利用粗制腹腔渗出细胞和天然抗原刺激进行的离体肥大细胞脱颗粒检测

摘要

我们建立了一种离体肥大细胞脱颗粒检测方法，该方法通过将从小鼠腹腔渗出液中分离得到的粗制细胞与载体蛋白上的二硝基苯（DNP）共同孵育来进行；这些细胞事先经目的药理学试剂处理，并预先给予抗二硝基苯（DNP）IgE。

摘要

肥大细胞稳定剂是抗过敏药物的重要组成部分。被动性全身性过敏反应（PSA）是一种广泛用于研究药理学试剂在体内对肥大细胞作用的动物实验方法。由于过敏症状主要归因于肥大细胞颗粒的胞吐作用，因此能够缓解症状的试剂被认为具有肥大细胞稳定活性。尽管如此，仍需通过直接证明该试剂处理后肥大细胞功能活性的下降，来确认其稳定作用。为此，通常采用永生化肥大细胞系或培养的原代肥大细胞进行体外脱颗粒实验。体外与体内实验的结果并不总是一致，因为体外实验的处理条件（如给药剂量、时间、周围环境）通常与PSA等体内实验不同。为了建立一种更贴近体内药理学试剂对肥大细胞作用效果的体外（或离体）实验方法，我们设计了一种离体肥大细胞脱颗粒实验：从小鼠分离粗制腹腔渗出细胞（PECs），经待测试剂处理并给予抗二硝基苯酚（DNP）IgE后，直接与偶联在载体蛋白上的DNP共同孵育。结果表明，该实验不仅可用于验证体内实验所提示的药理学试剂的肥大细胞稳定活性，而且具有操作简便、重复性高的优点。

引言

肥大细胞在过敏反应中起核心作用^1,2。当通过与IgE高亲和力受体（FcεRI）结合而位于肥大细胞表面的IgE遇到相应的过敏原时，会触发信号级联反应，促使颗粒释放。结果，多种过敏效应分子被释放，包括单胺类物质（如组胺、5-羟色胺）、细胞因子（如TNF-α）和蛋白水解酶（如类胰蛋白酶、类糜蛋白酶），从而引发一系列免疫学、神经学和血管肌肉反应^3,4。

有一类药物被称为肥大细胞稳定剂，通过抑制肥大细胞功能来缓解过敏症状⁵。被动性全身性过敏反应（PSA）是一种常用于检测药物是否具有肥大细胞稳定活性的动物模型。由于过敏症状主要源于被动转移的半抗原特异性IgE与随后注入动物体内的载体蛋白上的半抗原结合后所引发的肥大细胞活化，因此，若待测药物能够减轻上述症状，则通常认为该药物具有肥大细胞稳定活性⁶。然而，通常仍有必要在独立实验中直接证明该药物对肥大细胞功能的抑制作用，以排除症状改善可能源于非肥大细胞功能抑制的其他机制的可能性。

肥大细胞脱颗粒实验通常用于体外测定药理学试剂对肥大细胞的稳定活性，其原理是通过化学试剂或特异性抗原刺激肥大细胞表面与IgE-FcεRI复合物结合的受体，从而诱导分泌性颗粒的胞吐作用（即脱颗粒）⁷。该实验可采用多种细胞类型，包括大鼠嗜碱性白血病（RBL）细胞系⁸、骨髓来源的肥大细胞（BMMC）⁹以及腹腔细胞来源的肥大细胞（PCMC）¹⁰。RBL细胞虽易于大量获取，但属于永生化癌细胞系，其细胞特性已不再接近体内正常的肥大细胞。而尽管BMMC和PCMC的细胞特性可能更接近体内肥大细胞，但获得足够数量的这类细胞往往成本较高且耗时较长。

