慢性应激改变小鼠在Y迷宫障碍任务中的努力相关选择行为

Andrew Dieterich; Christine N. Yohn; Benjamin  Adam Samuels

doi:10.3791/61548

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慢性应激改变小鼠在Y迷宫障碍任务中的努力相关选择行为

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DOI：

10.3791/61548

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2020年8月13日

Andrew Dieterich¹^,² , Christine N. Yohn¹ , Benjamin Adam Samuels¹^,²

¹Department of Psychology, Behavioral and Systems Neuroscience Area, The State University of New Jersey, ²Graduate Program in Neuroscience, Rutgers, The State University of New Jersey

本文内容

摘要

Y迷宫屏障任务是一种行为测试，用于检测个体为获得奖励而付出努力的动机。本文中，我们讨论了将该行为测试应用于多种经过充分验证的慢性应激模型，包括慢性皮质酮处理和社会挫败应激，以及一种新型的慢性非选择性社会挫败应激（CNSDS），后者在雌性动物中同样有效。

摘要

包括重度抑郁症在内的情绪障碍可能由慢性应激引发。Y迷宫屏障任务是一种努力相关选择测试，用于测量个体为获得奖励而付出努力的动机。在小鼠中，与未受应激的小鼠相比，慢性应激暴露会显著影响其在可自由获得低价值奖励的情况下，仍努力获取高价值奖励的动机。本文描述了慢性皮质酮给药范式，该范式可导致小鼠在Y迷宫屏障任务中努力反应模式的改变。在Y迷宫任务中，一个臂内放置4粒食物颗粒，而另一个臂内仅放置2粒。当小鼠学会选择高奖励臂后，在多次测试阶段中，逐步增加高度的屏障将被引入高奖励臂内。然而，大多数慢性应激范式（包括皮质酮处理和社会挫败应激）均是在雄性小鼠中建立的，在雌性小鼠中效果较差。因此，我们还介绍了慢性非选择性社会挫败应激（CNSDS）——一种我们开发的、在雄性和雌性小鼠中均有效的应激范式。结合在雄性和雌性小鼠中使用多种不同的慢性应激源重复实验结果，并增加具有转化相关性的行为任务的应用，将有助于深入理解慢性应激如何引发情绪障碍。

引言

抑郁症和焦虑症等情绪障碍在当今社会极为普遍。数十年来，研究人员持续致力于寻找更有效的治疗方法，并开发相关啮齿类动物模型以研究这些复杂的疾病¹。慢性应激是导致抑郁症等情绪障碍的重要诱因²。因此，研究人员在雄性小鼠中建立了慢性社会挫败应激（chronic social defeat stress, SDS）和慢性皮质酮给药（chronic corticosterone administration, CORT）等慢性应激范式，现已被广泛用于评估长期应激暴露对神经生物学和行为的影响。目前最常用的评估慢性应激效应的行为学检测方法包括与回避行为相关的实验任务，例如高架十字迷宫、旷场实验和新奇环境抑制摄食实验，以及评估抗抑郁药效的实验，例如强迫游泳实验。然而，这些在啮齿类动物中观察到的行为在表型效度方面存在争议，更重要的是，其预测效度和对人类抑郁症等疾病的转化相关性有限。

一种常用的慢性应激模型——慢性不可预测性轻度应激（chronic unpredictable mild stress, CUMS）已通过诸如蔗糖偏好等行为进行了广泛验证³。CUMS会降低动物对1%蔗糖溶液相较于水的偏好，传统上将此行为解释为与快感缺失相关的行为表现⁴^,⁵。然而，在患有重度抑郁障碍的人类患者中并未观察到蔗糖偏好的降低⁶^,⁷。此外，蔗糖偏好测试无法用于研究需要付出努力的奖赏动机。

近年来，一些研究已将关注点转向与动机和奖赏相关的其他行为⁸^,⁹。这些任务具有良好的转化价值，因为可以在人类和啮齿类动物中进行相对相似的行为评估。本文中，我们描述了CORT和SDS范式及其在Y迷宫屏障行为任务中的作用，该任务用于测量个体为获得奖赏而付出努力的动机。随后，我们介绍了一种新开发的慢性应激范式——慢性非选择性社交挫败应激（CNSDS），该范式在雄性和雌性小鼠中均有效。

