本文提供了一种详细的组织解离和细胞分馏方法，可用于富集来自人肺近端和远端区域的活体上皮细胞。本文中，这些方法被应用于通过三维类器官培养模型对肺上皮祖细胞进行功能分析。
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本文内容
摘要
摘要
上皮类器官模型是研究器官系统基本生物学特性及疾病建模的重要工具。当培养为类器官时，上皮前体细胞能够自我更新，并产生具有与其来源组织相似细胞功能的分化后代 体内 对应细胞。本文中，我们描述了一种逐步分离人肺组织中区域特异性前体细胞并建立三维类器官培养体系的实验与验证工具。我们定义了肺的近端和远端区域，旨在分离具有区域特异性的前体细胞。通过联合使用酶消化与机械解离方法，从肺和气管组织中分离获得总细胞。随后，利用基于细胞类型特异性表面标志物（如NGFR）的荧光激活细胞分选技术（FACS），从近端或远端来源的细胞中分选出特定的前体细胞亚群。 用于分离基底细胞和HTII-280用于分离肺泡II型细胞。分离得到的基底细胞或肺泡II型前体细胞被用于生成三维类器官培养物。当在第30天以5000个细胞/孔接种时，远端和近端前体细胞均能形成类器官，其克隆形成效率分别为远端区域9–13%和近端区域7–10%。远端类器官维持HTII-280+ 培养中的肺泡II型细胞，而远端类器官在第30天分化为纤毛细胞和分泌细胞。这些三维类器官培养体系可作为研究肺上皮细胞生物学及上皮-间充质相互作用的实验工具，也可用于针对疾病中上皮功能障碍的治疗策略的开发与验证。
引言
人体呼吸系统的气道大致可分为传导区和呼吸区，分别负责气体的输送以及通过上皮-微血管屏障进行气体交换。传导性气道包括气管、支气管、细支气管和终末细支气管，而呼吸区气道则包括呼吸性细支气管、肺泡管和肺泡。这些气道的上皮衬层沿近远轴方向在组成上发生变化，以适应各个功能不同区域的独特需求。气管-支气管气道的假复层上皮主要由基底细胞、分泌细胞和纤毛细胞三种细胞类型构成，此外还含有较少的其他细胞类型，包括刷细胞、神经内分泌细胞和离子细胞1,2,3。细支气管气道也含有形态上相似的上皮细胞类型，但在其丰度和功能特性上存在差异。例如，基底细胞在细支气管气道中含量较少，而分泌细胞则以克拉拉细胞（club cells）为主，相比之下，在气管-支气管气道中则以浆液细胞和杯状细胞占主导。 呼吸区的上皮细胞包括呼吸性细支气管中一种尚未明确界定的立方样细胞类型，以及肺泡管和肺泡中的I型肺泡细胞（ATI）和II型肺泡细胞（ATII）1,4。
目前对参与各区域上皮组织维持与更新的上皮干细胞及祖细胞类型的鉴定尚不完整，主要基于动物模型研究推断而来5
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方案
人肺组织来自已故组织捐献者，获取过程符合国际医学进步研究所（IIAM）制定的知情同意程序，并经西达斯-西奈医学中心机构审查委员会批准。
1. 从气管支气管或小气道/肺实质（小气道和肺泡）区域分离肺细胞的组织处理
- 在细胞分离前一天，准备好所有解剖器械、玻璃器皿及相关溶液并进行高压灭菌。
- 收到肺组织后，识别并分离近端和远端区域。气管和支气管被视为近端部分 "近端"本实验方案的目的在于 气管及前2-3级支气管被分离出来，用于分离“近端”气道上皮。根据本方案，直径2 mm或更小的小气道及其周围实质组织被视为 "远端肺上皮（图1A).
