方法文章

基于RNA-Seq的嘌呤核苷水解酶基因挖掘与序列分析

DOI：

10.3791/61561

⸱

2020年10月20日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Central Laboratory, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Hepatopathy, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种基于RNA-Seq的嘌呤核苷酶（PN，EC:3.2.2.1）基因挖掘与序列分析方法。采用ProtProm分析揭示PN独特的二级和三级结构。此外，从转录组中克隆PN基因，以验证RNA-Seq结果的可靠性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是最具价值的真菌类中药之一，含有丰富的活性成分，如腺苷。腺苷被认为是一种具有多种抗肿瘤和免疫调节活性的生物有效成分。为了进一步阐明嘌呤核苷酶（PN）在腺苷生物合成中的作用机制，本研究基于冬虫夏草的RNA-Seq数据库成功挖掘并分析了一个编码PN的基因。PN基因的全长cDNA为855 bp，编码284个氨基酸。BLAST分析显示其与NCBI中核苷水解酶的最高同源性为85.06%。ProtParam分析表明其相对分子量为30.69 kDa，等电点为11.55。利用Predict Protein预测PN的二级结构，结果显示α螺旋结构占28.17%，β折叠结构占11.97%，环状结构占59.86%。此外，从转录组中进一步克隆了PN基因，并通过琼脂糖凝胶电泳进行验证。本研究为真菌类中药中腺苷生物合成的遗传调控提供了更充分的科学依据和新思路。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

真菌类中药具有丰富的物种资源1,2。冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是一种著名的真菌类中药，被视为创新药物的重要来源3,4。冬虫夏草是虫体与真菌的复合体，发现于中国西南部的青藏高原，其中Hirsutella sinensis寄生于虫体之上5。目前，根据分子生物学和形态学证据，H. sinensis被报道为冬虫夏草唯一的无性型阶段6,7，与野生冬虫夏草相比，其毒性较低且具有相似的临床疗效8。研究表明，H. sinensis含有多种生物活性成分，如核苷类、多糖类和麦角甾醇类，具有广泛的药理作用，包括修复肝损伤等9,10,11。腺苷是从冬虫夏草中分离出的一种典型活性成分，属于嘌呤类生物碱12。腺苷具有多种生物活性，包括抗肿瘤、抗菌和免疫调节作用13,14。然而，腺苷的生物合成机制及其关键基因至今仍不清楚15,16。

腺苷主要通过在肿瘤微环境中的免疫抑制作用发挥其抗肿瘤效应17。据报道，腺苷具有免疫抑制功能，这对于损伤后启动组织修复以及保护组织免受过度炎症反应至关重要18,19。此外，研究表明，腺苷介导的免疫抑制会严重损害机体对肿瘤的免疫监视功能，并促进肿瘤生长20。因此，深入研究腺苷生物合成机制对其在抗肿瘤领域的广泛应用具有迫切意义。

据报道，通过转录组的下一代测序可系统地对表达基因及其表达水平进行全面分析21。此外，转录组测序与分析已被用于预测参与活性成分生物合成途径的基因，并进一步探究不同生物合成途径之间的相互作用22。嘌呤核苷酶（PN，EC 3.2.2.1）是一类对嘌呤核苷具有底物特异性的核苷酶，能够将嘌呤核苷的糖苷键水解为糖和碱基23。该酶通常在腺苷生物合成中发挥重要作用。有研究报道，已预测真菌类中药中腺苷的生物合成途径；qPCR 和基因表达分析显示，腺苷积累量的增加是 PN 基因下调的结果，表明 PN 基因可能在腺苷生物合成中具有重要作用15。因此，亟需阐明 PN 在腺苷生物合成中的作用机制。然而，真菌类中药中 PN 及其他参与腺苷生物合成的关键基因的序列信息和蛋白质结构尚未得到深入研究。

