利用粗制腹腔渗出细胞和天然抗原刺激进行的离体肥大细胞脱颗粒检测

摘要

我们建立了一种离体肥大细胞脱颗粒检测方法，该方法通过将从小鼠腹腔渗出液中分离得到的粗制细胞与载体蛋白上的二硝基苯（DNP）共同孵育来进行；这些细胞事先经目的药理学试剂处理，并预先给予抗二硝基苯（DNP）IgE。

摘要

肥大细胞稳定剂是抗过敏药物的重要组成部分。被动性全身性过敏反应（PSA）是一种广泛用于研究药理学试剂在体内对肥大细胞作用的动物实验方法。由于过敏症状主要归因于肥大细胞颗粒的胞吐作用，因此能够缓解症状的试剂被认为具有肥大细胞稳定活性。尽管如此，仍需通过直接证明该试剂处理后肥大细胞功能活性的下降，来确认其稳定作用。为此，通常采用永生化肥大细胞系或培养的原代肥大细胞进行体外脱颗粒实验。体外与体内实验的结果并不总是一致，因为体外实验的处理条件（如给药剂量、时间、周围环境）通常与PSA等体内实验不同。为了建立一种更贴近体内药理学试剂对肥大细胞作用效果的体外（或离体）实验方法，我们设计了一种离体肥大细胞脱颗粒实验：从小鼠分离粗制腹腔渗出细胞（PECs），经待测试剂处理并给予抗二硝基苯酚（DNP）IgE后，直接与偶联在载体蛋白上的DNP共同孵育。结果表明，该实验不仅可用于验证体内实验所提示的药理学试剂的肥大细胞稳定活性，而且具有操作简便、重复性高的优点。

引言

肥大细胞在过敏反应中起核心作用^1,2。当通过与IgE高亲和力受体（FcεRI）结合而位于肥大细胞表面的IgE遇到相应的过敏原时，会触发信号级联反应，促使颗粒释放。结果，多种过敏效应分子被释放，包括单胺类物质（如组胺、5-羟色胺）、细胞因子（如TNF-α）和蛋白水解酶（如类胰蛋白酶、类糜蛋白酶），从而引发一系列免疫学、神经学和血管肌肉反应^3,4。

有一类药物被称为肥大细胞稳定剂，通过抑制肥大细胞功能来缓解过敏症状⁵。被动性全身性过敏反应（PSA）是一种常用于检测药物是否具有肥大细胞稳定活性的动物模型。由于过敏症状主要源于被动转移的半抗原特异性IgE与随后注入动物体内的载体蛋白上的半抗原结合后所引发的肥大细胞活化，因此，若待测药物能够减轻上述症状，则通常认为该药物具有肥大细胞稳定活性⁶。然而，通常仍有必要在独立实验中直接证明该药物对肥大细胞功能的抑制作用，以排除症状改善可能源于非肥大细胞功能抑制的其他机制的可能性。

肥大细胞脱颗粒实验通常用于体外测定药理学试剂对肥大细胞的稳定活性，其原理是通过化学试....

方案

所有动物实验均按照忠南国立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）提供的指南进行（动物实验方案编号：CNU-00996）。

1. 在粗制腹腔细胞裂解液中定量肥大细胞特异性分子

1. 从鼠腹腔中分离细胞¹²。
   1. 使用异氟烷麻醉一只小鼠（8周龄，雄性，BALB/C品系）。通过颈椎脱位法处死小鼠。
   2. 将小鼠置于泡沫板上，用70%乙醇擦拭腹部。
   3. 使用钝头剪刀沿腹侧中线纵向剪开皮肤，用镊子和剪刀剥离小鼠皮肤。
   4. 使用带26 G针头的10 mL注射器向腹腔内注入6 mL冰冻的Tyrode’s B缓冲液¹³。轻柔插入针头，避免刺破任何器官。
   5. 按摩小鼠腹部60–90秒，使腹腔细胞进入Tyrode’s B缓冲液中。操作应轻柔，避免损伤血管。
   6. 将连接10 mL注射器的针头（20 G）斜面向上插入腹腔，缓慢抽吸腹腔液体（通常为5–6 mL）。
   7. 从注射器上取下针头，将腹腔液排入50 mL锥形管中，并将管子置于冰上保存。
   8. 重复步骤1.1.4至1.1.7。
   9. 在10 °C条件下以300 × g离心5分钟。用1 mL 1×红细胞（RBC）裂解缓冲液重悬细胞沉淀，冰上孵育3分钟。

