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免疫球蛋白A肾病小鼠肾脏中微小RNA表达的检测

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DOI：

10.3791/61535

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2020年7月8日

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1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

本文内容

摘要

microRNA 参与了 IgA 肾病的发病机制。我们建立了一种可靠的方法，用于检测 IgA 肾病小鼠模型（HIGA 小鼠）肾脏中 microRNA 的表达水平。这一新方法将有助于验证 miRNA 在 IgA 肾病中的作用。

摘要

IgA 肾病是一种以 IgA 异常沉积为特征的原发性肾小球肾炎，可导致终末期肾功能衰竭。近年来，已有研究报道微小 RNA（miRNA）参与了 IgA 肾病的发病机制。然而，目前尚无利用小型动物模型对 IgA 肾病中 miRNA 进行谱型分析的成熟方法。因此，我们建立了一种可靠的分析 IgA 小鼠模型（HIGA 小鼠）肾脏中 miRNA 的方法。本实验方案的目标是检测 HIGA 小鼠肾脏中 miRNA 表达水平的变化，并与对照组小鼠肾脏中的表达水平进行比较。简而言之，该方法包括四个步骤：1）获取 HIGA 小鼠的肾脏样本；2）从肾脏样本中纯化总 RNA；3）以总 RNA 为模板合成互补 DNA；4）对 miRNA 进行定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）。利用该方法，我们成功检测了 HIGA 小鼠肾脏中多种 miRNA（miR-155-5p、miR-146a-5p 和 miR-21-5p）的表达水平。这一新方法可应用于其他针对 IgA 肾病中 miRNA 谱型分析的研究。

引言

免疫球蛋白A（IgA）肾病是一种原发性肾小球肾炎，其特征是IgA在肾小球系膜区异常沉积1,2。它是原发性肾小球肾炎中最常见的类型，可导致20%–40%的患者进展至终末期肾功能衰竭2。该病病因尚不明确，但持续性黏膜感染被认为与其发病相关1,3。糖皮质激素、免疫抑制剂以及肾素-血管紧张素系统抑制剂已被提出作为治疗手段1,3，但其疗效尚未完全确立3。因此，仍需进一步研究以明确IgA肾病的病因及有效的治疗方法。

microRNAs（miRNAs）是一类小分子非编码RNA，在基因表达调控中发挥重要作用4,5。已有研究表明，miRNAs参与多种疾病的发病机制，其中一些已被鉴定为疾病生物标志物或治疗靶点4,5。近年来，miRNAs与IgA肾病发病机制之间的关联也相继被报道2,6,7。例如，miR-148b被证实参与IgA肾病患者IgA结构异常的过程2,6,7，而miR-148b和let-7b则被记录为检测IgA肾病的新型生物标志物7。尽管深入了解miRNAs对IgA肾病的影响有助于进一步阐明其病因及治疗方法2，但目前尚未建立利用小型动物模型对IgA肾病中miRNAs进行谱型分析的标准方法2。

本文建立了一种简单且可靠的检测IgA肾病小鼠模型（HIGA小鼠）肾脏中miRNA表达水平的方法。HIGA小鼠是一种特征性的ddY品系，其血清IgA水平显著升高，并在肾小球中出现IgA的异常沉积8,9,10,11。因此，HIGA小鼠可作为IgA肾病的小鼠模型8,9,10,11。本方法包括四个主要步骤：首先，通过手术获取HIGA小鼠的肾脏样本；其次，将样本匀浆并利用基于硅胶膜的离心柱法提取总RNA；第三，通过逆转录反应由总RNA合成互补DNA（cDNA）；第四，采用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miRNA的表达水平。该方法的理论依据及结果的可靠性基于既往研究报道12,13。我们证明，该技术可用于在IgA肾病小鼠模型中准确测定miRNA的表达水平，并有望推动未来关于IgA肾病中miRNA的研究。

