柔操作、使动物接触新奇物体，或通过持续旋转横杆或跑步机来实现^{25,26,27,28,29}。由于伦理原因，全睡眠剥夺通常持续时间短于 24 小时。最常用的部分睡眠剥夺模型是水平台法，该方法主要消除 REM 睡眠^30,31,32。其他方法利用跑步机或横杆在笼底周期性扫动，当以固定时间间隔启动时可诱导睡眠片段化^{33,34,35,36,37,38}。值得注意的是，SF 会中断睡眠，并在所有睡眠阶段间歇性地引发觉醒²⁴。本研究应用轨道摇床建立的慢性睡眠片段化（CSF）模型的一个显著优势在于，该过程可由机器自动连续运行数月，除常规监测外无需每日频繁人工操作。此外，该装置可同时对多个小鼠笼进行均一干预建模。在整个建模过程中，小鼠始终饲养在原有笼具中，保留常规垫料和筑巢材料，而其他一些方法则需将动物暴露于多样化环境，不可避免地引入额外应激。

睡眠片段化既往通过睡眠干扰方法进行表征，该方法可模拟睡眠阶段频繁觉醒以及觉醒阶段显著的睡眠反弹。在一些文献中，CSF被视为阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）的动物模型^39,40。本研究选择每小时觉醒30次的频率，其依据来源于中重度睡眠呼吸暂停患者觉醒指数的临床观察。研究发现，持续4周的睡眠片段化显著延长了高碳酸血症诱导的觉醒潜伏期以及触觉觉醒阈值，且该表型在恢复睡眠后至少持续2周²⁴。该表型的机制被揭示为：在高碳酸血症刺激下，去甲肾上腺素能、食欲素能、组胺能和胆碱能的觉醒活跃神经元中c-fos激活减少，同时投射至扣带皮层的儿茶酚胺能和食欲素能纤维也减少²⁴。然而，必须指出的是，OSA最重要的特征是气道阻塞引起的低氧血症，进而导致睡眠中断^41,42。在OSA的发病机制中，睡眠紊乱与反复发生的低氧血症相互影响、相互促进。因此，仅通过睡眠片段化可能无法在小鼠中完全再现OSA的所有关键特征。

本文介绍了一种用于在年轻野生型小鼠中建立慢性睡眠片段化模型的标准实验方案。通过莫里斯水迷宫、新物体识别、开放旷场实验和强迫游泳实验，评估了慢性睡眠片段化处理后的小鼠认知功能障碍以及类似焦虑和类似抑郁的行为表现。需要特别指出的是，该模型应被视为一个整体，可产生睡眠节律紊乱、认知功能障碍及类似焦虑行为等表型。该模型潜在的应用范围包括但不限于以下方面：1）进一步研究无遗传易感性的年轻小鼠在慢性睡眠紊乱条件下所诱发的功能性或分子病理机制；2）鉴定由睡眠紊乱直接引发神经退行性变的通路；3）探索改善慢性睡眠紊乱所致表型的治疗策略；4）研究野生型小鼠在慢性睡眠紊乱下内在的保护性或代偿性机制；5）应用于睡眠-觉醒调控及状态转换机制的研究。

方案

本方案已获得华中科技大学同济医学院同济医院机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 实验小鼠的筛选与准备

1. 选择野生型成年（8–10 周龄）雄性小鼠，体重为 20–28 g，用于整个实验。
   注：野生型 C57BL/6 小鼠购自中国湖北实验动物研究中心，湖北。
2. 将所有小鼠随机分配至脑脊液（CSF）组和对照组。每笼饲养 3–5 只小鼠，以避免社会隔离应激。对照组笼内小鼠数量需与配对的 CSF 组笼内小鼠数量一致。
   注：同一组内笼中的小鼠将合并用于后续行为学实验。
3. 将对照组笼子置于与 CSF 组相同的房间内，以保持周围环境和操作人员影响的一致性。
4. 使用耳标在每组小鼠耳朵上编号并标记，以便监测。
5. 维持环境温度在 21–23 °C，湿度在 35%–60 % 之间。
6. 维持 12 小时光照-黑暗循环（光照开启：上午 8:00 至晚上 8:00，光照关闭：晚上 8:00 至次日上午 8:00），以避免对小鼠正常睡眠节律产生干扰。
7. 研究人员在建模房间内时，应尽量减少噪音和干扰。
8. 为小鼠提供充足的食物和饮水。使用带有球阀尖端的长喷嘴水瓶，以防止平台运动时漏水。用水瓶顶部的弹簧固定水瓶，防止旋转过程中水瓶移位。