慢性皮质酮给药（CORT）是一种旨在模拟慢性应激状态而不实际施加应激刺激的实验范式。应激会激活下丘脑-垂体-肾上腺轴，导致人类体内肾上腺类固醇皮质醇¹⁰^,¹¹^,¹²和小鼠体内皮质酮¹³^,¹⁴的内源性释放。通过饮水方式向成年雄性小鼠持续给予皮质酮至少4周，可导致其在回避类行为任务（如旷场实验、高架十字迷宫和新奇环境抑制摄食）中出现适应不良的行为反应¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶。有趣的是，CORT 还会影响操作性任务中的奖赏处理过程¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹。本文所述的 CORT 范式可使血清皮质酮浓度稳定维持在 100 ng/mL 以下，该浓度比急性应激（如强迫游泳）所诱导的水平低五倍以上¹⁵。因此，慢性 CORT 给药不太可能导致高皮质醇血症。尽管慢性 CORT 处理仅对雄性小鼠有效²⁰，但我们最近的研究表明，它可在 Y 型迷宫障碍任务中引起显著的努力响应改变²¹。据我们所知，这是最早研究慢性应激对雄性小鼠努力相关选择行为影响的研究之一²¹。此前曾有一项研究首次证实了急性束缚应激对大鼠基于努力的决策行为的影响²²。在努力相关选择行为中，动物需在为获取高价值奖赏而付出努力，或接受更易获得但价值较低的奖赏之间进行选择。在人类中，奖赏付出努力任务（EEfRT）是一种设计用于类比小鼠努力相关选择任务的计算机游戏²³。抑郁症患者在 EEfRT 中表现出适应不良的反应（选择高价值奖赏所需高努力任务的可能性降低）。因此，啮齿类动物的努力相关选择任务因其具有重要的转化研究价值而备受关注。

慢性社交挫败应激（SDS）是雄性小鼠中应用最广泛的临床前应激模型之一。该模型为期10天，每天让体型较大且具有攻击性的退役CD-1雄性小鼠攻击实验小鼠（通常为C57BL/6J品系），每次攻击持续5分钟²⁴。该过程可在部分实验小鼠中诱导出显著的适应不良行为表型。通过社交互动测试可将小鼠划分为对挫败应激具有抵抗性或易感性的群体，多项研究已利用SDS的这一独特特征，探究应激抵抗性与易感性背后的分子及神经环路机制。本文将详细介绍CORT范式及其在Y迷宫屏障行为任务中的实施方法，并讨论SDS在Y迷宫屏障任务中的影响。Y迷宫屏障任务基于T迷宫屏障任务，后者主要用于大鼠，以评估动物为获取迷宫两臂中高或低价值奖励而付出努力的动机⁸^,⁹^,²⁵。该任务也被用于研究给予咖啡因或多巴胺拮抗剂后小鼠的努力性反应²⁶。啮齿类动物可在迷宫的一臂中通过攀爬高度逐渐增加的屏障来获取更高价值的奖励（通常为4粒奖励颗粒），或在另一臂中付出显著较少的努力仅获得2粒奖励颗粒⁹。为期10天的社交挫败范式可在易感小鼠中诱导出持续约30天的显著适应不良表型，因此我们对Y迷宫屏障任务进行了改进，以实现动物的快速训练与测试，确保所有实验能在该30天时间窗内完成²⁴。因此，本文还详细描述了一种Y迷宫屏障行为任务方案，包含压缩的训练阶段和单次屏障测试阶段，用于测量慢性应激暴露小鼠为获取奖励而付出努力的动机。

遗憾的是，慢性皮质酮处理和慢性社会挫败应激模型均是在雄性小鼠中建立的，在雌性小鼠中效果较差。这一局限性问题尤为突出，因为女性被诊断为抑郁症等情绪障碍的概率高于男性¹。尽管已有巧妙的改进使社会挫败应激（SDS）可用于雌性小鼠，但这些方法需要复杂的手术操作或繁琐的尿液采集过程²⁶^,²⁷。我们近期描述了一种对SDS范式的简单改进，称为慢性非区分性社会挫败应激（CNSDS）。CNSDS能够对实验用雄性和雌性小鼠均实现易感型与抗应激型的分层²⁸。暴露于CNSDS的易感雌性和雄性小鼠均表现出在高架十字迷宫中对开放臂的回避增加、在旷场实验中对中心区域的回避增加，以及在新奇环境抑制摄食实验中进食潜伏期延长。此外，CNSDS相较于其他SDS改良方法效率更高，因为在应激挫败阶段可将两种性别的小鼠合并进行。这使得实验小鼠的产量增加，而完成该方案所需的时间和工作量并未相应增加。因此，本文最后将深入介绍这一新近开发的慢性应激范式。