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方案

动物实验已获日本医科大学动物伦理委员会批准，并符合《日本医科大学实验动物使用与护理指南》中关于实验动物使用与护理的指导原则。

1. 获取HIGA小鼠的肾脏样本

注意：HIGA 小鼠在 25 周龄后表现出稳定的 IgA 肾病表型8,9,10,11。应选择 Balb/c 小鼠作为对照组8,9,10,11。获取 25 周龄的雌性 HIGA 小鼠（n = 10）和 25 周龄的雌性 Balb/c 小鼠（n = 10）。实验前需预先确定所需小鼠数量。此步骤针对 10 只 HIGA 小鼠和 10 只 Balb/c 小鼠的样本量，大约需要 7–8 小时。

  1. 准备以下物品：HIGA 小鼠（25 周龄，雌性）、Balb/c 小鼠（25 周龄，雌性）、吸入式麻醉装置、异氟烷、软木板、大头针、磷酸盐缓冲液（PBS）、注射器、针头、手术剪和镊子。
  2. 使用 4%–5% 异氟烷通过吸入式麻醉装置对 HIGA 小鼠进行麻醉，并用大头针将其固定于软木板上，呈仰卧位。诱导麻醉后，将异氟烷浓度调整至 2%–3% 作为维持剂量。
    注意：麻醉深度应维持在完全消除侵入性操作相关疼痛的水平。特别是在切除胸腔等组织时，异氟烷浓度应调整至 4–5%。脱毛和眼部软膏并非必需。若操作可快速完成，则无需将小鼠置于加热垫上。
  3. 用手术剪和镊子在小鼠腹壁做一条 3–4 cm 的正中切口，并仔细辨认双侧肾脏。
  4. 用手术剪和镊子切开肋骨和膈肌以暴露心脏。切开右心房后，从左心室注入 PBS，直至肾脏颜色变为淡黄色（此步骤表明小鼠全身已灌注 PBS）。
  5. 切断肾动脉、肾静脉和输尿管，取出肾脏。将肾脏切成每份 30 mg 的组织块，用于后续步骤。
    注意：IgA 肾病的病理变化主要累及肾皮质（肾脏外层）的肾小球。尽管在肉眼下难以完全区分皮质与髓质，但应主要采集肾脏外层部分。这些样本可在 –80 °C 下保存数月。

2. 从肾脏样本中纯化总RNA

注意：此步骤使用市售的miRNA提取试剂盒来提取总RNA。此外，还需使用生物聚合物破碎离心柱。更多细节请参见材料表。miRNA提取试剂盒包含基于二氧化硅膜的离心柱、苯酚/胍基裂解液、胍基/乙醇洗涤缓冲液（洗涤缓冲液1）、乙醇洗涤缓冲液（洗涤缓冲液2）以及无核酸酶水。此步骤处理10只HIGA小鼠和10只对照小鼠样本约需3小时。

  1. 准备以下物品：1.5 或 2.0 mL 收集管、100% 乙醇、氯仿、硅胶匀浆器、微量移液器、移液枪头、离心机、生物聚合物破碎离心柱、基于硅胶膜的离心柱、酚/胍裂解试剂、胍/乙醇洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 1）、乙醇洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 2）以及无核酸酶水。
  2. 使用硅胶匀浆器和 700 µL 酚/胍裂解试剂在室温下匀浆 30 mg 肾脏样本。
    注意：样本中的 miRNA 在接触酚/胍裂解试剂前非常不稳定，因此这些步骤应尽快完成。
  3. 将裂解液转移至生物聚合物破碎离心柱中，并在室温下以 15,000 x g 离心 2 分钟。
  4. 向滤液中加入 140 µL 氯仿，剧烈混匀 15 秒。静置 2–3 分钟，然后在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟。
  5. 小心地将澄清的上清液转移至新的收集管中，避免接触中间层，并加入确定体积（见下文）的 100% 乙醇。涡旋振荡 5 秒。
    注意：需加入相当于所得上清液体积 1.5 倍的 100% 乙醇。
  6. 将样品（上限 700 µL）转移至基于硅胶膜的离心柱中，并在室温下以 8,000 x g 离心 15 秒。离心后弃去滤液。
  7. 向基于硅胶膜的离心柱中加入 700 µL 洗涤缓冲液 1，并在室温下以 8,000 x g 离心 15 秒。离心后弃去滤液。
  8. 向基于硅胶膜的离心柱中加入 500 µL 洗涤缓冲液 2，并在室温下以 8,000 x g 离心 15 秒。离心后弃去滤液。
  9. 再次向基于硅胶膜的离心柱中加入 500 µL 洗涤缓冲液 2，并在室温下以 8,000 x g 离心 15 秒。离心后弃去滤液。
  10. 再次在不添加任何液体的情况下对基于硅胶膜的离心柱进行离心，以去除残留的乙醇，在室温下以 15,000 x g 离心 1 分钟。离心后弃去滤液。
  11. 将离心柱连接的收集管更换为新的收集管。
  12. 向基于硅胶膜的离心柱中加入 30 µL 无核酸酶水，并在室温下以 8,000 x g 离心 1 分钟。
    注意：所得 30 µL 溶液含有高浓度的总 RNA。该样品可在 –80 °C 下保存数月。