本研究从冬虫夏草的RNA-Seq数据中挖掘出一个全新的PN基因序列，并通过基因克隆技术进行了验证。此外，对PN的分子特征和蛋白质结构进行了全面分析，可为腺苷生物合成的基因调控提供新的研究方向和思路。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：一种冬虫夏草（H. sinensis）的无性型菌株已保存于我实验室。Escherichia coli DH5 由北京中医药大学深圳医院保存。

1. RNA测序准备工作

  1. 菌丝体的收获
    1. 准备用于发酵冬虫夏草（H. sinensis）的发酵培养基：玉米粉（1%）、蚕蛹粉（1.5%）、酵母提取物（0.5%）、胰蛋白胨（1%）、葡萄糖（1.5%）、麦麸（1.5%）、糊精（0.5%）、KH2PO4（0.02%）和 MgSO4（0.01%）。
    2. 按10%比例接种扩大培养（每100 mL培养基中加入10 mL种子液）。在16 °C、150 rpm条件下于摇床中进行液体深层发酵，持续10天。
    3. 无性繁殖并培养冬虫夏草无性型菌丝体10天。将发酵液离心后弃去上清液，用100 mL超纯水重悬菌丝体并洗涤3次，每次均通过离心去除上清液。使用液氮将清洗后的菌丝体研磨成粉末。
  2. RNA-Seq
    1. 根据制造商说明书（材料表）提取冬虫夏草无性型的总RNA，并使用无RNase的DNase I进一步处理样品（材料表）。
    2. 使用PolyATtract mRNA分离系统从总RNA中分离mRNA，并根据制造商说明书（材料表）利用连接有寡聚(dT)的磁珠分离poly(A) mRNA。
    3. 以短片段为模板，根据制造商说明书（材料表），使用随机六聚体引物合成第一链cDNA。随后按照说明书进行第二链cDNA的合成。
    4. 接着，根据制造商说明书（材料表）使用Ultra RNA文库构建试剂盒构建测序文库。
    5. 根据制造商说明书（材料表）使用PCR纯化试剂盒纯化短片段，并分别用EB缓冲液溶解。
    6. 根据琼脂糖凝胶电泳结果，将短片段（阈值为300 bp）连接测序接头。
    7. 随后，以筛选出的合适片段作为模板，通过PCR进行扩增。
    8. 使用Illumina HiSeq 4000平台进行双端测序，具体操作依据制造商说明书。从原始序列数据中过滤低质量的原始读段以获得干净数据。采用denovo组装方法获得在两端均无法延伸且Ns数量最少的Unigene序列。
    9. 使用blastx将Unigene序列比对至nr、Swiss-Prot、KEGG和COG等蛋白数据库（e值 < 0.00001），获取与给定Unigene序列同源性最高的蛋白质及其功能注释信息。汇总RNA-Seq分析结果（材料表）。
      注：上述步骤中使用了商业试剂盒，所有操作均按照制造商说明书进行。

2. 嘌呤核苷水解酶的基因挖掘

  1. 在计算机上下载RNA-Seq结果文件。从RNA-Seq结果中找到拼接后Unigene的注释结果文件。
    注：使用成对末端测序（paired-end reads）对支架序列（scaffolds）进行再次填补缺口，以获得两端均无法延伸且含最少N碱基的序列。此类序列定义为Unigene。Unigene注释提供Unigene的表达信息及功能注释信息。
  2. 打开注释文件路径，在搜索栏中输入map 00230，然后在注释文件的KEGG分类中搜索嘌呤代谢通路（map00230）。
  3. 在注释的map00230图谱中将EC:3.2.2.1（PN）标记为红色，并指明已有拼接并注释至PN的Unigene。
    注：点击EC编号3.2.2.1后，在注释的map00230图谱中显示有三个Unigene（Unigene10777、Unigene14697和Unigene17827）被注释至PN。
  4. 点击EC编号3.2.2.1，显示其注释的Unigene信息。
  5. 打开LTFViewer软件，使用Ctrl-O快捷键导入Unigene.fa文件，显示拼接后Unigene的序列信息。
  6. 使用Ctrl-F快捷键搜索Unigene10777、Unigene14697和Unigene17827的序列信息。
  7. 使用Ctrl-C和Ctrl-V快捷键下载Unigene10777、Unigene14697和Unigene17827的序列信息。
  8. 剔除开放阅读框（ORF）序列过短的Unigene10777和Unigene17827。
    注：LTFViewer软件中显示了基本的序列信息。
  9. 选择ORF长度适宜的Unigene14697（大小为1,705 bp，gap为0 0%）用于进一步研究。