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方案

这些实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）实验动物护理指南，并经罗格斯大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 慢性皮质酮（CORT）

将小鼠随机分配至处理组。将成年雄性C57BL/6J小鼠随机分为溶剂对照组（Vehicle）和皮质酮（Corticosterone, CORT）处理组。
1. 将对照组小鼠和CORT处理小鼠分别饲养在不同的笼具中，因为其处理通过饮水瓶给予。
2. 标记特殊的水瓶卡片并放置于笼具中，以提醒动物护理人员瓶中所装为实验所需的溶液。
在1 L带螺口盖的玻璃容器中，将3.375 g β-环糊精溶解于750 mL自来水中，制备空白溶剂溶液。
1. 用该溶液填充对照组笼具的水瓶。确保瓶子无泄漏，以准确测量液体消耗量。
2. 标记容器，并在实验室的架子上室温保存。使用溶剂溶液填充笼瓶，使用时间约为1周。
3. 每周内随时补充溶剂瓶中的液体。根据需要，每周更换笼具瓶中的液体1至2次。每周在周初或周末更换一次新鲜的瓶子。
  注意：一周后，β-环糊精将开始附着在水瓶内壁，并使溶液变浑浊。
4. 每周监测两次液体消耗量并记录。分别称量每个瓶子的重量并记录，注意不要洒出任何液体。补充液体后将各瓶子放回原位。
  注意：5只小鼠的笼子在3-4天内会消耗80-120 mL液体。
在1 L带螺口盖的玻璃容器中，先将3.375 g β-环糊精溶于750 mL自来水中，配制CORT溶液；然后加入26.25 mg皮质酮。
1. 将CORT溶液进行超声处理以使其溶解于水中。将容器置于超声清洗仪的水浴中，在40 kHz条件下超声约30分钟，或直至皮质酮完全溶解且液体呈现澄清状态。
  注意：超声波均质器（探头式）也可有效溶解皮质酮（CORT）。
2. 为所有CORT笼具的水瓶装入溶液。标记容器，并在实验室的架子上室温保存。CORT溶液可用于填充笼具水瓶约1周时间。
  注意：使用棕色玻璃水瓶或不透明塑料瓶，因为皮质醇（CORT）对光敏感。
3. 每周监测两次液体消耗量并记录。每周称量所有对照溶剂处理小鼠和CORT处理小鼠的体重，以比较各笼小鼠的液体消耗量与体重关系。
4. 为确定液体消耗量（mL/g/天），使用以下公式：
  （过去3-4天内笼内消耗的液体量）/（笼内小鼠的平均体重）× 自给予溶剂或CORT溶液的瓶子重新灌注以来的天数
  注意：一组 n=5 的成年雄性 C57BL/6J 小鼠平均每日消耗量为 0.25–0.30 mg/g/天，该数值通常保持稳定 随意摄取 以及食物剥夺时间段。这些浓度分别相当于约24 mg/kg/天的β-环糊精和9.5 mg/kg/天的CORT¹⁵^,¹⁶.
社会挫败应激（SDS）
1. 采用其他文献中详细描述的标准社会挫败应激方案²⁴^,²⁹.
Y迷宫屏障任务
1. Y迷宫屏障任务的食物剥夺
  1. 完成社交互动测试的次日，称量所有对照组和实验组小鼠的体重。此即其自由进食状态下的体重。
    注意：本文中，“对照”和“实验”既指 SDS 对照和 SDS 实验小鼠，也分别指在 SDS 和 CORT 实验范式中给予溶剂（Vehicle）和皮质酮（CORT）的小鼠。
  2. 为了使小鼠处于食物剥夺状态，仅需从每只笼子的C57BL/6J小鼠一侧移除实验室饲料。
  3. 称量所有小鼠的体重以及每日给予的实验饲料量，以在整个测试期间将小鼠体重维持在自由进食体重的约90%。
