本文介绍了一种精确采集胸导管淋巴细胞并利用延时摄影技术观察肠道趋向性淋巴细胞在大鼠派尔集合淋巴结中迁移过程的方法，观察时长为3小时。该技术可用于阐明在炎症条件下淋巴细胞动态行为的变化。
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本文内容
摘要
摘要
在生理条件下，初始淋巴细胞会从血液重新循环至淋巴组织，这一现象在肠道免疫中被认为具有重要意义。次级淋巴器官的基质，例如派尔集合淋巴结（Peyer’s patches, PPs）或肠系膜淋巴结，是初始淋巴细胞感知抗原的场所。初始淋巴细胞通过血液循环到达高内皮微静脉，由此进入PPs。据估计，某些免疫调节剂可能影响淋巴细胞的迁移，但对微循环动态进行精确评估非常困难，建立一种在体内观察淋巴细胞迁移的方法将有助于阐明其具体机制。我们优化了从淋巴管收集淋巴细胞的方法，并在大鼠PPs中观察了趋向肠道的淋巴细胞的详细动态。我们选用共聚焦激光扫描显微镜对大鼠PPs进行活体观察，并采用延时摄影技术进行记录。现在可以获得清晰的图像，有助于对淋巴细胞动态进行分析。
引言
派尔集合淋巴结（Peyer’s patches, PPs）由位于小肠黏膜下层的数百个淋巴滤泡组成。PPs 可分为滤泡区、滤泡间区以及位于滤泡下部的生发中心，在生发中心内淋巴细胞通过抗原呈递受到刺激。PPs 无传入淋巴管，抗原通过上皮细胞层从小肠腔侵入黏膜下层。覆盖淋巴滤泡的上皮区域称为滤泡相关上皮，其中分布有特化的微皱褶细胞（M细胞），可摄取黏膜抗原。M细胞从管腔侧摄取抗原后，抗原被树突状细胞捕获，并呈递给经高内皮微静脉（HEVs）内皮进入PPs的初始淋巴细胞1。PPs 在肠道免疫中发挥重要作用，并与炎症的早期阶段密切相关。许多分子相互作用参与淋巴细胞进入继发性淋巴器官（SLOs）的过程，包括黏附分子、趋化因子2,3以及鞘氨醇-1-磷酸4；因此，存在多种潜在的治疗靶点。因此，观察PPs内的淋巴细胞动态，有助于我们了解炎症的最初阶段，并评估多种有前景药物的有效性。
本文所述方法聚焦于派伊尔集合淋巴结（PPs）中淋巴细胞的迁移过程，包括若干操作步骤（胸导管插管5、收集淋巴细胞以及将细胞回输后进行长期观察）。由于这些操作较为复杂，且以往文献中难以准确了解每一步骤的具体实施方式，因此本文介绍了一些实现成功观察的关键技巧。例如，....
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方案
实验方案已获国防医学院动物研究委员会批准（编号：16058）。动物饲养采用标准实验室饲料（CLEA Japan Inc，东京，日本）。实验动物的处理遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）指南。
1. 淋巴细胞的收集与分离
注意：由于淋巴细胞必须保持新鲜，不能储存，因此每次实验都必须从大鼠体内新鲜采集。此外，肠道趋向性淋巴细胞必须直接从其循环经过的胸导管中收集。 所有操作应在6小时内完成，所有器械、手套和操作表面均需保持清洁。为了维持动物的生理稳定状态，实验中使用的所有生理盐水及其他液体均应保持温热。
- 将灌注管（直径1 mm）浸入热水（约80–90 °C）中软化后，弯成肝素曲线形状（曲率半径约5 mm），并提前数小时用胶带固定在塑料板上。
- 通过腹腔注射给予雄性Wistar大鼠（8–12周龄）混合麻醉剂（Midazolam 2 mg/kg、Domitor 0.15 mg/kg 和 Betulphar 2.5 mg/kg）进行麻醉，并使用电动剃毛器剃除腹部体毛。剃毛后彻底清除残留毛发，防止毛发进入腹腔。
- 通过夹趾法确认大鼠已达到手术所需稳定的麻醉深度后，使用手术剪从腹中线向左侧肋缘下区域做水平切口。操作时需在光照下观察壁层腹膜中的血管，避免损伤。
- 用湿润纱布包裹胃部，并轻柔地将胃向右侧体外....
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结果
从淋巴液中收集淋巴细胞
为进行胸导管插管，需在紧张的胸导管上做切口，如图1所示，然后将大鼠置于Bollman笼中，如图2所示。
当淋巴细胞收集充分时，可获得约 20 mL/6 h 的淋巴液，其中含有约 107～108/mL 淋巴细胞。在胸导管淋巴细胞（TDLs）中，70% 表达 CD4，其中约 90% 的细胞表达 CD62L，表明 TDLs 的主要成分（>60%）为初始型肠道趋向性淋巴细胞。由于此处收集的淋巴细胞是特异性迁移至肠道的细胞，因此适用于评估派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches）中的迁移状态。
显微观察
注射适量荧光标记的淋巴细胞后，将受体大鼠的肠道如图3所示置于载玻片上。生理状态下派伊尔结（Peyer.......
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讨论
本文描述了一种收集 naïve 肠道趋向性淋巴细胞并观察其在大鼠派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）中迁移的实验方案。这些方法能够揭示淋巴细胞在PP微血管系统中的运动方式，并可实现对正常状态或药物干预条件下其动态行为的直观比较。尽管观察时间仅限于数小时内，但对这些动态过程的直接观察对于获得某些药物免疫调节作用的线索具有重要意义。
我们在方法部分提到了一些技巧。其中，最精细的操作之一是操作者必须快速而准确地插管胸导管。如果手术耗时过长或造成不必要的损伤，将导致明显出血和炎症，进而因结缔组织水肿和胸导管阻塞而减少胸导管淋巴液（TDL）的收集量。过去，我们通常使用剪切刃较小的剪刀在胸导管上做一小切口后再进行插管。然而，该操作会因淋巴液流出而干扰插管部位。因此，目前我们不再切开胸导管，而是用锐利的刀尖直接刺入。此方法使插管更简便，并提高了成功率。此外，胸导管上的切口位置非常关键，因为腹腔空间有限。若切口位置过于靠近膈肌，则插管的弯曲部分容易与膈肌发生碰撞；若切口位置距离膈肌过远，又会因尾侧胸导管的淋巴丛而难以将插管插入足够深度以确保固定。即使插管成功，插管也容易因纤.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了日本国立国防医学院的资助，以及日本厚生劳动省难治性疾病研究项目的研究经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| A1R+ | Nikon | 共聚焦激光扫描显微镜 | |
| 羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯 | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| 异氟烷 | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 培养基 | GIBCO | 11875093 | |
| Texas Red–葡聚糖 | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
参考文献
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-....
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