注意：所有涉及人肺组织处理的操作均应在生物安全柜中进行，并使用适当的个人防护装备。
2. 从远端肺组织中富集和分选小气道及肺泡上皮祖细胞
- 远端组织制备
- 将远端肺组织置于无菌培养皿（150 × 15 mm）中，切成约1 cm大小的组织块3 将碎片放入干净的50 mL离心管中。
- 用预冷的HBSS洗涤组织3次，每次弃去HBSS洗液，以去除血液和上皮衬液。
- 将组织置于新的培养皿中，用无菌无绒布擦拭干燥。使用镊子和剪刀，尽可能去除大部....
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结果
肺组织来源
气管和肺外支气管（图1A）用作分离近端气道上皮细胞及后续生成近端类器官的组织来源。包含直径小于2 mm的肺实质和小气道的远端肺组织（图1A) 用于分离小气道和肺泡上皮细胞（远端肺上皮）并生成小气道类器官或肺泡类器官。由假复层上皮衬里的近端气道含有丰富的基底前体细胞，该细胞对膜蛋白NGFR呈免疫反应阳性。图1B，C）。相比之下，肺泡内衬上皮细胞中有一部分细胞在顶膜处显示对HTII-280单克隆抗体呈免疫反应阳性，提示其为肺泡Ⅱ型细胞（AT2）身份（图1B，D）。这些表面标志物用于对从近端或远端区域分离的上皮细胞单细胞悬液进行亚群分选。
组织解离与细胞分选
从人肺组织的近端或远端区域分离出.......
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讨论
我们描述了一种可靠的方法，用于从人肺组织中分离出特定的肺细胞亚群，以进行分子或功能分析及疾病建模。该方法的关键要素包括能够实现组织解离的同时保留细胞表面表位，从而允许通过抗体介导富集新分离的细胞，并优化培养条件以高效生成具有区域特异性的上皮类器官。我们重点关注上皮前体细胞的回收与富集，这些细胞在三维培养中与间质支持细胞重组后能够形成类器官。尽管在本研究中未明确这些培养体系中类器官的克隆性，但类似研究利用携带不同荧光报告基因的混合小鼠肺上皮前体细胞培养体系已证实其具有克隆来源22,23。
本文所述方法包含若干改进措施，旨在提高从消化肺组织中回收细胞的效率。将消化后的样品通过16号针头，以进一步破坏任何残留的未消化组织团块，获得均一的细胞悬液。通过添加DNase I减轻了由释放的基因组DNA引起的细胞聚集，从而制备出均一的细胞样本，确保在FACS分离过程中流体系统的顺畅运行。这些简单的改进措施共同提高了目标细胞群体的回收率，并避免了FACS富集过程中因细胞聚集导致的延迟.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Mizuno Takako 在 IFC 和 H&E 染色方面的支持，感谢 Vanessa Garcia 在组织切片方面的帮助 和 Anika S Chandrasekaran 在手稿准备过程中提供的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（5RO1HL135163-04，PO1HL108793-08）和新基医药 IDEAL 联盟资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | |||
| 10 mL 无菌注射器，鲁尔锁扣式针头 | Fisher Scientific | BD 309646 | |
| 30 mL 无菌注射器，鲁尔锁扣式针头 | VWR | BD302832 | |
| 生物危害废物袋 | VWR | 89495-440 | |
| 生物危害废物袋 | VWR | 89495-440 | |
| 连接环 | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| 脱氧核糖核酸酶（货号：SLBF7798V） | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| 一次性培养皿 | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| 漏斗 | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | 康宁 | 21-023 | |
| Liberase TM 研究级 | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| 16G 针头 | VWR | 305198 | |
| 18G 针头 | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm（细胞筛） | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm（细胞筛） | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm（细胞筛） | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm（细胞筛） | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm（细胞筛） | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| 剃刀刀片 | VWR | 55411-050 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | eBioscience | 00-4333-57 | |
| 仪器设备’s | |||
| GentleMACS C 管 | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo 组织解离仪 | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s 组织处理仪 | |||
| LS 柱 | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| 恒温混匀仪 | Eppendorf | 05-412-503 | |
| 恒温混匀仪 | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ 缓冲液 | |||
| 两性霉素B | 赛默飞世尔科技 | 15290018 | 2ml |
| EDTA（0.5 M），pH 8.0，无RN酶 | 赛默飞世尔科技 | AM9260G | 500µl |
| 胎牛血清 | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10 ml |
| HBSS Hank's 平衡盐溶液 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500 ml 瓶 |