3. 生物信息学分析

  1. 使用 ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析 PN 基因的开放阅读框（ORF）。
    1. 将序列粘贴到输入框中，参数设置如下：最小 ORF 长度（nt）：75，遗传密码：1（标准），起始密码子：仅使用 ATG。点击 提交 按钮以获取 ORF 信息。
  2. 使用 ProtParam 工具（http://us.expasy.org/tools/protparam.html）计算理论分子质量与等电点。
    1. 将氨基酸序列（单字母编码）粘贴到输入框中，点击 计算参数 按钮以获取结果。
  3. 使用 SignalP5.0 服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测信号肽。
    1. 以 FASTA 格式输入蛋白质序列，参数设置如下：生物体类别：真核生物（Eukarya），输出格式：长格式输出。点击 提交 按钮以获取结果。
  4. 使用 BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析蛋白质序列的同源性。
    1. 点击 蛋白质 BLAST 按钮，将序列输入至输入框中，参数设置如下：数据库：非冗余蛋白质序列（nr），算法：blastp（蛋白质-蛋白质 BLAST）。点击 BLAST 按钮以获取结果。
  5. 使用 Clustal X 程序（http://www.clustal.org/）对不同真菌来源的 PN 氨基酸序列进行比对。
    1. 上传文件或将序列粘贴至输入框中，参数设置如下：输出格式：带字符计数的 ClustalW。点击 提交 按钮以获取结果。Clustal X 仅能识别 FASTA 格式的文件，且文件路径中只能包含英文名称。
  6. 使用 MEGA 4.0（https://www.megasoftware.net/mega4/）构建系统发育树。
    1. 打开软件，点击 文件 按钮上传序列，选择数据类型为 蛋白质序列，点击 确定 进入下一步。随后点击 系统发育 按钮，选择 Bootstrap 检验系统发育，然后点击 邻接法建树。选择默认参数，点击 计算 按钮以获取结果。
  7. 使用 InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）鉴定 PN 的催化结构域。
    1. 将序列输入至输入框中，选择默认参数，点击 搜索 按钮以获取结果。
  8. 使用 Predict Protein 在线工具（http://www.predictprotein.org/）预测蛋白质二级结构。
    1. 将氨基酸序列（单字母编码）输入至输入框中，然后点击 predictProtein 按钮以获取结果。
  9. 使用在线工具 SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）评估 PN 的三维结构24。
    1. 点击 开始建模 按钮，将目标序列粘贴至输入框中，填写 项目标题 和 电子邮件 信息，然后点击 搜索模板 按钮以获取结果。