    注意：每只小鼠或每组小鼠在饲养笼中获得的食物量将根据其体重波动情况以及在Y迷宫训练或测试期间每天消耗的奖励颗粒数量而定。
  4. 熟悉奖励颗粒。将一小勺20 mg的谷物基食物颗粒（Bio-Serv）倒入小鼠的饲养笼中。这将使小鼠熟悉该颗粒，并在Y迷宫的适应期及初始训练阶段促进其摄食行为。
Y迷宫装置
1. 使用不透明白色3/16英寸厚的有机玻璃（Plexiglas）构建一个Y型迷宫结构，迷宫包含三个臂，每个臂长26 cm、高20 cm、宽7 cm。
2. 使用可在Y迷宫槽口之间滑动的隔板，以便研究者关闭小鼠最初被放置的起始箱，或在小鼠选择并进入Y迷宫的左侧或右侧臂后，将其限制在选定臂内。
3. 使用金属丝网制作多个高10、15和20 cm的Y形迷宫障碍物，其垂直侧为金属丝网结构，背面倾斜侧以约45°角安装有机玻璃（Plexiglas）。该设计允许C57BL/6J小鼠抓握并攀爬障碍物的垂直金属丝网面，随后沿倾斜的有机玻璃面下行通过。
  1. 在倾斜的一侧添加细小的台阶，以提供更强的抓地力。
Y迷宫适应性训练
1. 使所有对照组和实验组小鼠适应Y型迷宫装置。
  1. 食物剥夺后的第二天，将大量20 mg的谷物类食物颗粒（例如 Bio-Serv）放入50 mL离心管的管盖中，并将管盖置于Y形迷宫各臂的末端。这些管盖可作为小鼠的简易食槽，小鼠会很快学会在其中取食食物颗粒。
  2. 将每只小鼠放入Y形迷宫的起始箱中，并放置起始箱隔板。
  3. 几秒后，移除隔板，让每只小鼠在Y形迷宫中自由探索15分钟。该时长足以使小鼠充分探索迷宫的各个臂，并建立对实验装置的熟悉度。
    注意：部分小鼠在第一天适应期间可能不会摄取任何食物颗粒。
2. 次日，采用相同步骤进行第二次为期15分钟的Y形迷宫适应。
  1. 记录未进食任何颗粒饲料的小鼠。对于这些小鼠，向其饲养笼中再添加一小勺颗粒饲料。
Y迷宫强制选择训练
1. 为每只小鼠指定高奖励（HR）和低奖励（LR）臂。
  1. 将对照组和实验组中的小鼠随机分配，使其左侧臂为高奖励（HR）臂、右侧臂为低奖励（LR）臂，或相反。因此，在每次试验中，左侧HR臂放置4粒食丸，右侧LR臂放置2粒食丸，或反之。
  2. 在对照组和实验组中，对指定的低阻力（LR）臂和高阻力（HR）臂进行左右平衡，使每组中约有一半受试者的左臂为高阻力臂，另一半受试者的右臂为高阻力臂。
2. 强迫选择试验
  1. 在完成为期2天的Y迷宫适应后，让小鼠开始为期3天的强迫选择训练，每天进行10次试验。
  2. 每次进行强制选择试验时，将小鼠放入起始箱中，随后移除隔板，允许小鼠在60秒内进入左侧或右侧臂并取食可获得的食丸。在每次强制选择试验中，使用隔板封闭对侧臂，迫使小鼠选择另一侧臂。在高奖励（HR）强制选择试验中，封闭低奖励（LR）臂；反之亦然。
  3. 试验结束后移走小鼠，并补充被吃掉的相应颗粒饲料。
  4. 每只小鼠在每一天的训练中进行交替的强制选择试验，使每只小鼠完成5次高奖励（HR）和5次低奖励（LR）的强制选择试验。
    注意：强迫选择试验训练小鼠将一个臂与较高的奖励相关联，而将另一个臂与较低的奖励相关联。
  5. 将小鼠放回其原代笼具中，随后依次处理不超过3-5只小鼠，以确保每只小鼠的试验间间隔维持在5分钟。
Y迷宫自由选择训练
1. 自由选择试验
  1. 每次自由选择实验开始前，先进行一次高奖励（HR）和低奖励（LR）臂的强制选择试验。因此，小鼠在开始10次自由选择试验之前，均已经历过被强制进入每个臂的过程。
  2. 将每只小鼠放入起始箱中，移除隔板。当小鼠选择一条臂并行进至末端（末端放置有含颗粒饲料的杯子）时，立即在该侧装上臂隔板，将小鼠锁定在内，直至其吃完颗粒饲料。