3. 从总RNA合成cDNA

注意：本步骤使用 commercially available 的反转录试剂盒。详见材料表中的更多细节。该试剂盒包含核酸混合液、反转录酶混合液和缓冲液。为防止反应提前进行，此操作必须在冰上进行。以10只HIGA小鼠和10只对照小鼠的样本量计算，该步骤约需3小时。

  1. 准备以下物品：1.5 mL 收集管、八联管、微量移液器、移液器吸头、分光光度计、无核酸酶水、冰、核酸混合液、逆转录酶混合液、缓冲液和热循环仪。
  2. 使用分光光度计测定总 RNA 的浓度。然后计算所需无核酸酶水的体积，使 12 µL 溶液中含有 1 µg 总 RNA。
  3. 配制主混合液，每份样品包含以下组分：2.0 µL 核酸混合液、2.0 µL 逆转录酶混合液和 4.0 µL 缓冲液，总体积为 8.0 µL。
  4. 将 8 µL 主混合液加入八联管的每个孔中。
  5. 用步骤 3.2 中计算出体积的无核酸酶水稀释总 RNA。然后，将 12 µL 总 RNA 溶液（含 1 µg 总 RNA）加入八联管的每个孔中。
  6. 将八联管中的样品在热循环仪中于 37 °C 孵育 60 分钟，随后在热循环仪中于 95 °C 孵育 5 分钟。
    注意：孵育后的溶液含有高浓度的 cDNA。
  7. 将该溶液转移至 1.5 mL 管中，并加入 200 µL 无核酸酶水。
    注意：最终得到的 200 µL 溶液可作为模板 cDNA 用于 qRT-PCR。该样品可在 –80 °C 下保存约 1 年。

4. miRNA 的 qRT-PCR

注意：本步骤使用市售的PCR试剂盒。详见材料表中的更多信息。该试剂盒包含PCR混合液、通用引物和无核酸酶水。样品应设置重复孔，且每种情况均需考虑结果的准确性。miRNA的表达水平通过ΔΔCT法进行定量。当样本量为10只HIGA小鼠和10只对照小鼠时，此步骤约需4小时。

  1. 准备以下物品：1.5 mL 收集管、96 孔反应板、96 孔反应板用粘性封膜、微量移液器、移液器吸头、PCR 混合液、通用引物、无核酸酶水、miRNA 特异性引物以及实时 PCR 仪。
  2. 按如下成分配制主混合液：每孔加入 12.5 µL PCR 混合液、2.5 µL 通用引物、1.25 µL 5 µM miRNA 特异性引物以及 6.25 µL 无核酸酶水。
    注意：本实验中使用了针对 miRNA [RNA, U6 小核 2 (RNU6-2)、miR-155-5p、miR-146a-5p 和 miR-21-5p] 的特异性引物。RNU6-2 作为内参对照14。
  3. 向 96 孔反应板的每个孔中加入 22.5 µL 主混合液。
  4. 向 96 孔板的各个孔中加入在步骤 3.7 中制备的 2.5 µL cDNA。
  5. 用粘性封膜覆盖 96 孔反应板，然后在 1,000 x g 条件下离心 30 秒。
  6. 运行实时 PCR 仪。PCR 程序设置如下：95 °C 初始激活 15 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 15 秒、55 °C 退火 30 秒以及 70 °C 延伸 30 秒。
  7. 采用 ΔΔCT 法定量基因表达。相对表达水平计算为 2–ΔΔCT。
    注意：异常的 PCR 扩增曲线应考虑从结果中剔除。