2. 准备并设置轨道转子

1. 准备一个带扩大平台（67 cm × 110 cm）的电控轨道式转子，最多可放置10个笼子。
2. 在光照开启阶段（上午8:00至晚上8:00），通过程序定时器启动轨道转子，此阶段小鼠处于每日主要睡眠时段。
3. 使用固态定时器将轨道转子设置为110 rpm的转速，并以10秒开启、110秒关闭的循环模式重复运行。
   注意：平台的负载能力为50 kg。转子水平振动的固定振幅为2.5 cm。
4. 使用粗弹簧将CSF笼子固定在转子平台上方，以防止平台旋转时笼子发生移位。

3. 慢性睡眠片段化建模与监测

1. 将脑脊液（CSF）小鼠和对照小鼠的笼子置于建模室中，实验前适应环境一周。
2. 建模开始时，确保所有小鼠在轨道旋转期间均可自由获取食物和水。
3. 建模开始时，至少观察1小时，以确保轨道旋转器正常啮合运转。
4. 在建模期间，每2天检查一次轨道摇床是否正常运转，并观察小鼠状况，确保小鼠有充足的食物和水。每周更换一次笼具垫料。
5. 在建模期间，每周于上午8:00更换垫料时称量小鼠体重。将出现明显体重下降的小鼠剔除出建模。 同样来自实验组。
   注：显著体重减轻的定义为体重低于20 g并持续2周。
6. 在整个建模过程中，如有攻击者，应将其从笼中移除，并从实验组中剔除。
7. 建模结束后，继续在原饲养环境中维持并喂养小鼠。

4. 莫里斯水迷宫（MWM）实验

1. 测试前准备
   1. 准备一个装有温水（20–23 °C）的圆形水箱。
   2. 在水箱周围的帘幕上四个象限方向悬挂四个不同形状和颜色的标志，作为远视力参考。通过加入奶粉使水呈现不透明状态。
   3. 将平台置于西南象限的中央位置。
2. 训练测试
   1. 在为期5天的训练期内，每天上午8:00至中午12:00之间对小鼠进行连续四次试验。
   2. 在四次试验中，将每只小鼠从四个象限之一放入水中，使其面向水箱侧壁。每次试验中，允许小鼠游泳60秒以寻找平台。若小鼠在60秒内未能到达平台，则将其引导至平台并停留15秒。
   3. 使用视频追踪系统自动记录小鼠找到隐藏平台的逃避潜伏期。
3. 探测试验
   1. 在完成5天训练后的第六天进行探测试验。
   2. 移除平台，从东北象限将每只小鼠放入水中，允许其自由游泳60秒。
   3. 使用视频追踪系统自动记录小鼠的运动轨迹数据。

5. 新物体识别（NOR）实验

1. 熟悉阶段
   1. 将小鼠依次放入一个容器中（长 30 cm，宽 28 cm，高 35 cm），容器内放置两个相同的物体（A1 和 A2）。允许小鼠自由探索（每次试验 10 分钟）。
   2. 使用视频追踪系统自动记录小鼠的运动轨迹数据。
2. 测试阶段
   1. 在熟悉阶段结束后 1 小时进行测试试验。将容器中的一个原始物体替换为一个新物体（“新物体”），另一个物体保持不变。将小鼠重新放入容器中，允许其自由探索 5 分钟（每次试验）。
   2. 使用视频追踪系统自动记录每只小鼠探索每个物体所花费的时间。
      注：当小鼠鼻部朝向物体且距离小于 1 cm，并出现舔舐、嗅闻、啃咬或胡须运动时，即判定为对物体的探索行为。辨别指数（DI）按公式（TN − TF）/（TN + TF）计算，其中 TN 表示探索“新物体”的时间，TF 表示探索“熟悉物体”的时间。

6. 开放旷场实验（OFT）

1. 准备一个水箱装置（30 cm × 28 cm × 35 cm）。
2. 测试期间，将每只小鼠放置于水箱中央，使其自由探索 5 分钟。每次实验后用 75% 乙醇清洗水箱，以避免前一只小鼠遗留的行为影响。
3. 使用视频追踪系统自动记录小鼠的运动轨迹数据。