  3. 将小鼠放回其原代笼具，并依次对本周期中后续的3-5只小鼠进行实验，以确保每次试验间有5分钟的间隔。
2. 记录以下数据：选择臂的潜伏期、所选臂、到达食丸杯的潜伏期。
  1. 记录小鼠进入并完全行进至食丸杯的臂，同时记录其选择该臂并到达食丸杯的潜伏期。
  2. 将小鼠未选择臂或未吃完全部4粒或2粒食丸的任何试验视为遗漏试验。
3. 70% 自由选择标准
  1. 每天记录10次自由选择试验中所选的前肢。
  2. 当一只小鼠在自由选择训练日的10次试验中，有7次选择了高奖励臂（达到70%标准）时，将其转入屏障测试阶段。
    注意：继续自由选择训练，直至所有小鼠均达到70%选择高回报（HR）臂的标准，以确保小鼠能够充分区分高回报（HR）臂与低回报（LR）臂，并表现出对高回报（HR）臂的同等偏好。
Y迷宫屏障测试
1. 10 cm 障碍测试实验
  1. 将10 cm的屏障放置在Y迷宫HR臂的中点位置。
  2. 首先对双侧臂进行多次强制选择试验。对于不愿攀爬障碍物的小鼠，可用一根细长的Plexiglas片进行引导。
    注意：根据经验，我们建议在每次实验开始时，针对高反应性（HR）和低反应性（LR）组的小鼠，在新的障碍高度下至少进行2次选择性抉择试验。若需引导小鼠翻越障碍物时，建议记录这些试验。小鼠通常在1-2次试验内即可学会翻越10 cm高的障碍物，该高度不会过高以致小鼠无法站立并观察到另一侧。对于以相反侧臂作为指定HR臂的小鼠，需将障碍物放置于对侧。
  3. 将每只小鼠放入起始箱中，移除隔板，让小鼠穿越迷宫并在含有10 cm障碍物的HR臂的10次自由选择试验中选择一条臂。
  4. 如果小鼠选择高奖励侧，它将翻越障碍物以获取更多的奖励——4粒食丸；否则，它将选择低奖励侧，仅穿过迷宫底部以获得较少的奖励——2粒食丸。
  5. 记录所选择的臂以及每次试验中选择臂并到达食丸杯的潜伏期。每轮循环中以相同方式轮换测试4-6只小鼠，以保持5分钟的试验间间隔。
    注意：在Y迷宫中喷洒70%乙醇，并在每只小鼠实验间彻底擦拭干燥。
2. 15 cm 障碍测试实验
  1. 次日，完成上述所列全部步骤（步骤 1.10.1），但在 HR 臂中使用高 15 cm 的屏障。
3. 20 cm 障碍测试阶段
  1. 次日，完成上述所列的所有步骤（步骤 1.10.1），但在高反应性（HR）臂中使用 20 cm 高的屏障。
    注意：根据经验，当障碍物高度达到20 cm时，大多数对SDS敏感或接受CORT处理的实验小鼠（甚至部分对照组小鼠）会将其选择转向LR臂，因为它们缺乏足够的动机攀爬过高达20 cm的障碍物。此外，可能需要使用Plexiglas适配器，以防止小鼠从障碍物顶部攀爬至Y迷宫壁的边缘。我们不建议建造更高的Y迷宫，因为这会使实验者在每次试验后更难重新填充每个食杯中的食丸以及移出小鼠。
4. 奖励辨别测试阶段
  1. 为确保对照组和实验组小鼠均表现出充分且相似的奖赏辨别能力，需进行辨别测试实验。
  2. 按照上述所有步骤（步骤1.10.1）操作，但在LR臂中放置一个10 cm的障碍物。此时，两个臂均含有10 cm的障碍物，小鼠需要爬过任一障碍物才能获得4粒或2粒食丸奖励。
  3. 记录所有10次试验的潜伏期和臂选择。
    注意：由于小鼠获取任一奖励所需付出的努力相同，因此在大多数试验中应选择高奖励（HR）臂。为分析选择HR臂和低奖励（LR）臂的潜伏期，需计算每只小鼠的平均HR臂潜伏期和平均LR臂潜伏期。随后，采用双因素混合设计方差分析（ANOVA）比较选择两个臂的潜伏期，组间因素为社会挫败应激分组（对照组、SDS-易感组、SDS-耐受组），组内因素为臂类型（HR臂、LR臂）。

