方法文章

基于RNA-Seq的嘌呤核苷水解酶基因挖掘与序列分析

DOI：

10.3791/61561

⸱

2020年10月20日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Central Laboratory, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Hepatopathy, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种基于RNA-Seq的嘌呤核苷酶（PN，EC:3.2.2.1）基因挖掘与序列分析方法。采用ProtProm分析揭示PN独特的二级和三级结构。此外，从转录组中克隆PN基因，以验证RNA-Seq结果的可靠性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是最具价值的真菌类中药之一，含有丰富的活性成分，如腺苷。腺苷被认为是一种具有多种抗肿瘤和免疫调节活性的生物有效成分。为了进一步阐明嘌呤核苷酶（PN）在腺苷生物合成中的作用机制，本研究基于冬虫夏草的RNA-Seq数据库成功挖掘并分析了一个编码PN的基因。PN基因的全长cDNA为855 bp，编码284个氨基酸。BLAST分析显示其与NCBI中核苷水解酶的最高同源性为85.06%。ProtParam分析表明其相对分子量为30.69 kDa，等电点为11.55。利用Predict Protein预测PN的二级结构，结果显示α螺旋结构占28.17%，β折叠结构占11.97%，环状结构占59.86%。此外，从转录组中进一步克隆了PN基因，并通过琼脂糖凝胶电泳进行验证。本研究为真菌类中药中腺苷生物合成的遗传调控提供了更充分的科学依据和新思路。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

真菌类中药具有丰富的物种资源1,2。冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是一种著名的真菌类中药，被视为创新药物的重要来源3,4。冬虫夏草是虫体与真菌的复合体，发现于中国西南部的青藏高原，其中Hirsutella sinensis寄生于虫体之上5。目前，根据分子生物学和形态学证据，H. sinensis被报道为冬虫夏草唯一的无性型阶段6,7，与野生冬虫夏草相比，其毒性较低且具有相似的临床疗效8。研究表明，H. sinensis含有多种生物活性成分，如核苷类、多糖类和麦角甾醇类，具有广泛的药理作用，包括修复肝损伤等9,10,11。腺苷是从冬虫夏草中分离出的一种典型活性成分，属于嘌呤类生物碱

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：一种冬虫夏草（H. sinensis）的无性型菌株已保存于我实验室。Escherichia coli DH5 由北京中医药大学深圳医院保存。

1. RNA测序准备工作

  1. 菌丝体的收获
    1. 准备用于发酵冬虫夏草（H. sinensis）的发酵培养基：玉米粉（1%）、蚕蛹粉（1.5%）、酵母提取物（0.5%）、胰蛋白胨（1%）、葡萄糖（1.5%）、麦麸（1.5%）、糊精（0.5%）、KH2PO4（0.02%）和 MgSO4（0.01%）。
    2. 按10%比例接种扩大培养（每100 mL培养基中加入10 mL种子液）。在16 °C、150 rpm条件下于摇床中进行液体深层发酵，持续10天。
    3. 无性繁殖并培养冬虫夏草无性型菌丝体10天。将发酵液离心后弃去上清液，用100 mL超纯水重悬菌丝体并洗涤3次，每次均通过离心去除上清液。使用液氮将清洗后的菌丝体研磨成粉末。
  2. RNA-Seq
    1. 根据制造商说明书（材料表）提取冬虫夏草无性型的总RNA，并使用无RNase的DNase I进一步处理样品（材料表）。
    2. 使用PolyATtract ....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PN 基因的开放阅读框（ORF）序列为 855 bp，编码 284 个氨基酸，理论分子质量为 30.69 kDa，预测等电点为 11.55，表明 PN 是一种碱性蛋白。使用 SignalP4.0 服务器分析信号肽，结果显示 PN 不含信号肽。此外，BLASTP 搜索结果表明，来自冬虫夏草的 PN 与 Purpureocillium lilacinum（OAQ81830.1）的核苷水解酶具有最高的序列一致性（85.06%，E 值 = 1e-88）。进一步利用 ClustalX 程序对 PN 进行多序列比对，结果如图 1所示，显示第 11–166 位氨基酸为肌苷/尿苷水解酶结构域的保守氨基酸序列。随后，基于氨基酸序列相似性构建的系统发育树分析结果表明，冬虫夏草来源的 PN 与其他虫生真菌（如 Purpureocillium lilacinum，OAA82129.1、XP 018708456.1）的核苷水解酶具有最近的系统发育关系（图 2）。同时，Int.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人类健康正面临肿瘤、心血管和脑血管疾病等一系列重大医学问题26,27。由于中药具有丰富的物种资源以及多样化的活性成分结构与功能，已被视为创新药物研发的重要源泉28,29。冬虫夏草是一种寄生于鳞翅目昆虫幼虫上的真菌寄生物，在中国传统医学中被视为滋补佳品，与人参、鹿茸并列为最佳滋补药材之一30。多种活性成分如腺苷、甾醇、核苷、萜类和多肽均可从中药中提取29,31。这些活性成分具有多种生理活性和结构类型，可作为创新药物研究与应用的重要来源32。

迄今为止，关于腺苷药理作用的报道已有很多，但有关腺苷生物合成及其相关基因的研究却较少。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由国家自然科学基金（31871244、81973733、81803652）、广东省自然科学基金（2019A1515011555、2018A0303100007）、深圳市卫生和计划生育委员会基金（SZBC2018016）以及深圳市龙岗区经济与科技发展专项资金（LGKCYLWS2020064、LGKCYLWS2019000361）资助。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无RNase的DNase ITaKaRa2270B
PolyATtract mRNA分离系统PromegaIII
随机六聚体引物Thermo ScientificSO142
NEBNext1 Ultra RNA文库构建试剂盒NEBE7530S
PCR纯化试剂盒QiaQuick
琼脂糖TransGen BiotechGS201-01
高通量测序仪IlluminaHiSeq™ 4,000
LTF ViewerLTFV5.2
ORF程序NCBI
ProtParam工具SIB 瑞士生物信息学研究所
SignalP服务器DTU健康科技5.0
BLASTNCBI
Clustal X程序都柏林大学学院
MEGA进化医学与信息学中心4.0
InterProScan欧洲分子生物学实验室
Predict Protein慕尼黑工业大学
WISS-MODEL瑞士生物信息学研究所
Primer ExpressApplied Biosystems3.0
EcoRINEBR0101V
NotINEBER0591
pMD18-T载体TaKaRa6011
琼脂糖Sigma-AldrichGS201-01
Trans2K® Plus II DNA MarkerSigma-AldrichBM121-01
6×DNA上样缓冲液Sigma-AldrichGH101-01
GelStainSigma-AldrichGS101-02
50 x TAESigma-AldrichT1060
凝胶成像分析系统SyngeneG:BOX F3
E. coli JM109Promega
T4 DNA连接酶EarthOxBE004A-02
pPIC9KGenlociGP0983

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dong, C. J. The traditional Chinese medicine fungus Cordyceps and its biotechnological production. Research Journal of Biotechnology. 8, 1-2 (2013).
  2. Xia, E. H., et al. Th....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

RNA Seq BLAST
视频即将推出

相关文章