4. 基因克隆与重组质粒的构建

  1. 设计引物，其中反向引物包含一个NotI位点，正向引物包含一个EcoRI位点。
  2. 使用Primer Express软件显示正向引物序列：AGAGAATTCATGACCATGCCAGATTCT（5’–3’），反向引物序列：ATAGCGGCCGCCTAACGCGTGCCGTTAGA（5’–3’）。
  3. 制备引物以及冬虫夏草cDNA，用于PN基因的克隆。进行PCR反应，程序如下：95 °C预变性5分钟，94 °C变性45秒，55 °C退火60秒，72 °C延伸90秒，共35个循环，最后72 °C延伸10分钟。
  4. 回收PCR产物，并通过琼脂糖凝胶电泳检测以验证。将PCR片段与pMD18-T载体连接。pMD18-T连接体系如下：1 μL pMD18-T，4 μL Solution1，5 μL目的基因。反应条件为：16 °C孵育16小时，65 °C灭活15分钟。
  5. 根据操作说明书25，将重组质粒转化至感受态E. coli JM109细胞中。
  6. 用EcoRI和NotI双酶切重组pMD18-T/PN质粒和载体ppic9K。经T4 DNA连接酶连接酶切后的片段。
  7. 构建重组质粒ppic9K/PN，用于后续异源表达。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PN 基因的开放阅读框（ORF）序列为 855 bp，编码 284 个氨基酸，理论分子质量为 30.69 kDa，预测等电点为 11.55，表明 PN 是一种碱性蛋白。使用 SignalP4.0 服务器分析信号肽，结果显示 PN 不含信号肽。此外，BLASTP 搜索结果表明，来自冬虫夏草的 PN 与 Purpureocillium lilacinum（OAQ81830.1）的核苷水解酶具有最高的序列一致性（85.06%，E 值 = 1e-88）。进一步利用 ClustalX 程序对 PN 进行多序列比对，结果如图 1所示，显示第 11–166 位氨基酸为肌苷/尿苷水解酶结构域的保守氨基酸序列。随后，基于氨基酸序列相似性构建的系统发育树分析结果表明，冬虫夏草来源的 PN 与其他虫生真菌（如 Purpureocillium lilacinum，OAA82129.1、XP 018708456.1）的核苷水解酶具有最近的系统发育关系（图 2）。同时，Int...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人类健康正面临肿瘤、心血管和脑血管疾病等一系列重大医学问题26,27。由于中药具有丰富的物种资源以及多样化的活性成分结构与功能，已被视为创新药物研发的重要源泉28,29。冬虫夏草是一种寄生于鳞翅目昆虫幼虫上的真菌寄生物，在中国传统医学中被视为滋补佳品，与人参、鹿茸并列为最佳滋补药材之一30。多种活性成分如腺苷、甾醇、核苷、萜类和多肽均可从中药中提取29,31。这些活性成分具有多种生理活性和结构类型，可作为创新药物研究与应用的重要来源32。

迄今为止，关于腺苷药理作用的报道已有很多，但有关腺苷生物合成及其相关基因的研究却较少。

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由国家自然科学基金（31871244、81973733、81803652）、广东省自然科学基金（2019A1515011555、2018A0303100007）、深圳市卫生和计划生育委员会基金（SZBC2018016）以及深圳市龙岗区经济与科技发展专项资金（LGKCYLWS2020064、LGKCYLWS2019000361）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无RNase的DNase ITaKaRa2270B
PolyATtract mRNA分离系统PromegaIII
随机六聚体引物Thermo ScientificSO142
NEBNext1 Ultra RNA文库构建试剂盒NEBE7530S
PCR纯化试剂盒QiaQuick
琼脂糖TransGen BiotechGS201-01
高通量测序仪IlluminaHiSeq™ 4,000
LTF ViewerLTFV5.2
ORF程序NCBI
ProtParam工具SIB 瑞士生物信息学研究所
SignalP服务器DTU健康科技5.0
BLASTNCBI
Clustal X程序都柏林大学学院
MEGA进化医学与信息学中心4.0
InterProScan欧洲分子生物学实验室
Predict Protein慕尼黑工业大学
WISS-MODEL瑞士生物信息学研究所
Primer ExpressApplied Biosystems3.0
EcoRINEBR0101V
NotINEBER0591
pMD18-T载体TaKaRa6011
琼脂糖Sigma-AldrichGS201-01
Trans2K® Plus II DNA MarkerSigma-AldrichBM121-01
6×DNA上样缓冲液Sigma-AldrichGH101-01
GelStainSigma-AldrichGS101-02
50 x TAESigma-AldrichT1060
凝胶成像分析系统SyngeneG:BOX F3
E. coli JM109Promega
T4 DNA连接酶EarthOxBE004A-02
pPIC9KGenlociGP0983

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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