| HEPES (1 M) | 赛默飞世尔科技 | 15630080 | 5 ml |
| 青霉素-链霉素-新霉素（PSN）抗生素混合液 | 赛默飞世尔科技 | 15640055 | 5 ml |
| FACS 用抗体列表 | |||
| Alexa Fluor 647 抗人 CD326（EpCAM）抗体 | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/阴性对照微粒套装 | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead 试剂盒，人 | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µ升/107 总细胞数 |
| CD45 微珠，人 | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µ升/107 总细胞数 |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC 抗人 CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC 抗人 CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC 抗人 CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC 标记的抗小鼠 IgM 抗体 | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| 小鼠IgM抗人HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE 抗人 CD271（NGFR） | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| 类器官培养基的组成 | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult-ALI 培养基 | Stemcell Technologies | 5001 | |
| 小气道上皮细胞生长培养基 | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert 细胞培养小室，无菌 | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632（ROCK抑制剂）100 mM 储存液（1000倍） | Stemcell Technologies | 72302 | |
| 小鼠基础培养基： | |||
| 两性霉素B | 赛默飞世尔科技 | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12，HEPES | 赛默飞世尔科技 | 11330032 | 50 ml |
| 胎牛血清 | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS-G）（100倍浓缩） | 赛默飞世尔科技 | 41400045 | 500 µl |
| 青霉素-链霉素-新霉素（PSN）抗生素混合液 | 赛默飞世尔科技 | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-ββ 通路抑制剂（储存液 100 mM） | 干细胞 | 72234 | 5 µl |
| 免疫组织化学抗体列表 | |||
| 基于柠檬酸的抗原修复液 | 载体 | H-3300 | 937 µ100毫升水中1升 |
| Histogel | 赛默飞世尔科技 | HG-4000-012 | |
| 一抗 | |||
| 抗 HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 单克隆抗体（2A5） | 赛默飞世尔科技 | 14-9965-82 | 1:300 |
| 人泌尿球蛋白/SCGB1A1 抗体 | R 和 D 系统 | MAB4218 | 1:300 |
| 角蛋白5多克隆鸡抗体，纯化 [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC 单克隆抗体（45M1） | 赛默飞世尔科技 | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin 抗体（克隆 8.1.1） | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| 纯化小鼠抗E-钙黏蛋白 | BD生物科学 | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 抗体 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| 二抗 | |||
| 驴抗兔IgG，488 | 赛默飞世尔科技 | A-21206 | 1:500 |
| FITC标记的抗小鼠IgM抗体 | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| 山羊抗仓鼠IgG（H+L），Alexa Fluor 594 | 赛默飞世尔科技 | A-21113 | 1:500 |
| 山羊抗小鼠 IgG1 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 | 赛默飞世尔科技 | A-21121 | 1:500 |
| 山羊抗小鼠IgG2a交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 | 赛默飞世尔科技 | A-21131 | 1:500 |
| 山羊抗小鼠 IgG2a 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568 | 赛默飞世尔科技 | A-21134 | 1:500 |
| 山羊抗小鼠IgG2b交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568 | 赛默飞世尔科技 | A-21144 | 1:500 |
| 缓冲液 | |||
| 免疫组织化学封闭液 | TBS（Tris 盐水）中含 3% BSA 和 0.4% Triton-X100 | ||
| 免疫组织化学孵育液 | 3% BSA，.1% Triton-X100 的 TBS 溶液 | ||
| 免疫组织化学洗涤液 | 含0.1%吐温20的TBS缓冲液 |
参考文献
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature.
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