结果

确定体外肥大细胞脱颗粒实验中 PECs 的最佳数量

肥大细胞（c-kit⁺·IgE⁺ 双阳性细胞）¹⁵ 仅占腹腔渗出细胞（PECs）的约 2%（图 1A）。我们假设 PECs 中的肥大细胞释放了 100% 的颗粒内容物，据此估算培养上清中可检测到的肥大细胞特异性分子的最大水平，并测定了用不同数量 PECs（分别为 2.5 × 10⁵、5 × 10⁵ 和 1 × 10⁶ 个细胞）制备的全细胞裂解液中 β-己糖胺酶¹⁶ 和组胺¹⁷ 的含量。如 图 1B 所示，即使使用 2.5 × 10⁵ 个 PECs 制备裂解液，也能检测到显著水平的 β-己糖胺酶和组胺，且随着用.......

讨论

发现肥大细胞脱颗粒实验可以使用相对少量的粗制小鼠腹腔渗出细胞（PECs）进行具有重要意义。尽管PECs必须是原代小鼠肥大细胞的优良来源，但从小鼠PECs中纯化肥大细胞却具有挑战性。虽然密度梯度介质（如Percoll²⁵）已成功用于从大鼠PECs中纯化肥大细胞，但其在小鼠腹腔肥大细胞纯化中的应用受到限制，可能是因为大鼠和小鼠肥大细胞的密度不同。另一种梯度介质Histodenz²⁶也曾用于小鼠腹腔肥大细胞的纯化，但效果有限；其纯化结果似乎依赖于小鼠的条件（例如年龄）。即使是磁性细胞纯化系统等新型细胞分离系统，也仅能实现小鼠肥大细胞的部分纯化（作者未发表数据）。本文表明，进行肥大细胞脱颗粒实验时，无需对腹腔肥大细胞进行纯化。

粗制腹腔渗出细胞（PECs）中的肥大细胞可被IgE的同源抗原激活，这一结果令人鼓舞，为建立一种能够真实模拟体内脱颗粒事件的体外实验方法提供了希望。然而，除了肥大细胞外，嗜碱性粒细胞也表达FcεRI²⁷。因此，需要注意的是，P.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器		1757589701
1.5 mL 微量离心管	Hisol	MT-15003
10 mL 注射器		1757593161
15 mL 圆锥形离心管	Thermo Fisher scientific	14-959-53A
20xPBS	Tech & Innovation	BPB-9121-500mL
4-硝基苯基-N-乙酰-β-D-葡糖胺	SIGMA	N9376
5 mL 聚苯乙烯圆底试管	Life sciences	352003
50 mL 圆锥形离心管	Thermo Fisher scientific	14-959-49A
铝箔纸	BioFact	TS1-3330
抗小鼠 CD117(c-kit)	Biolegend	135129	保存于 2-8°C
抗小鼠 IgE 单克隆抗体	Thermo Fisher scientific	11-5992-81	保存于 2-8°C
抗 DNP-IgE 抗体	SIGMA	D8406-.2MG	保存于 -20°C
离心机	HANIL	396150
D-(+)-葡萄糖	SIGMA	G8270
地塞米松	SIGMA	D2915-100MG
DNP-BSA	Invitrogen	2079360	保存于 -20°C
EDTA	Biofact	PB131-500
胎牛血清	Thermo Fisher scientific	11455035
明胶	SIGMA	G1890
甘氨酸	JUNSEI	27185-0350
血细胞计数板	ZEISS	176045
HEPES	Thermo Fisher scientific	15630130
组胺 ELISA 试剂盒	Abcam	GK3275957-4	保存于 2-8°C
加热磁力搅拌器	Lab teach	zso-9001
异氟烷	Troikaa	I29159
富马酸酮替芬盐	SIGMA	K2628
MCPT-1 ELISA 试剂盒	Thermo Fisher scientific	88-7503-22	保存于 2-8°C
小鼠 Fc 封闭抗体	BD Biosciences	553141	保存于 2-8°C
碘化丙啶	SIGMA	81845	保存于 2-8°C
红细胞裂解缓冲液	Biolegend	420301
圆底 96 孔板	SPL-life sciences	30096
一次性注射器滤器	Startoriusag	16555
链霉亲和素磁珠	MilteryiBiotec	130-048-101	保存于 2-8°C
Triton X-100	JUNSEIchemical	49415-1601
TWEEN 20	SIGMA	9005-64-5
水浴锅	CHANGSHINSCIENCE	190107