使用纯化的原代肥大细胞进行脱颗粒检测是一种理想的替代方法¹¹。然而，此类检测尚未广泛应用，原因是目前尚无一种简便的方法能够从动物组织（尤其是小鼠组织）中以高得率和高纯度分离肥大细胞。此外，由于体外使用药物试剂抑制肥大细胞功能所需的浓度和处理时间可能与体内条件不一致，体外脱颗粒实验的结果可能无法准确反映体内实验（如被动皮肤过敏反应，PSA）的结果，反之亦然。因此，迫切需要一种新型的脱颗粒检测方法，不仅能够紧密模拟体内肥大细胞活化的方式，还能准确反映药物试剂在体内对肥大细胞的作用效果。为了满足这些需求，我们设计了一种离体（ex vivo）肥大细胞脱颗粒检测方法：预先用目标药理学试剂处理小鼠，并注射针对二硝基苯酚（DNP）的IgE抗体；随后分离其腹腔渗出细胞（PECs），再用DNP偶联的牛血清白蛋白（BSA）刺激其中的肥大细胞以诱导脱颗粒反应。

方案

所有动物实验均按照忠南国立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）提供的指南进行（动物实验方案编号：CNU-00996）。

1. 在粗制腹腔细胞裂解液中定量肥大细胞特异性分子

1. 从鼠腹腔中分离细胞¹²。
   1. 使用异氟烷麻醉一只小鼠（8周龄，雄性，BALB/C品系）。通过颈椎脱位法处死小鼠。
   2. 将小鼠置于泡沫板上，用70%乙醇擦拭腹部。
   3. 使用钝头剪刀沿腹侧中线纵向剪开皮肤，用镊子和剪刀剥离小鼠皮肤。
   4. 使用带26 G针头的10 mL注射器向腹腔内注入6 mL冰冻的Tyrode’s B缓冲液¹³。轻柔插入针头，避免刺破任何器官。
   5. 按摩小鼠腹部60–90秒，使腹腔细胞进入Tyrode’s B缓冲液中。操作应轻柔，避免损伤血管。
   6. 将连接10 mL注射器的针头（20 G）斜面向上插入腹腔，缓慢抽吸腹腔液体（通常为5–6 mL）。
   7. 从注射器上取下针头，将腹腔液排入50 mL锥形管中，并将管子置于冰上保存。
   8. 重复步骤1.1.4至1.1.7。
   9. 在10 °C条件下以300 × g离心5分钟。用1 mL 1×红细胞（RBC）裂解缓冲液重悬细胞沉淀，冰上孵育3分钟。
   10. 用2 mL Tyrode’s B缓冲液稀释细胞悬液，在10 °C条件下以300 × g离心5分钟。
   11. 弃去上清液，用0.5 mL Tyrode’s A缓冲液¹³重悬细胞沉淀。
   12. 使用血细胞计数板计数细胞，并用Tyrode’s A缓冲液调整细胞浓度至5 × 10⁶/mL。
2. 使用磁性细胞纯化系统制备肥大细胞耗竭的腹腔渗出细胞（PECs）¹⁴。
   1. 取5 × 10⁵个粗制PECs，在10 °C条件下以300 × g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于200 µL PBSBE细胞纯化缓冲液（0.5% BSA，2 mM EDTA，1× PBS，pH 7.4）中。
   2. 向细胞中加入1 µL Fc阻断剂（0.5 mg/mL），防止后续加入的抗c-kit单克隆抗体（mAb）发生非特异性结合。冰上孵育5分钟。