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结果

我们检测了HIGA小鼠（n=10）肾脏中miRNA的表达水平，该结果完全基于所述实验方案获得。选择Balb/c小鼠的肾脏作为对照组（n=10）。两组均选用25周龄的小鼠。供应商仅能提供雌性HIGA小鼠。检测了三种miRNA（miR-155-5p、miR-146a-5p和miR-21-5p；图1）的表达水平，这些miRNA此前已被报道与IgA肾病相关15,16。采用t检验比较两组间miRNA的相对表达水平，以P < 0.05为差异具有统计学意义。与对照组相比，HIGA组中miR-155-5p的表达水平高出3.3倍（P < 0.001），miR-21-5p的表达水平高出1.58倍（P = 0.007）。miR-146a-5p在两组间的表达水平差异无统计学意义。

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讨论

我们利用这一新方法成功测定了IgA肾病小鼠模型（HIGA小鼠）肾脏中miRNA的表达水平。IgA肾病是一种病因未明的疾病，仍需进一步研究以阐明其发病机制和治疗靶点1,3。然而，获取人类肾脏样本具有高度侵入性。该新技术的优势在于可利用小型动物开展IgA肾病的研究，有望推动未来对IgA肾病及miRNA的深入探索。在后续研究中，该方法可应用于探索用于治疗IgA肾病的新型miRNA。在HIGA小鼠中对miRNA进行人工调控可能影响IgA肾病的表型表现，在此情况下，该方法可用于验证miRNA的变化。本方法并非用于分析血清中的miRNA，但通过修改实验方案，或许也可实现该用途。

该方法的原理基于以往的报道。我们采用生物聚合物破碎离心柱来破坏样本中的生物聚合物，此前已有研究证明这是一种有效的技术12。以往的研究还表明，以总RNA为模板通过逆转录合成cDNA，并以所获得的cDNA为模板进行PCR扩增，具有较高的准确性

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢 Edanz Group（www.edanzediting.com）的 Sarah Williams 博士对本稿件初稿进行的编辑。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BALB/cCrSlc（25周龄，雌性）Japan SLC, Inc.无对照小鼠
HIGA/NscSlc（25周龄，雌性）Japan SLC, Inc.无IgA肾病小鼠模型
MicroAmp 光学 96 孔反应板（用于 qRT-PCR）Thermo Fisher Scientific431681396 孔反应板
MicroAmp 光学粘性封膜Thermo Fisher Scientific431197196 孔反应板用粘性封膜
miScript II RT 试剂盒Qiagen218161cDNA 合成实验试剂盒
miRNeasy Mini 试剂盒Qiagen217004总 RNA 提取实验试剂盒
miScript 引物检测（RNU6-2）QiagenMS00033740miRNA 特异性引物
miScript 引物检测（miR-155-5p）QiagenMS00001701miRNA 特异性引物
miScript 引物检测（miR-146a-5p）QiagenMS00001638miRNA 特异性引物
miScript 引物检测（miR-21-5p）QiagenMS00009079miRNA 特异性引物
miScript SYBR Green PCR 试剂盒Qiagen218073实时 PCR 实验试剂盒
QIA shredderQiagen79654生物大分子剪切离心柱
QuantStudio 12K Flex 实时荧光定量 PCR 系统Thermo Fisher Scientific4472380实时荧光定量 PCR 仪器
QuantStudio 12K Flex 软件版本 1.2.1Thermo Fisher Scientific4472380实时荧光定量 PCR 仪器配套软件
takara biomasher standardTakara Bio9790B硅基匀浆器

参考文献

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IgA RNA cDNA qRT PCR HIGA miR 155 5p miR 21 5p CT

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