7. 强迫游泳实验（FST）

1. 准备一个开口的圆柱形容器装置，其中装有深度为 15 cm 的水（20–23 °C）。
2. 测试期间，将每只小鼠放入圆柱形容器中，使其停留 6 分钟。
3. 使用视频追踪系统自动记录每只小鼠在测试最后 4 分钟内的不动时间。
   注意：当小鼠停止挣扎并漂浮在水中，仅进行维持头部露出水面所必需的微小动作时，即判定为不动状态。

8. 数据分析

1. 使用统计分析软件（例如 GraphPad Prism 6.0）分析数据。
2. 所有数据均以均值 ± 标准误（SEM）表示。
3. 采用重复测量的双因素方差分析（two-way ANOVA）结合 Bonferroni 事后检验，比较两组在 MWM 实验中的逃避潜伏期。脑脊液组（CSF）与对照组之间的其他比较采用非配对 t 检验。
4. 若所有检验中 P < 0.05，则认为差异具有统计学意义。

结果

所有代表性结果和图示均引自我们近期的出版物²¹。原期刊已授权允许重复使用这些图示。

整个实验设计按时间顺序展示，表明了脑脊液（CSF）建模以及MWM、NOR、OFT和FST行为学测试的时间安排（图1A）。我们每周记录CSF组和对照组小鼠的体重，以监测建模期间小鼠的一般状况。在建模期间，两组小鼠的体重增长未见明显差异（图1B）。

为评估脑脊液（CSF）对空间学习和记忆能力的影响，我们进行了莫里斯水迷宫（MWM）行为实验。^43,44CSF组在5天训练期间寻找平台的逃避能力较对照组差图2A）。在探针试验中，CSF小鼠在目标象限停留的时间比例显著减少，且穿越先前平台位置的次数更少（

讨论

当前方案的关键步骤包括根据研究目的，使用优化参数设置睡眠片段化设备，并在整个建模过程中为小鼠维持舒适、安静的生活环境。此外，确定适当的时机中断或停止睡眠片段化处理，并为这些小鼠安排行为学测试也至关重要。与其他睡眠干预模型类似，该方案应在专用房间内进行，严格控制光照周期，并排除所有可能的非必要干扰。研究人员在检查、补充食物和饮水、更换垫料等操作时，应尽量避免产生噪音，并缩短操作时间。在极少数情况下，会出现攻击同笼小鼠的个体，尤其是在不适的睡眠干扰初期。一旦发现攻击者，应将其从原代笼具及实验分组中移除。根据我们的经验，除少数个体外，大多数实验动物能够适应处理，并按需获取食物和饮水。存在内在问题的小鼠，例如牙齿畸形、体重过轻或皮肤损伤，可能导致体重下降或体质虚弱，应避免用于建模。由于本方案可能引发慢性应激和代谢紊乱，因此必须采用统一标准（如体重）筛选的小鼠进行建模和实验。

在所述方案中，轨道转子将在每天上午8:00至晚上8:00（光照期）自动启动，此时间段是小鼠日常活动最频繁的时期。在光照期内，转子以10秒开启、110秒关闭的重复循环模式运行，以诱导频繁觉醒。不同的建模持续时间将导致不同...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Any-maze 行为追踪系统	Stoelting,Inc,USA	-	一种用于记录小鼠行为轨迹的视频追踪系统。
C57BL/6J 小鼠	湖北省实验动物研究中心，中国湖北	-	购自湖北省实验动物研究中心的健康雄性 C57BL/6J 小鼠，年龄为 10–12 周。
Graphpad Prism 6.0 软件	Graphpad Software,Inc.USA	-	使用 Graphpad Prism 6.0 软件绘制统计图表。
Morris 水迷宫系统	上海欣软信息科技有限公司，中国	XR-XM101	该系统用于进行 Morris 水迷宫实验。
轨道式转子	上海市平实验室设备有限公司，中国	SPH-331	该轨道式转子用于建立慢性睡眠片段化模型。
固态定时器	OMRON Corporation, Kyoto, Japan	H3CR-F8-300	固态定时器用于控制转子运行的频率和时间。
木质无光泽水箱	-	-	长 30 cm，宽 28 cm，高 35 cm。该水箱用于进行旷场实验和新物体识别实验。