   3. 加入1 µL生物素标记的抗小鼠c-kit单克隆抗体¹⁵（0.5 mg/mL），冰上孵育10分钟。
   4. 加入2 mL PBSBE缓冲液，在10 °C条件下以300 × g离心10分钟。
   5. 弃去上清液，再用2 mL PBSBE缓冲液洗涤细胞一次。
   6. 将细胞重悬于90 µL PBSBE缓冲液中，加入10 µL链霉亲和素偶联微珠，冰上孵育15分钟。
   7. 加入2 mL PBSBE缓冲液，在10 °C条件下以300 × g离心10分钟。
   8. 在离心过程中，向中等强度磁柱中加入500 µL PBSBE缓冲液，使缓冲液流过磁柱。
   9. 离心结束后弃去上清液，将细胞重悬于500 µL PBSBE缓冲液中。
   10. 将细胞上样至磁柱，收集自由穿过的细胞。
   11. 用500 µL PBSBE缓冲液洗涤磁柱，再次收集穿过的细胞。
   12. 重复步骤1.2.11。
   13. 合并步骤1.2.9至1.2.11收集的细胞于同一管中，在10 °C条件下以300 × g离心10分钟。
   14. 用Tyrode’s A缓冲液重悬细胞，计数后调整细胞浓度至5 × 10⁶个/mL。
3. 制备PECs裂解液。
   1. 将PECs（例如5 × 10⁵个）分别接种至圆底96孔板中，在10 °C条件下以300 × g离心2分钟以收集细胞，小心用移液器吸除上清液。
   2. 向细胞沉淀中加入100 µL细胞裂解缓冲液，轻轻吹打数次使细胞重悬，将板置于冰上孵育60分钟。
   3. 在10 °C条件下以300 × g离心5分钟以去除细胞碎片，将上清液（即细胞裂解液）转移至新的96孔板中。
4. 测定β-己糖胺酶的酶活性¹⁶。
   1. 在96孔微量板中，将50 µL细胞裂解液加入预热的β-己糖胺酶底物溶液（50 µL）中，用移液器轻轻混匀。
   2. 将板放入37 °C培养箱孵育，30分钟后加入50 µL终止液（100 mM甘氨酸，pH 10.7）以终止酶反应。
   3. 使用紫外-可见光吸收微孔板读数仪在双波长模式下读取反应混合物的吸光度；分别在405 nm处测定酶反应水平，在620 nm处进行自动背景校正。
5. 测定组胺浓度¹⁷。
   1. 取100 μL澄清的细胞裂解液，加入组胺ELISA试剂盒提供的抗组胺单克隆抗体包被板中，按照制造商说明书进行竞争性组胺ELISA检测。
   2. 使用紫外-可见光吸收微孔板读数仪在450 nm波长下读取样品的吸光度。
6. 通过流式细胞术确定PECs中肥大细胞的比例¹⁸。
   1. 将1 × 10⁵个粗制或肥大细胞耗竭的PECs转移至圆底96孔板中，在10 °C条件下以300 × g离心2分钟。
   2. 用50 µL FACS缓冲液重悬细胞，加入1 µL抗小鼠c-kit抗体（0.5 mg/mL）和抗小鼠IgE单克隆抗体（0.5 mg/mL）。
   3. 短暂涡旋混匀，避光冰上孵育20分钟。
   4. 向孔中加入150 µL FACS缓冲液，在10 °C条件下以300 × g离心2分钟，快速翻转平板弃去上清液。
   5. 用含碘化丙啶（1 µg/mL）的150 µL FACS缓冲液重悬细胞，使用流式细胞仪分析细胞。