2. 慢性非特异性社交挫败应激（CNSDS）

在CD-1小鼠中筛选攻击性行为
1. 将一只雄性与一只雌性C57BL/6J小鼠放入每只CD-1小鼠的饲养笼中，持续180秒，或直至CD-1小鼠攻击这两只小鼠。这些C57BL/6J小鼠无需为未受刺激的初试小鼠，且不会用于后续任何实验。在此攻击性筛选阶段，切勿将C57BL/6J小鼠与CD-1小鼠同笼饲养。
  1. 记录每只CD-1小鼠对C57BL/6J小鼠攻击的潜伏期。
  2. 在总共3次筛选实验中，选择在连续两次实验中均能在60秒内攻击雄性和雌性C57BL/6J小鼠的所有CD-1攻击性小鼠。其余小鼠可用于在饲养笼中共同饲养。
    注意：社交挫败实验的一个重要注意事项是，由于身体攻击可能导致动物受伤。在筛选和实验阶段，应每天检查每只小鼠是否有伤口；若发现皮肤轻微损伤，应使用氯己定消毒剂处理。任何伤口长度超过1 cm的小鼠应从实验中剔除。
将小鼠分配至对照组和实验组。
1. 收集所有未处理的成年雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠，以及筛选过的退役雄性 CD-1 种鼠，还有将用于合笼饲养的 CD-1 雄性小鼠。
  1. 将成年雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠随机分配至对照组或实验组。在 CNSDS 实验组中，每只雄鼠与雌鼠在全部社交挫败实验阶段均配对固定；在 CNSDS 对照组中，雄鼠与雌鼠每日轮换配对。
  2. 将CD-1雄性小鼠分配用于社交挫败实验，或在每次实验后与C57BL/6J雄性和雌性实验小鼠同笼饲养，每对C57BL/6J雄性和雌性小鼠的实验安排每日交替进行。
慢性非特异性社交挫败应激（CNSDS）
1. 将所有小鼠转移至专用的社会挫败实验房间，包括所有CD-1雄性小鼠、CNSDS对照组雄性和雌性C57BL/6J小鼠，以及CNSDS实验组雄性和雌性C57BL/6J小鼠。
  1. 将4-6个CD-1雄性小鼠笼盒与C57BL/6J雄性和雌性小鼠笼盒对齐放置，CD-1笼盒置于前方，C57BL/6J笼盒置于后方。
  2. 用笼号标签标明正在被攻击的小鼠，以及与之合笼的CD-1小鼠，以确保所有小鼠的管理有序。
    注意：在第一天开始实验后，可在剩余的9次挫败实验中轮换小鼠，使每对C57BL/6J雄性和雌性小鼠在每次实验中均向左轮换一个笼位。这样可确保每次实验均与新的CD-1小鼠发生互动。
2. 中枢神经系统疾病研究实验组操作流程
  1. 将一只成年雄性C57BL/6J小鼠和一只成年雌性C57BL/6J小鼠放入每只CD-1攻击性雄鼠的饲养笼中，进行为期5分钟的社会挫败实验。
  2. 记录雄性和雌性实验用 C57BL/6J 小鼠的攻击潜伏期和攻击频率。
  3. 5分钟后，移走雄性C57BL/6J小鼠，放入共养的CD-1雄性小鼠笼内，两者之间用透明带孔的Plexiglas屏障隔开。用类似的透明带孔Plexiglas屏障将具有攻击性的CD-1小鼠与雌性C57BL/6J小鼠隔开。每天交替将雄性或雌性C57BL/6J小鼠与攻击性CD-1小鼠共养。
    注意：每次每日5分钟互动后，需对每只小鼠进行损伤评估，若伤口小于1 cm 可进行处理；任何大于1 cm 的伤口将导致该小鼠被立即移除并实施安乐死。因此，雄性和雌性实验小游戏副本均与CD-1攻击者共同饲养5天，随后与未参与攻击会话的新型CD-1小鼠共同饲养剩余的5天。在各次会话间隔的24小时内，使用透明带孔聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）屏障以防止直接身体接触，但允许与CD-1攻击者进行感官接触。如前所述，可在每次失败后约30分钟对所有雌性小鼠进行阴道灌洗²⁸.
3. 中枢神经系统疾病研究对照组操作流程
  1. 将一只对照雌性小鼠放入一只对照雄性C57BL/6J小鼠的原饲养笼中。
  2. 5分钟后，将小鼠分开，并在小鼠之间放置一个透明带孔的Plexiglas隔板。
  3. 将小鼠送回动物房，并放置在指定的单独货架上，作为CNSDS实验组笼具。在动物房内，我们设有专门的货架，用于将遭受应激的小鼠与其他小鼠隔离饲养。此外，若非应激小鼠目睹了攻击行为的发生，也可能出现相应效应，这类似于旁观性社会挫败范式中所观察到的现象。³⁰
