利用细胞因子联合刺激HaCaT细胞建立体外银屑病样皮肤转录谱

摘要

本文介绍了一种在HaCaT细胞系上联合使用五种细胞因子（IL-17A、IL-22、IL-1α、TNF-α、OSM）在转录水平建立体外银屑病样皮肤炎症模型的方法。

摘要

银屑病是一种由先天性和适应性免疫系统介导的常见慢性炎症性皮肤病，其特征是表皮角质形成细胞的异常增殖与分化，以及炎性细胞的浸润。皮肤特异性的角质形成细胞是先天免疫的关键参与者，能够响应免疫细胞和外界刺激，从而在银屑病的免疫病理发生过程中发挥重要作用。本文介绍一种利用五种促炎细胞因子组合（M5组合）在转录水平上诱导HaCaT细胞系产生银屑病样角质形成细胞炎症的方法，该组合包括IL-17A、IL-22、IL-1α、TNF-α和抑癌蛋白M。结果显示，经M5组合处理的HaCaT细胞中抗菌肽（BD2、S100A7、S100A8和S100A9）、趋化因子及细胞因子（CXCL1、CXCL2、CXCL8、CCL20、IL-1β、IL-6和IL-18）的表达水平均升高。角质形成细胞分化标志物（Keratin1、Keratin10、Filaggrin和Loricrin）的mRNA水平则下调，这与来自银屑病样角质形成细胞的转录组数据一致。因此，本方法在体外建立了转录水平上的银屑病样皮肤炎症模型，有助于银屑病分子发病机制的研究。

引言

银屑病是一种常见的非传染性慢性炎症性皮肤病，由免疫反应失调引发，主要影响构成表皮的角质形成细胞¹，其特征是角质形成细胞异常快速增殖，并伴有角化过度和角化不全。全球约有3%的人口受此疾病影响²。该病还常伴随多种共病，进一步加重疾病负担，包括由该综合征引起的心血管疾病和代谢综合征³。

表皮由五层角质形成细胞构成，并随着分化过程发生形态学变化：从内到外依次为基底层、棘层、颗粒层、透明层（存在于手掌和脚底）以及角质层⁴。表皮分化的改变会导致皮肤屏障功能受损，这在皮肤炎症性疾病的发病机制中具有重要意义^5,6,7,8。角质形成细胞在维持完整表皮屏障方面发挥关键作用，可防止水分流失以及抵御紫外线B照射、过敏原和病原体等环境刺激因素⁹。健康个体中，基底细胞增殖与角质层脱屑之间保持平衡；而包括银屑病在内的多种皮肤疾病则表现为这一复杂机制的失衡¹⁰。

....

方案

在无菌条件下进行步骤1至3。所有培养基均含有0.1 mg/mL的青霉素和链霉素。

1. 细胞制备

1. 在100 mm细胞培养皿中加入10 mL含10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），接种1 × 10⁶个HaCaT细胞。将培养皿置于37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中培养2天。
2. 当细胞培养至约80%融合度时，小心吸除培养皿中的培养基，并用5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。手动轻轻晃动培养皿。
3. 吸除PBS，向细胞中加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。轻轻振荡培养皿，使溶液充分覆盖细胞单层。
4. 将细胞置于37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中孵育5分钟，直至相差显微镜下观察到细胞明显从培养皿表面脱落。
   注意：细胞形态应呈圆形。若细胞未充分脱落，可继续孵育5分钟并辅以手动震荡。
5. 细胞脱落后，加入5 mL含10% FBS的DMEM以中和胰蛋白酶活性，并用移液器将细胞悬液转移至50 mL离心管中。
6. 将含有细胞悬液的离心管在180 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。
7. 向细胞沉淀中加入10 mL含10% FBS的DMEM培养基，轻轻吹打混匀，使细胞充分重悬。

结果

M5联合刺激诱导HaCaT细胞的炎症反应。
HaCaT细胞经M5细胞因子组合刺激或不刺激处理24小时，检测与银屑病相关的基因mRNA表达水平，这些基因参与免疫和炎症趋化因子及抗菌肽的调控。与未处理的HaCaT细胞相比，经M5联合刺激的HaCaT细胞中，中性粒细胞趋化因子CXCL1³⁸、CXCL2³⁹、CXCL8⁴⁰以及T细胞趋化因子CCL20^41,42的表达显著升高，且呈时间依赖性（图1A）。抗菌肽BD2⁴³、S100A7^.......

讨论

本文描述了一种利用五种细胞因子组合（IL-17A、IL-22、IL-1α、TNF-α、OSM）作用于HaCaT细胞系，以在转录水平上建立体外类银屑病皮肤炎症谱的方法。该方案可适用于研究基因在银屑病发病机制中的作用，以及用于银屑病治疗药物的筛选。近期研究表明，病变皮肤中产生IL-17A和IL-22的CD8 T细胞过度表达，提示其参与了银屑病的发病过程⁶¹。IL-1α、IL-22和IL-17A可在动物模型中诱导皮肤炎症^62,63,64,65。某些细胞因子能够诱导与抗菌肽产生相关的特异性表达模式，例如IL-17和IL-22⁶⁶，或与先天免疫反应相关，例如IL-17、IL-1α和TNF-α^11,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM—达尔伯克改良伊格尔培养基	Gibco	11965092
胎牛血清	Gibco	10100139C
HaCaT 细胞	中国典型培养物保藏中心	GDC0106	传代次数少于 15 代
人 IL-1β ELISA 试剂盒	Beyotime	PI305
人 IL-6 ELISA 试剂盒	Beyotime	PI330
人 IL-8 ELISA 试剂盒	Beyotime	PI640
IL-1 alpha 人源	Prospec	CYT-253	重组蛋白
IL-17 人源	Prospec	CYT-250	重组蛋白
IL-22 人源	Prospec	CYT-328	重组蛋白
OSM 人源	Prospec	CYT-231	重组蛋白
PBS	Gibco	10010049	pH 7.4
青霉素-链霉素	Gibco	15140163
PrimeScrip 反转录试剂盒	TAKARA	RR047A
TB Green Premix Ex Taq	TAKARA	RR420A
TNF alpha 人源	Prospec	CYT-223	重组蛋白
TRIzo 试剂	Invitrogen	15596018
胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，含酚红	Gibco	25200072