2. 使用粗制腹腔渗出细胞进行肥大细胞脱颗粒检测

1. 确定肥大细胞脱颗粒程度（%脱颗粒）。
   1. 向3只BALB/C小鼠（8周龄，雄性）静脉内（i.v.）注射3 μg抗DNP单克隆抗体（小鼠IgE）。抗体注射后1天分离腹腔渗出细胞（PECs）（参见步骤1.1）。
   2. 加入90 μL粗制PECs（5.5 × 10⁶/mL）加入至平底96孔板中（共4孔）。将该板置于37℃培养箱中孵育。 ^oC 湿润的 CO₂₂ 孵育30分钟。
   3. 向含有 PECs 的孔中加入 10 μL DNP-BSA（5 ng/mL，溶于 1×PBS）。将培养板在 37 °C CO₂ 培养箱中孵育 10 分钟₂ 培养箱
   4. 将培养板在300 x g 孵育结束后立即在10 °C下离心5分钟。用移液器小心吸取上清液（100 μL），置于预冷的新的96孔圆底板中，并置于冰上保存。
   5. 向含有PECs的微孔板孔中加入100 µL细胞裂解缓冲液（含0.1% Triton X-100的1 × PBS，pH 7.4）。将微孔板置于冰上孵育60分钟。
   6. 进行β-己糖胺酶活性检测。
      1. 从脱颗粒实验后（参见步骤2.1.4和2.1.5）冰上保存的四份样本中，分别取出两组上清液及相应的细胞裂解液。将上清液和细胞裂解液各分装至两个独立的孔中（每孔50 μL），以进行实验的重复测定。
      2. 向每孔中加入50 μL β-己糖胺酶底物溶液。将酶标板在37 °C孵育30分钟。向反应体系中加入50 μL终止液（100 mM甘氨酸，pH 10.7）。
      3. 读取反应混合物的 O.D. 值（参见步骤 1.4.3）。按如下方法计算肥大细胞脱颗粒程度。
         脱颗粒百分比 = OD_上清液 （OD_上清液 + OD_裂解液) × 100%
   7. 进行组胺检测。
      1. 向另外两个孔中各加入 100 µL 1x PBS，这些孔含有脱颗粒后保存的上清液及相应的细胞裂解液，使样品总体积达到 200 μL。将每个样品均分至组胺 ELISA 试剂盒提供的组胺 ELISA 板的两个独立孔中。
      2. 按照制造商说明书进行ELISA实验。使用紫外-可见光吸收酶标仪在450 nm波长下读取样品的吸光度（O.D.）。按照2.1.6.3节计算脱颗粒程度。
         % 脱颗粒 = [组胺]_sup [组胺]_sup + [组胺]_裂解液) × 100%
2. 利用离体肥大细胞脱颗粒实验评估抗过敏药物在体内对肥大细胞的作用效果。
   1. 口服给予 200 μL 地塞米松¹⁹ （地塞米松）和酮替芬²⁰ 分别对小鼠（6周龄，雄性）每天一次给予KET，连续3天（每组6只小鼠）。
   2. 在第3天后，通过静脉注射（i.v.）向小鼠注射3 μg抗DNP IgE^rd 处理。将每组小鼠分为两个独立的笼子（每笼3只小鼠）；一笼用于PSA检测，另一笼用于离体肥大细胞脱颗粒检测。
   3. 进行PSA检测
      1. 在注射抗DNP IgE后一天，向小鼠注射DNP-BSA（80 μg）。从注射DNP-BSA后立即开始，每隔15分钟用直肠温度计测量一次体温，持续1小时。
      2. 在注射DNP-BSA后一天采集血液，采用ELISA检测血清中MCPT-1的水平。
   4. 进行离体肥大细胞脱颗粒实验。
      1. 注射抗DNP IgE一天后，从小鼠中分离腹腔渗出细胞（PECs），计数分离得到的PECs数量。
      2. 将90 µL粗制PECs（5.5 × 10⁶/mL）加入96孔板中（每只小鼠4个孔）。将培养板置于37 °C、湿润的CO₂培养箱中孵育。₂ 30 分钟孵育。
      3. 加入10 µL DNP-BSA（5 ng/mL）。将酶标板在37 °C、湿润的CO₂环境中孵育10分钟。₂ 培养箱
      4. 将培养板在300 x g 在10 °C下离心5分钟。小心吸取上清液（100 µL），留下细胞于孔中。
      5. 加入100 µL细胞裂解缓冲液至各孔中。将培养板置于冰上孵育60分钟。
      6. 按照2.1.6和2.1.7节所述进行β-己糖苷酶活性检测和组胺ELISA检测。按2.1.6.3步骤计算脱颗粒百分率。

结果

确定体外肥大细胞脱颗粒实验中 PECs 的最佳数量

肥大细胞（c-kit⁺·IgE⁺ 双阳性细胞）¹⁵ 仅占腹腔渗出细胞（PECs）的约 2%（图 1A）。我们假设 PECs 中的肥大细胞释放了 100% 的颗粒内容物，据此估算培养上清中可检测到的肥大细胞特异性分子的最大水平，并测定了用不同数量 PECs（分别为 2.5 × 10⁵、5 × 10⁵ 和 1 × 10⁶ 个细胞）制备的全细胞裂解液中 β-己糖胺酶¹⁶ 和组胺¹⁷ 的含量。如 图 1B 所示，即使使用 2.5 × 10⁵ 个 PECs 制备裂解液，也能检测到显著水平的 β-己糖胺酶和组胺，且随着用...