  4. 记录每次对照互动期间的任何攻击或骑跨行为。
4. 对照组雄性和雌性小鼠将在后续各天分别接触新的同种小鼠，方法同传统社交挫败应激对照组。完成连续10天的CNSDS对照组与实验组实验。
  1. 完成10个步骤后^th 在最后一次对照组或实验组CNSDS实验期间，将所有小鼠共同饲养，并在整个行为学测试过程中维持共同饲养状态。每个鼠笼包含2只小鼠，用聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）隔板将它们分隔在两侧，以允许感官接触。对照组小鼠与另一只异性对照组小鼠同笼饲养，而实验组小鼠则与异性实验组小鼠同笼饲养。
  2. 每只对照组 C57BL/6J 雌鼠与之前在第10阶段中与其相互作用的对照组 C57BL/6J 雄鼠共同饲养^th 实验过程中，将一块透明的聚甲基丙烯酸甲酯隔板放入笼内，以分隔两只小鼠。
  3. 在最后一次挫败实验约24小时后，进行标准的社会交互测试，以确定与对照组相比，慢性社交挫败应激（CNSDS）是否降低了小鼠与新引入的CD-1小鼠之间的社会行为，并据此将小鼠分为对压力“具有韧性”或“易感”的表型。²⁴^,²⁹.
5. 对CNSDS对照组和实验组的雄性和雌性小鼠进行其他行为学测试，包括Y迷宫屏障任务，并将CNSDS组进一步分为CNSDS-抗应激组和CNSDS-易感组。
社交互动测试
1. 社交互动测试的初始设置
  1. 在最后一次CNSDS挫败实验后24小时，进行社交互动测试。
  2. 将所有成对饲养的对照组和实验组小鼠，以及一只未参与CNSDS范式的新型CD-1雄性小鼠，转移至独立的行为学实验房间进行社交互动测试。
  3. 在行为追踪软件（如 EthoVision）运行的专用计算机所连接的摄像机下方，设置一个标准的敞箱实验装置（75 cm × 75 cm）。
  4. 在连续两次2.5分钟试验的第二次中，设置一个新的实验，围绕开放场一侧墙壁放置一个交互容器（小型带孔有机玻璃容器，尺寸约为10 cm x 10 cm x 10 cm），用于容纳新的CD-1小鼠；在容器周围建立一个24 cm x 24 cm的社会交互区域，使得容纳新CD-1小鼠的容器四周形成一个7 cm宽的交互区域。
2. 小鼠社交互动测试的实施
  1. 将每只小鼠置于开放场的对角角落，进行一次持续2.5分钟的试验，期间无CD-1小鼠存在，并启动录像软件程序。
    注意：请将相互作用容器置于开放场一侧墙壁的中央，并且在本次试验中，容器内不放置CD-1小鼠。
  2. 2.5 分钟后，将小鼠放回其饲养笼中。使用 70% 乙醇清洁旷场装置。
  3. 将新的CD-1雄性小鼠放入另一个带孔的Plexiglas立方体中，置于开放场一侧墙壁中央。
  4. 再次将小鼠置于开放场的角落，进行为期2.5分钟的测试，此次有CD-1小鼠存在，并启动记录软件程序。
  5. 将小鼠取出并放回其原代笼具中。取出CD-1小鼠并放回其原代笼具中。用70%乙醇清洁旷场装置。
3. 运行剩余的CNSDS对照组和实验组小鼠，并计算互动比率。
  1. 对所有其他小鼠重复此操作，以量化每只CNSDS对照组和实验组小鼠在试验1和试验2中于互动区域所花费的时间。
  2. 为计算互动比率，使用以下公式比较在试验2（CD-1存在）与试验1（CD-1不存在）中动物在社交互动区域所花费的时间：
    互动比率 =（第二次试验中在互动区域的时间）/（第一次试验中在互动区域的时间）
4. 将小鼠分为“CNSDS-抗性”或“CNSDS-易感”组。抗性小鼠的互动比值为 > 1.0，而易感小鼠的相互作用比值为 <=1.0.
  1. 在后续的行为学检测中，例如Y型迷宫屏障任务或其他行为学实验，将CNSDS实验小鼠细分为CNSDS耐受型和CNSDS易感型表型。
  2. 因此，对于雌性个体，可在CNSDS对照组、CNSDS实验-弹性组和CNSDS实验-易感组之间进行单因素方差分析（one-way ANOVAs），并在适当情况下采用事后比较以确定组间差异。
  3. 对于性别差异比较，以CNSDS（对照组、复原组、易感组）和性别（男性、女性）作为组间因素进行双因素方差分析。必要时进行事后比较。