讨论

发现肥大细胞脱颗粒实验可以使用相对少量的粗制小鼠腹腔渗出细胞（PECs）进行具有重要意义。尽管PECs必须是原代小鼠肥大细胞的优良来源，但从小鼠PECs中纯化肥大细胞却具有挑战性。虽然密度梯度介质（如Percoll²⁵）已成功用于从大鼠PECs中纯化肥大细胞，但其在小鼠腹腔肥大细胞纯化中的应用受到限制，可能是因为大鼠和小鼠肥大细胞的密度不同。另一种梯度介质Histodenz²⁶也曾用于小鼠腹腔肥大细胞的纯化，但效果有限；其纯化结果似乎依赖于小鼠的条件（例如年龄）。即使是磁性细胞纯化系统等新型细胞分离系统，也仅能实现小鼠肥大细胞的部分纯化（作者未发表数据）。本文表明，进行肥大细胞脱颗粒实验时，无需对腹腔肥大细胞进行纯化。

粗制腹腔渗出细胞（PECs）中的肥大细胞可被IgE的同源抗原激活，这一结果令人鼓舞，为建立一种能够真实模拟体内脱颗粒事件的体外实验方法提供了希望。然而，除了肥大细胞外，嗜碱性粒细胞也表达FcεRI²⁷。因此，需要注意的是，P...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器		1757589701
1.5 mL 微量离心管	Hisol	MT-15003
10 mL 注射器		1757593161
15 mL 圆锥形离心管	Thermo Fisher scientific	14-959-53A
20xPBS	Tech & Innovation	BPB-9121-500mL
4-硝基苯基-N-乙酰-β-D-葡糖胺	SIGMA	N9376
5 mL 聚苯乙烯圆底试管	Life sciences	352003
50 mL 圆锥形离心管	Thermo Fisher scientific	14-959-49A
铝箔纸	BioFact	TS1-3330
抗小鼠 CD117(c-kit)	Biolegend	135129	保存于 2-8°C
抗小鼠 IgE 单克隆抗体	Thermo Fisher scientific	11-5992-81	保存于 2-8°C
抗 DNP-IgE 抗体	SIGMA	D8406-.2MG	保存于 -20°C
离心机	HANIL	396150
D-(+)-葡萄糖	SIGMA	G8270
地塞米松	SIGMA	D2915-100MG
DNP-BSA	Invitrogen	2079360	保存于 -20°C
EDTA	Biofact	PB131-500
胎牛血清	Thermo Fisher scientific	11455035
明胶	SIGMA	G1890
甘氨酸	JUNSEI	27185-0350
血细胞计数板	ZEISS	176045
HEPES	Thermo Fisher scientific	15630130
组胺 ELISA 试剂盒	Abcam	GK3275957-4	保存于 2-8°C
加热磁力搅拌器	Lab teach	zso-9001
异氟烷	Troikaa	I29159
富马酸酮替芬盐	SIGMA	K2628
MCPT-1 ELISA 试剂盒	Thermo Fisher scientific	88-7503-22	保存于 2-8°C
小鼠 Fc 封闭抗体	BD Biosciences	553141	保存于 2-8°C
碘化丙啶	SIGMA	81845	保存于 2-8°C
红细胞裂解缓冲液	Biolegend	420301
圆底 96 孔板	SPL-life sciences	30096
一次性注射器滤器	Startoriusag	16555
链霉亲和素磁珠	MilteryiBiotec	130-048-101	保存于 2-8°C
Triton X-100	JUNSEIchemical	49415-1601
TWEEN 20	SIGMA	9005-64-5
水浴锅	CHANGSHINSCIENCE	190107