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结果

慢性CORT处理持续4周，随后进行Y迷宫屏障训练与测试（图1A）。在另一个队列中，同样采用10天SDS范式，随后进行Y迷宫屏障任务的训练与测试（图1C），以确定这些慢性应激范式对雄性小鼠努力相关选择行为的影响。与溶剂对照组小鼠和SDS对照组小鼠相比，慢性CORT和SDS均导致平均体重下降，如通过 t-测试（表1）。这些小鼠在整个测试期间平均消耗的笼内实验室饲料也较少（表1).

在CORT队列中，以CORT为组间因素、周数为组内因素的混合方差分析（ANOVA）显示，给予溶剂（Vehicle）和CORT的小鼠在4周给药期及随后3周行为测试期（共7周）内摄入的液体体积相似（图1B）。在SDS队列中，对照组和实验组雄性小鼠均完成了为期10天的SDS实验方案，并通过社会互动实验评估其对SDS方案的易感性，该实验比较了小鼠与新引入的...

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讨论

尽管慢性CORT处理范式通过饮水提供持续的CORT剂量，但根据经验，小鼠实际摄入的剂量可能存在一定个体间差异。此外，饮水消耗量只能以笼为单位进行总体评估，再根据每笼中小鼠的数量计算平均值。同时，在称量水瓶、将小鼠转移用于行为学测试或更换新笼具时，可能发生液体洒漏。然而，在数周的处理和行为学测试期间，仍可对溶剂对照（Vehicle）和CORT的消耗量进行有效且准确的追踪。我们强烈建议每周仅更换一次含有溶剂或CORT的新鲜水瓶，并固定称量和更换水瓶的时间。例如，可在每周一进行水瓶称重与更换，随后在周四或周五再次统一称重并补充水瓶。同样，建议每周在固定的一天同一时间对所有小鼠进行体重测量。最后，需要特别指出的是，该CORT处理范式会抑制下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴内源性皮质酮的分泌。因此，小鼠必须在整个行为学测试期间持续接受CORT处理，直至被处死。若中途停止CORT供给，小鼠可能出现急性肾上腺功能不全，即艾迪生病危象。其他替代方案曾采用2–3周的CORT暴露，随后逐步停用CORT，并在内源性皮质酮水平恢复正常的约3–4周窗口期内开展行为学测试¹⁷^,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Thomas Grace在Y型迷宫、隔离屏障和社会挫败实验笼具构建方面提供的帮助。作者感谢Jay Lee、Karina Stech和Prachi Srivastava在数据采集方面的协助。本研究由美国国立精神卫生研究院资助，资助编号为R01 MH112861（BAS）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
丙烯酸板	McMaster Carr	8560K215	透明，3/16" 厚，24" × 36"
β-环糊精	Sigma-Aldrich	C4767	500 mg
C57BL/6J 小鼠	Jackson Labs	000664	成年，7–8 周龄
皮质酮	Sigma-Aldrich	C2505 或 C27840	100 或 500 mg
雄性 CD-1 小鼠	Charles River	022	"退役种鼠"
聚氯乙烯丙烯酸板	McMaster Carr	8560K215	白色，3/16" 厚，48" × 48"
固态超声波清洗器	Fisher Scientific	FS-28	频率必须达到 40 kHz
钢丝网布	McMaster Carr	9219T143	1 英尺 × 2 英尺

参考文献

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慢性应激改变小鼠在Y迷宫障碍任务中的努力相关选择行为

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